陳巧真，孫敏

（山東省濟(jì)寧市傳染病醫(yī)院肝病科，山東 濟(jì)寧 272031）

病毒性肝炎、艾滋病等病毒性疾病是嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題，也是孕婦黃疸和妊娠并發(fā)癥的常見原因［1］。此外，受感染的母親可以將病毒傳染給胎兒或新生兒，這可能增加疾病負(fù)擔(dān)并且降低生活質(zhì)量。孕婦接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法可以迅速和完全抑制母體病毒的RNA水平，以防止病毒通過母嬰傳播給胎兒和新生兒，并可以維持產(chǎn)婦的健康［2-4］。

核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑替諾福韋，因其良好的有效性和安全性，多年來已成為病毒感染者最常用的抗病毒藥物之一［5］。然而到目前為止，還沒有關(guān)于孕中期大鼠應(yīng)用替諾福韋對(duì)子代鼠認(rèn)知功能影響的相關(guān)報(bào)道。認(rèn)知功能障礙的發(fā)生可能是由于神經(jīng)發(fā)生過程受到抑制。孕中期胎鼠的腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量較多，暴露于藥物下很可能引起神經(jīng)干細(xì)胞的損傷，藥物可能通過參與調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖來影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育［6-8］。Wnt信號(hào)通路被激活后，可以抑制GSK-3β的活性，使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量積累，從而促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖［9］。因此，本研究的目的是研究替諾福韋作用孕中期大鼠后對(duì)子代鼠認(rèn)知功能以及Wnt信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物模型的建立：將24只Wistar大鼠 （山東省濟(jì)寧市傳染病醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供） 按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分成3組，每組8只。在大鼠妊娠12～21 d時(shí)給予處置。對(duì)照組給予生理鹽水肌注10 d，低濃度替諾福韋組按照2.25 mg·kg-1·d-1注射替諾福韋，高濃度替諾福韋組按照4.5 mg·kg-1·d-1注射替諾福韋。實(shí)驗(yàn)經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)同意，實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物處理符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑：替諾福韋 （石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司） ，戊巴比妥鈉 （上海西唐生物公司） ，生理鹽水、RIPA、Trizol、氯仿、異丙醇、乙醇 （國(guó)藥制藥） 。GSK-3β、β-catenin、nestin和GAPDH抗體 （美國(guó)Santa公司） ，二抗 （北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司） 。引物合成于金斯瑞生物公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR試劑盒 （日本TaKaRa公司）。

1.2 方法

1.2.1 血?dú)夥治觯喝焉锏?2天，取大鼠動(dòng)脈血做血?dú)夥治觥?/p>

1.2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：子代鼠出生4周后，從每只孕鼠的子代鼠中隨機(jī)取出4只雄鼠，進(jìn)行水迷宮測(cè)試。測(cè)試期間需保持實(shí)驗(yàn)室內(nèi)燈光昏暗、環(huán)境安靜、杜絕帶入食物及飲料，以避免氣味對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾作用。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)間均為上午8：00，每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將大鼠擦干放回籠子，注意保暖。測(cè)試包括定位航行測(cè)試以及空間探索測(cè)試。

定位航行測(cè)試：分5 d進(jìn)行，每日每只大鼠進(jìn)行4輪測(cè)試，每輪測(cè)試時(shí)間設(shè)定為90 s，每輪測(cè)試間隔不小于30 min，以保證大鼠有充分的休息。每只大鼠隨機(jī)從每個(gè)象限的中點(diǎn)面壁投放入水桶，分析軟件自動(dòng)記錄大鼠自投放入水到找到平臺(tái)并逗留于平臺(tái)上的時(shí)間，即逃避潛伏期。如果大鼠在規(guī)定的90 s內(nèi)找不到平臺(tái)，計(jì)算機(jī)自動(dòng)停止記錄，測(cè)試者將大鼠輕柔地引導(dǎo)至平臺(tái)，保證大鼠在平臺(tái)上停留30 s。

空間探索測(cè)試：第5天完成定位航行實(shí)驗(yàn)后，移去水下平臺(tái)，選定和原平臺(tái)區(qū)域?qū)?yīng)的象限中點(diǎn)為入水點(diǎn)，將大鼠面壁投放入水桶，分析系統(tǒng)自動(dòng)記錄90 s內(nèi)大鼠穿越原平臺(tái)所在區(qū)域的次數(shù)。

