劉文敏， 張曉娜， 魏朋浩， 汝少國

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003)

近年來，雙酚S(BPS)由于具有優(yōu)良的耐熱、耐光和抗氧化性能[1]，替代了雙酚A廣泛用于食品包裝材料、食品罐內(nèi)襯、奶瓶和紙制品等的生產(chǎn)中[2]，并已經(jīng)由各種途徑釋放到環(huán)境中，Yamazaki等[3]發(fā)現(xiàn)BPS在中國珠江、印度Buckingham Canal和Adyar River中的含量分別為0.135、1.08和6.84 μg/L；Liao和Kannan[4]在美國奧爾巴尼的多種食物樣品中均檢測到了BPS，BPS污染水平在逐年加重[5]。已有的研究發(fā)現(xiàn)BPS較BPA不易降解、易累積[6]，具有生殖毒性和內(nèi)分泌毒性[7-9]，且BPS發(fā)揮著雌激素效應(yīng)[7-8]。許多研究表明眼科疾病與雌激素水平變化有關(guān)[10-11]，有懷孕史或正懷孕的女性雌激素水平高于未懷孕女性，更容易產(chǎn)生視網(wǎng)膜疾病[12]。已有研究表明，多氯聯(lián)苯PCB1254[13]、苯并a芘(BaP)[14]和多溴聯(lián)苯醚DE-71[15]等具有雌激素效應(yīng)的環(huán)境污染物均能夠損傷斑馬魚的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致魚類的視覺障礙。然而，BPS是否會造成雌性動物視覺毒性目前尚未見報道。

眼睛發(fā)育在脊椎動物中比較保守[16]，斑馬魚的視覺系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與人類的非常相似[17]，斑馬魚視覺系統(tǒng)比較發(fā)達(dá)，視覺發(fā)育迅速，成魚具有明顯的晝夜節(jié)律，對光反應(yīng)強(qiáng)烈，是研究視覺的重要模式生物[18]。眼動反應(yīng)(Optokinetic response, OKR)和視動反應(yīng)(Optomotor response, OMR)是評估視覺功能的簡單、有效指標(biāo)[19]。OKR依賴于成熟的、功能性的視網(wǎng)膜[20]。OMR與視桿細(xì)胞中的視紫紅質(zhì)視蛋白(zfrho)及視錐細(xì)胞中的紅光敏感視蛋白(zfred)和綠光敏感視蛋白(zfgr)有關(guān)[21]。因此，本文研究了BPS長期暴露對雌性斑馬魚視覺行為OKR和OMR的影響，觀察了眼睛視網(wǎng)膜組織學(xué)切片，并對視網(wǎng)膜及其各層：包括外核層(ONL)、內(nèi)核層(INL)、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)、外叢狀層(OPL)和內(nèi)叢狀層(IPL)的厚度進(jìn)行了定量統(tǒng)計分析，實時定量PCR方法檢測了雌性斑馬魚視蛋白基因(zfrho、zfblue、zfgr、zfred和zfuv)的表達(dá)變化，系統(tǒng)研究了BPS長期暴露對雌性斑馬魚視覺行為、視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和視蛋白基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗物質(zhì)

BPS (CAS NO:80-09-1, purity≥ 98%, 購自Sigma-Aldrich (Shanghai, China)。助溶劑為二甲基亞砜(DMSO)，BPS儲備液濃度為0.01和1 mg/mL，室溫避光保存。

1.2 斑馬魚養(yǎng)殖和BPS暴露實驗及取樣

將成年T系雌雄斑馬魚(zebrafish,Daniorerio)分開飼養(yǎng)于25 L連續(xù)曝氣24 h以上的自來水中，飼養(yǎng)條件為：水溫(27±1) ℃，光暗比為14 L∶10 D，DO=(7.0±0.1) mg/L，pH=(7.8±0.2)，每天喂食2次孵化的鹵蟲(Artemiasaline)。分開2周后，選擇懷卵雌魚和健康雄魚按1∶2的比例進(jìn)行光照刺激產(chǎn)卵，次日收集受精卵，清洗后用于暴露實驗。

