趙起超，薛 佳，張國(guó)中

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193 ； 2.詩(shī)華諾康科技發(fā)展(北京)有限公司，北京朝陽(yáng)100016)

雞傳染性法氏囊病(IBD)是由雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的一種主要危害雛雞和青年雞的烈性、高度接觸性傳染病[1]。感染雞的典型剖檢變化是法氏囊出現(xiàn)水腫、膠胨樣滲出、出血、壞死和萎縮等病變，早期感染通常會(huì)引起嚴(yán)重的免疫抑制[2]。IBDV分為經(jīng)典株、超強(qiáng)毒株(vvIBDV)和變異株[3]。vvIBDV能夠造成比經(jīng)典株更嚴(yán)重的病變和更高的死亡率[4]。IBDV變異株引起的臨床癥狀和死亡率則相對(duì)較低[5]。在我國(guó)vvIBDV和IBDV變異株普遍存在[6]。

利用IBD滅活苗免疫種雞可以為雛雞提供更高、更均勻的母源抗體，從而保護(hù)雛雞免受IBDV早期感染[7]。但高滴度的母源抗體會(huì)影響IBD常規(guī)活疫苗的免疫效果，因此商品肉雞免疫IBD常規(guī)活疫苗的時(shí)間通常在12日齡以后。IBD抗原抗體復(fù)合物疫苗可以免受雛雞母源抗體的影響，用于有母源抗體的1日齡雛雞或18胚齡雞胚免疫[8]。目前這種疫苗已經(jīng)在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用。含大腸桿菌表達(dá)的IBDV VP2的滅活疫苗[9-10]，例如新城疫、禽流感(H9亞型)、傳染性法氏囊病三聯(lián)滅活疫苗，其產(chǎn)品標(biāo)簽和說(shuō)明書(shū)上并未標(biāo)注可用于1日齡免疫。但在田間，由于孵化廳免疫的普及和人工成本的壓力，很多雞場(chǎng)正在嘗試采用1日齡免疫1次IBDV VP2蛋白滅活疫苗的方式預(yù)防IBD，其效果未知。

本試驗(yàn)將IBD抗原抗體復(fù)合物疫苗(囊胚寶)和含IBDV VP2蛋白的亞單位滅活疫苗-新城疫(ND)、禽流感(AI-H9)、IBD三聯(lián)滅活疫苗(新流法)免疫1日齡商品肉雞，通過(guò)抗體檢測(cè)和對(duì)IBDV超強(qiáng)毒株(vvIBDV)的攻毒試驗(yàn)比較了兩種疫苗的免疫保護(hù)效果，為肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)選擇法氏囊疫苗提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試疫苗 雞傳染性法氏囊病復(fù)合凍干活疫苗(W2512 G-61株)：簡(jiǎn)稱“囊胚寶”，由某國(guó)外公司生產(chǎn)；ND+AI(H9)+IBD-VP2三聯(lián)滅活疫苗：簡(jiǎn)稱“新流法”，市場(chǎng)購(gòu)買；ND+AI(H9)二聯(lián)滅活疫苗：簡(jiǎn)稱“新流”，由國(guó)內(nèi)某公司生產(chǎn)。

1.2 攻毒毒株 IBDV超強(qiáng)毒株(vvIBDV)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽疫病診斷研究中心提供。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 1日齡白羽商品肉雞70只，購(gòu)自江蘇八達(dá)畜禽有限公司。

1.4 試劑盒 IBDV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒：簡(jiǎn)稱“經(jīng)典型試劑盒”，為IDEXX產(chǎn)品，購(gòu)自北京愛(ài)德士元亨生物科技有限公司；IBDV-VP2抗體ELISA檢測(cè)試劑盒：簡(jiǎn)稱“VP2專用試劑盒”，為Symbiotic產(chǎn)品，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽疫病診斷研究中心提供。

1.5 隔離器 由浙江詩(shī)華諾倍威生物技術(shù)有限公司提供。

1.6 PCR/RFLP/測(cè)序 由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽疫病診斷研究中心完成。

1.7 攻毒用毒株的繁殖復(fù)壯和BID50測(cè)定 將IBDV超強(qiáng)毒以點(diǎn)眼的方式感染4周齡SPF雞，72 h后剖雞觀察法氏囊病變，檢測(cè)其BID50。

1.8 攻毒保護(hù)試驗(yàn)

1.8.1 試驗(yàn)分組 將10只1日齡商品肉雞采血后淘汰。剩余60只雞隨機(jī)分為6組，每組10只。A1、A2組每只雞1日齡頸部皮下注射免疫“新流法”滅活疫苗0.15 mL；B1、B2組每只雞1日齡頸部皮下注射免疫“囊胚寶”1羽份、新流滅活疫苗0.15 mL；C1、C2組為空白對(duì)照組不免疫。A1+A2、B1+B2、C1+C2三個(gè)組合的雞分別飼養(yǎng)于3個(gè)不同的隔離器中。于28日齡時(shí)將A1、B1、C1三組雞分別移至單獨(dú)的隔離器中進(jìn)行攻毒。剩余的A2、B2、C2組繼續(xù)飼養(yǎng)至42日齡。