1.2.3 Western blotting：子代鼠出生4周后，頸椎脫位法處死子代鼠，取海馬組織0.1 g，加大約10倍濕重的RIPA裂解緩沖液，粉碎勻漿后，冰上裂解30 min，低溫高速離心，保留上清。定量后每個(gè)樣本取10 μg進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺膠電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜3次、一抗孵育4 ℃過夜、洗膜后二抗室溫震蕩孵育2 h，TBST洗膜后ECL發(fā)光。

1.2.4 實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)：子代鼠出生4周后，頸椎脫位法處死子代鼠，取海馬組織0.1 g，加入1 mL Trizol裂解液裂解后，分別通過氯仿、異丙醇、乙醇等處理提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)，所用引物為GSK-3β，正義鏈5’-CCTTAACCTGGTGCTGGACT-3’，反義鏈 5’-AGCTCTGGTGCCCTGTAGTA-3’； β-catenin，正義鏈5’-CTACTTGTTCTGAGTGAA-3’，反義鏈5’-TG GAACCAGACAGAAAAGC-3’；nestin，正義鏈5’-GC CCTGACCACTCCAGTTTA-3’，反義鏈5’-GGAGTCC TGGATTTCCTTCC-3’；GAPDH，正義鏈5’- AGAAGG CTGGGGCTCATTTG-3’，反義鏈 5’-AGGGGCCATCC ACAGTCTTC-3’。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 替諾福韋對(duì)孕鼠及子代大鼠體質(zhì)量的影響

各組孕鼠在孕期第22天進(jìn)行頸內(nèi)動(dòng)脈抽血監(jiān)測(cè)血?dú)夥治觯Y(jié)果發(fā)現(xiàn)，低濃度替諾福韋組、高濃度替諾福韋組與對(duì)照組相比，pH、pO2、pCO2無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。對(duì)照組、低濃度替諾福韋組、高濃度替諾福韋組新生大鼠體質(zhì)量分別為 （23.31±2.98） 、（24.32±1.61） 、 （25.01±1.23） g，低濃度替諾福韋組、高濃度替諾福韋組與對(duì)照組相比，體質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 替諾福韋對(duì)子代大鼠認(rèn)知功能的影響

定位航行測(cè)試結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，低濃度替諾福韋組子代大鼠各時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期時(shí)間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＞ 0.05） ，而高濃度替諾福韋組子代大鼠逃避潛伏期較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)，到達(dá)平臺(tái)前路程明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） ，見表2。

表1 各組血?dú)夥治鼋Y(jié)果 （n = 8）Tab.1 Results of blood gas analysis in different groups （n = 8）

空間探索測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，低濃度替諾福韋組子代大鼠平臺(tái)穿越次數(shù)以及停留時(shí)間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＞ 0.05） ，而高濃度替諾福韋組子代大鼠平臺(tái)穿越次數(shù)及時(shí)間明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） ，見表2。

表2 替諾福韋對(duì)逃避潛伏期、平臺(tái)穿越次數(shù)及停留時(shí)間的影響Tab.2 Effect of tenofovir on escape latency，platform crossing times and residence time

2.3 替諾福韋對(duì)子代大鼠Wnt通路蛋白的影響

Wnt通路可以影響神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，也是與學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)的通路。本研究應(yīng)用Western blotting和 實(shí) 時(shí)PCR檢 測(cè)GSK-3β、β-catenin及nestin蛋白和mRNA水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低濃度替諾福韋組子代大鼠海馬組織內(nèi)GSK-3β、β-catenin及nestin含量與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＞ 0.05） ，高濃度替諾福韋組子代大鼠海馬組織內(nèi)GSK-3β含量明顯高于對(duì)照組和低濃度替諾福韋組，β-catenin及nestin含量明顯低于對(duì)照組和低濃度替諾福韋組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。見圖1。

3 討論

母嬰傳播是各種病毒性疾病 （乙型肝炎、人類免疫缺陷病毒等） 患者或者病毒攜帶狀態(tài)的母親將病毒傳播給嬰兒的傳播方式。有統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)指出，我國(guó)人群中有近50%的HBsAg攜帶者可能是由母嬰傳播所致［8］。母嬰傳播分為3個(gè)階段：宮內(nèi)傳播，懷孕時(shí)母體血液中的病毒經(jīng)胎盤傳遞給嬰兒；產(chǎn)程傳播，分娩時(shí)、嬰兒出生過程中皮膚損傷或病毒通過破裂胎盤傳遞給嬰兒以及分娩后母親與胎兒親密接觸傳播；哺乳傳播。各種核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶 （西多福韋、阿德福韋、替諾福韋等） 的應(yīng)用可以在備孕期及孕期降低病毒的含量，減少病毒母嬰傳播的機(jī)會(huì)［9］。