實驗采用半靜態(tài)毒性試驗方法。受精后2 h (hpf, hours post-fertilization)-受精后15 d (dpf, days post-fertilization)，斑馬魚仔魚飼養(yǎng)于1.5 L BPS暴露溶液的燒杯中；15～40 dpf，斑馬魚幼魚飼養(yǎng)于4.5 L暴露液的燒杯中；40～120 dpf，斑馬魚飼養(yǎng)于30 L暴露液的魚缸中；每天更新2/3的暴露液(依次為1、3和20 L)。設(shè)置1、10、100和1 000 μg/L BPS暴露組，同時設(shè)置空白對照組和溶劑對照組(DMSO, 0.002%)。BPS暴露斑馬魚胚胎(2 hpf)至性成熟(120 dpf)，具體操作和斑馬魚的喂食情況如圖1所示。

圖1 BPS長期暴露示意圖

暴露結(jié)束后，稱量體長和體重后解剖辨別雌雄，取每條雌性斑馬魚的一只眼睛置于1.5 mL離心管中，每三條魚的眼睛混為一個樣品，取6個平行樣品，迅速冷凍于液氮中，隨后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存，用于基因表達(dá)水平的測定。另取7只眼睛固定于10%中性福爾馬林固定液中24 h后用于制作石蠟切片。隨機(jī)取8條魚用于視覺行為OKR和OMR的測定。

1.3 斑馬魚行為學(xué)實驗

斑馬魚視覺已被證明有明顯的生物節(jié)律性[22]。OKR和OMR實驗安排在上午10:00—12：00，15:00—18:00進(jìn)行。

OKR實驗參照Cameron等[23]的方法，光柵條帶選擇12 cycles，光柵直徑為11 cm，光柵轉(zhuǎn)速設(shè)置為25 cycles/min，對應(yīng)時間頻率為150°/s，光對比度設(shè)置為0.3。麻醉并固定雌性斑馬魚于OKR行為杯子中，調(diào)整魚體使其身體背側(cè)向正上方，加水后放入刺激裝置中，調(diào)整顯微鏡使至合適視野、放大倍數(shù)并對焦使圖像清晰，待魚清醒5 min后，光強(qiáng)度和光柵刺激各適應(yīng)1 min后由CCD拍攝記錄眼動，通過自制軟件分析獲得OKR行為學(xué)數(shù)據(jù)。

OMR實驗參照Zou等[24]的方法，光柵直徑為12 cm，光柵密度為12個周期，刺激頻率為25 r/min，CCD視頻拍攝幀率為30幀/s。將雌性斑馬魚放進(jìn)OMR行為杯子中，刺激適應(yīng)1 min后順時針(clockwise, CW)開始記錄，之后休息1 min，逆時針(Counterclockwise, CCW)方向重復(fù)上面操作。采用自制軟件統(tǒng)計追隨百分比(追隨光柵的時間除以總記錄時間再乘以100%)。

1.4 雌性斑馬魚眼睛石蠟切片的制備

固定后的雌性斑馬魚眼睛經(jīng)梯度乙醇脫水后，用二甲苯透明，浸蠟包埋，進(jìn)行常規(guī)切片，厚度為5 μm，蘇木精-伊紅(H-E)染色。Nikon光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，Image J軟件測量眼睛視網(wǎng)膜及各層結(jié)構(gòu)：RPE、ONL、INL、IPL、GCL的厚度，每組選取7只魚眼，每只魚眼選取視網(wǎng)膜中央部位測5處。

1.5 實時定量PCR (qPCR)

Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)法提取眼睛總RNA，NanoDrop ND-2000c紫外分光光度計測定總RNA的質(zhì)量及濃度。等量的質(zhì)量合格(1.9< 260/280< 2.0)的總RNA(1 μg) 利用gDNA Eraser消除基因組污染，然后利用PrimeScriptTMRT reagent Kit (TaKaRa, Shiga, Japan)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

根據(jù)Genbank已發(fā)表序列設(shè)計各基因特異性引物(見表1)。qPCR實驗采用Eppendorf MasterCycler ep RealPlex4)定量PCR儀，按照SYBR green mix kit (TaKaRa, Dalian, China)說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)程序為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。各PCR反應(yīng)最終進(jìn)行溶解曲線分析，擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，確定擴(kuò)增片段的特異性。目的基因mRNA的相對豐度采用2-ΔΔCt法[25]，以β-actin和elfa為內(nèi)參(經(jīng)內(nèi)參基因的篩選β-actin和elfa為最優(yōu)雙內(nèi)參組合)，計算不同暴露組目的基因的相對表達(dá)量。

表1 熒光定量引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

柱狀圖利用Graphpad prism 5.0完成，結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Tukey多重比較，P<0.05表示差異顯著(用*標(biāo)記)，P<0.01表示差異極顯著(用**標(biāo)記)。