1.8.2 IBD抗體檢測(cè) 分別利用經(jīng)典型和VP2專用試劑盒檢測(cè)。檢測(cè)1日齡、22日齡、28日齡、35日齡和42日齡雞IBDV-ELISA抗體。在統(tǒng)計(jì)抗體結(jié)果時(shí)，22、28日齡A1和A2組免疫背景相同，合并計(jì)為A組；B1和B2組免疫背景相同，合并計(jì)為B組；C1和C2組免疫背景相同，合并計(jì)為C組。同時(shí)為方便表達(dá)，在35、42日齡時(shí)A2、B2、C2組也分別簡(jiǎn)化表示為A、B、C組。

1.8.3 攻毒保護(hù)試驗(yàn) 于28日齡時(shí)利用vvIBDV以點(diǎn)眼的方式對(duì)A1、B1、C1組雞進(jìn)行攻毒，攻毒劑量為103BID50/只。攻毒后第4天對(duì)攻毒雞只進(jìn)行剖檢，記錄剖檢變化；利用RT-PCR方法檢測(cè)法氏囊內(nèi)是否存在IBDV，通過(guò)酶切鑒定(RFLP)確定存在于法氏囊內(nèi)的病毒是否為W2512株，對(duì)存在非W2512株的法氏囊樣品進(jìn)行IBDV測(cè)序以確定其是否為攻毒所使用的vvIBDV。

1.8.4 體重變化 于28日齡和32日齡時(shí)對(duì)A1、B1、C1組逐只稱重，比較增重變化。試驗(yàn)分組與處理情況見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)分組及處理情況

-：不作處理； /：已無(wú)存活雞

1.9 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用EXCEL和GraphPad Prism 6.01軟件對(duì)血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析和檢驗(yàn)，**P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 攻毒毒株的繁殖復(fù)壯和BID50測(cè)定 將IBDV超強(qiáng)毒株(vvIBDV)以點(diǎn)眼途徑感染4周齡SPF雞，72 h后，感染雞法氏囊出現(xiàn)典型病變，表現(xiàn)為法氏囊周圍有黃色膠胨狀滲出物，如圖1所示，計(jì)算病毒含量為104.80BID50/0.2mL。

圖1 vvIBDV感染雞法氏囊有黃色膠胨狀滲出物

2.2 血清ELISA抗體測(cè)定

2.2.1 母源抗體檢測(cè) 免疫前隨機(jī)取1日齡試驗(yàn)雞10只采血分離血清，分別用經(jīng)典型和VP2專用試劑盒檢測(cè)其母源抗體水平，結(jié)果顯示，雞群存在高且均勻的母源抗體，見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)雞IBD母源抗體ELISA檢測(cè)結(jié)果

注：經(jīng)典型試劑盒抗體效價(jià)≥396為陽(yáng)性，VP2專用試劑盒抗體效價(jià)≥999為陽(yáng)性

2.2.2 免疫后IBD抗體幾何平均值(GMT)比較 利用經(jīng)典型試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，在22日齡和28日齡，各組雞的IBD抗體水平無(wú)明顯差異，在35日齡和42日齡，B組(囊胚寶組)的抗體水平明顯高于A組(新流法組)和C組(未免疫組)(**P<0.01)，A組(新流法組)與C組(未免疫組)之間無(wú)差異，見(jiàn)圖2。

圖2使用經(jīng)典型試劑盒檢測(cè)IBDV抗體的結(jié)果

利用VP2專用試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，在22日齡時(shí)，C組(未免疫組)的抗體水平明顯高于A組(新流法組)和B組(囊胚寶組)(**P<0.01)；在28日齡時(shí)，A組(新流法組)的抗體水平和C組(未免疫組)相當(dāng)，明顯高于B組(囊胚寶組)(**P<0.01)；在35日齡時(shí)B組(囊胚寶組)的抗體水平明顯高于A組(新流法組)后者又明顯高于C組(未免疫組)(**P<0.01)；在42日齡時(shí)，仍然是B組(囊胚寶組)抗體水平最高，但是和A組(新流法組)差異不明顯，兩者皆明顯高于C組(未免疫組)(**P<0.01)，見(jiàn)圖3。

圖3使用VP2專用試劑盒檢測(cè)IBDV-VP2抗體的結(jié)果

2.2.3 攻毒后的法氏囊病變觀察 攻毒后第4天進(jìn)行剖檢，結(jié)果可見(jiàn)A1組(新流法組)和C1組(未免疫組)法氏囊均出現(xiàn)大量纖維素樣滲出，法氏囊顏色變黃；而B(niǎo)1組(囊胚寶組)法氏囊大小均勻，無(wú)明顯滲出。