圖1 替諾福韋作用后GSK-3β、β-catenin及nestin蛋白和mRNA的表達(dá)水平Fig.1 Protein and mRNA expressions of GSK-3β，β-catenin，and nestin after treatment with tenofovir

替諾福韋是指南推薦的備孕期及孕期的抗病毒治療的藥物。使用替諾福韋可以大大地降低體內(nèi)病毒量，使得宮內(nèi)感染的可能性下降。研究［10-12］指出，替諾福韋的生物安全性高，肝腎毒性較小，但是目前國(guó)內(nèi)針對(duì)替諾福韋在孕期應(yīng)用安全性的研究較少。

有研究指出，孕鼠長(zhǎng)期使用2.25 mg·kg-1·d-1的替諾福韋并不會(huì)影響母體及子代鼠P糖蛋白和乳腺癌耐藥蛋白等的表達(dá)，即其在孕期的應(yīng)用相對(duì)安全。但是也有研究［13］指出替諾福韋會(huì)增加胎盤與子代鼠體質(zhì)量的比值，可能會(huì)對(duì)子代鼠的健康情況造成影響。一項(xiàng)對(duì)17例HIV感染孕婦應(yīng)用替諾福韋進(jìn)行的調(diào)查研究［14］發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用12周替諾福韋可以在一定程度上改善患者的認(rèn)知能力和神經(jīng)心理測(cè)驗(yàn)評(píng)估分?jǐn)?shù)。在美國(guó)，一項(xiàng)有230名參與者的雙盲研究［15］結(jié)果也指出，替諾福韋的應(yīng)用可以在不損傷患者神經(jīng)功能、不影響患者認(rèn)知能力的前提下，降低病毒的含量，減少病毒帶來的損傷。

本研究是首次在體應(yīng)用孕-胎鼠模型，觀察孕中期相關(guān)劑量的替諾福韋暴露對(duì)子代鼠學(xué)習(xí)記憶功能以及神經(jīng)干細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路的影響。本研究結(jié)果顯示，孕中期接受低濃度替諾福韋并不會(huì)損害子代鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。但在孕中期接受高濃度替諾福韋則明顯影響子代鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，表現(xiàn)為水迷宮實(shí)驗(yàn)中潛伏期延長(zhǎng)、平臺(tái)活動(dòng)時(shí)間以及穿越平臺(tái)次數(shù)減少。

許多研究［15］提示，齒狀回神經(jīng)的發(fā)生在海馬相關(guān)學(xué)習(xí)記憶形成中至關(guān)重要。Wnt信號(hào)通路在發(fā)育期神經(jīng)發(fā)生過程中扮演重要角色。β-catenin是Wnt信號(hào)通路的核心分子，在Wnt信號(hào)通路中處于中心位置。GSK-3β在整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中都有表達(dá)，特別在海馬表達(dá)水平更高［16］。GSK-3β可磷酸化β-catenin，介導(dǎo)β-catenin的降解。Wnt信號(hào)通路被激活后，可以抑制GSK-3β的活性，使胞內(nèi)β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量積累，從而促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。Wnt通路的激活也可以促進(jìn)nestin蛋白這一神經(jīng)干細(xì)胞特征性標(biāo)志物的表達(dá)［17］。

本研究發(fā)現(xiàn)高濃度替諾福韋可以影響子代鼠的認(rèn)知功能后，對(duì)Wnt通路的相關(guān)蛋白進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)孕期高濃度的替諾福韋很可能引起了子代鼠腦內(nèi)GSK-3β水平升高，β-catenin水平降低，進(jìn)而通過抑制Wnt/β-catenin通路抑制了神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，抑制了nestin的表達(dá)，從而損害了子代鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。

雖然本研究對(duì)機(jī)制的探討較為淺顯，需要進(jìn)一步的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)或者細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，但是仍然在一定程度上證明高濃度的替諾福韋可以抑制子代鼠的認(rèn)知功能。

綜上所述，低濃度替諾福韋使用較為安全，但是高濃度的替諾福韋可以通過影響Wnt信號(hào)通路的激活抑制子代大鼠的認(rèn)知功能。