2.2.4 PCR檢測(cè)和毒株鑒定結(jié)果 PCR/RFLP與測(cè)序結(jié)果顯示，攻毒后第4天(32日齡)時(shí)A1組(新流法組)法氏囊9/10呈vvIBDV陽(yáng)性；B1組(囊胚寶組)法氏囊10/10呈IBD W2512疫苗株陽(yáng)性，同時(shí)未檢測(cè)到其他IBDV；C1組(未免疫組)法氏囊10/10呈vvIBDV陽(yáng)性，見(jiàn)表3。

表3 各攻毒組法氏囊PCR與測(cè)序檢測(cè)結(jié)果

2.2.5 體重變化比較 分別于攻毒前和攻毒后 4 d 稱重，結(jié)果顯示，A1組(新流法組)和C1組(未免疫組)在攻毒后的增重差異不顯著，兩者皆明顯低于B1組(囊胚寶組)，統(tǒng)計(jì)學(xué)(t檢驗(yàn))結(jié)果顯示，兩者之間的差異極顯著，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各攻毒組攻毒后4 d內(nèi)的增重比較

**：顯著性分析結(jié)果P<0.01，兩組之間的差異極顯著

3 討論

在比較試驗(yàn)雞群IBD抗體時(shí)，使用經(jīng)典型試劑盒和VP2專用試劑盒的檢測(cè)結(jié)果存在明顯的差異。在檢測(cè)35日齡和42日齡抗體時(shí)，使用經(jīng)典型試劑盒檢測(cè)新流法疫苗免疫組的抗體水平與未免疫組無(wú)明顯差異。而使用VP2專用試劑盒檢測(cè)時(shí)，新流法疫苗免疫組的抗體水平明顯高于未免疫組。這可能與試驗(yàn)用的新流法疫苗僅含IBDV-VP2蛋白，不產(chǎn)生針對(duì)IBDV其他蛋白的抗體有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，有抗體的1日齡商品肉雞免疫新流法疫苗后，使用經(jīng)典型試劑盒檢測(cè)出的抗體水平很低，22日齡后抗體平均滴度最高為461，若在田間檢測(cè)結(jié)果遠(yuǎn)高于此可能意味著存在野毒感染。

一般白羽肉雞對(duì)IBDV最易感的周齡為3～4周齡，所以本試驗(yàn)攻毒的時(shí)間確定為28日齡，保護(hù)力的高低直接反映疫苗早期的免疫效力。囊胚寶免疫組雞群28日齡時(shí)的抗體水平較低，VP2專用試劑盒檢測(cè)結(jié)果甚至低于新流法免疫組和對(duì)照組。但是攻毒保護(hù)結(jié)果顯示，在該日齡對(duì)vvIBDV的保護(hù)力為100%，在雞的法氏囊中全部并且僅檢測(cè)到W2512疫苗毒。這說(shuō)明盡管此時(shí)免疫雞尚未產(chǎn)生較高的抗體，但通過(guò)W2512株在法氏囊占位、細(xì)胞免疫等效應(yīng)產(chǎn)生了理想的保護(hù)力。在28日齡時(shí)，使用VP2專用試劑盒的檢測(cè)新流法疫苗免疫組的抗體水平平均值為1 560，明顯高于囊胚寶組。但攻毒保護(hù)結(jié)果顯示，此時(shí)新流法疫苗免疫組對(duì)vvIBDV的保護(hù)力只有10%。也就是說(shuō)使用新流法疫苗免疫的雞群，盡管通過(guò)VP2專用試劑盒檢測(cè)到1 560的平均抗體，但該水平的抗體對(duì)攻毒沒(méi)有提供有效的保護(hù)，所以不能把VP2抗體陽(yáng)性和保護(hù)力直接等同起來(lái)。在本試驗(yàn)中，對(duì)攻毒后4 d的增重進(jìn)行了評(píng)估，新流法疫苗組增重和未免疫攻毒組沒(méi)有顯著差異，但和囊胚寶組增重有顯著差異，再次充分說(shuō)明囊胚寶疫苗免疫可以有效保護(hù)雞只，而該新流法疫苗未能提供有效保護(hù)。

目前田間有一些商品肉雞群在1日齡免疫新流法滅活疫苗，此外不再免疫其他任何IBD疫苗。目前確實(shí)沒(méi)有發(fā)生大面積的IBD，這和我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室研究的結(jié)果有些不符，解釋這種現(xiàn)象的合理性可能有兩種：(1)得益于良好的生物安全措施和長(zhǎng)期使用優(yōu)質(zhì)IBD疫苗，場(chǎng)內(nèi)沒(méi)有vvIBDV存在；(2)場(chǎng)內(nèi)存在以前免疫的IBD活疫苗的疫苗毒或其他IBD弱毒，起到了加強(qiáng)免疫的作用。

4 結(jié)論

用于1日齡有母源抗體雞的免疫時(shí)，在試驗(yàn)中應(yīng)用的新流法疫苗對(duì)vvIBDV的保護(hù)力不理想，通過(guò)1日齡免疫本試驗(yàn)中所用的新流法滅活疫苗來(lái)預(yù)防IBD存在很大風(fēng)險(xiǎn)。