2 結(jié)果

2.1 BPS長期暴露對雌性斑馬魚OKR和OMR的影響

不同濃度的BPS暴露斑馬魚胚胎至性成熟120 d，與溶劑對照組相比，10和100 μg/L暴露組雌性斑馬魚OKR的SPG值(慢速相gain值，慢速相中斑馬魚眼睛轉(zhuǎn)動的角速度與光柵轉(zhuǎn)動角速度的比值)顯著下降(見圖2)；無論順時針(CW)還是逆時針(CCW)轉(zhuǎn)動，與溶劑對照組相比，各暴露組雌性斑馬魚的光柵追隨率雖有所下降，但均無顯著性差異(見圖3)。

(n=8；表示P< 0.05。 means P< 0.05.)圖2 BPS長期暴露對雌性斑馬魚OKR的影響

(光柵轉(zhuǎn)動方向：順時針和逆時針。The striped drum was rotated CW and CCW.n=8)

圖3 BPS長期暴露對雌性斑馬魚OMR的影響
Fig.3 The optomotor response of female zebrafish exposed to BPS for 120 days

2.2 BPS長期暴露對雌性斑馬魚眼睛視網(wǎng)膜厚度的影響

不同濃度的BPS暴露斑馬魚胚胎至性成熟120 d，溶劑對照組(見圖4A)、10 μg/L(見圖4C)、100 μg/L(見圖4D)和1 000 μg/L BPS暴露組(見圖4E)雌性斑馬魚的視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)完整，各層細(xì)胞排列規(guī)則整齊，密度均勻；1 μg/L BPS暴露組視網(wǎng)膜RPE層出現(xiàn)小的空隙(圖4B白色箭頭)。對視網(wǎng)膜及各層定量結(jié)果顯示，與溶劑對照組相比，1 000 μg/L BPS暴露組RPE、ONL、IPL、GCL和視網(wǎng)膜厚度分別顯著增加了41.9%、28.4%、20.9%、25.5%和24.9% (見圖5)。

(A.溶劑對照組；B.1 μg/L；C. 10 μg/L；D. 100 μg/L ；E 1 000 μg/L BPS暴露組，標(biāo)尺為50 μm。 A. The solvent control with normal layering; B. 1 μg/L; C. 10 μg/L; D. 100 μg/L ; E. 1 000 μg/L BPS-treated groups. Scale bar: 50 μm.)

圖4 BPS長期暴露對雌性斑馬魚眼睛視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的影響

Fig.4 Histopathological analyses of female zebrafish retina structure between the solvent control and BPS-treated groups

(n=7，?表示P<0.05。?means P< 0.05.)圖5 BPS長期暴露對雌性斑馬魚眼睛視網(wǎng)膜及各層厚度(μm)的影響

2.3 BPS長期暴露對雌性斑馬魚眼睛視蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

不同濃度的BPS暴露斑馬魚胚胎至性成熟120 d，與溶劑對照組相比，各暴露組zfred(見圖6A)表達(dá)量均顯著上調(diào)，其中1和1 000 μg/L暴露組表達(dá)量極顯著上調(diào)；zfgr(見圖6B)和zfblue(見圖6C)在1和100 μg/L暴露組的表達(dá)量出現(xiàn)顯著上調(diào)；zfuv(見圖6D)在1、10和100 μg/L暴露組的表達(dá)量出現(xiàn)極顯著上調(diào)，而zfrho(見圖6E)的表達(dá)量在各暴露組均無顯著性變化。

3 討論

本研究結(jié)果首次表明，BPS長期暴露能夠顯著降低雌性斑馬魚的視覺追蹤能力。斑馬魚是一種典型的白晝活動和具有較好視覺功能的魚類，在5 dpf和7 dpf即具有穩(wěn)健的OKR和OMR，并一直持續(xù)到成年[26]。斑馬魚的OKR和OMR都是視覺刺激誘導(dǎo)的視覺行為，無需訓(xùn)練即可誘導(dǎo)產(chǎn)生。Rinner等[27]在研究斑馬魚OKR時用SPG值(慢速相的gain值為慢速相中斑馬魚眼睛轉(zhuǎn)動的角速度與光柵轉(zhuǎn)動角速度的比值)來表征眼睛追蹤轉(zhuǎn)動光柵的能力，SPG值降低表明斑馬魚眼睛追蹤能力下降，視覺功能受損[28]。本研究中，10和100 μg/L暴露組OKR的SPG值顯著下降，表明BPS長期暴露顯著降低了雌性斑馬魚眼睛的追蹤能力。斑馬魚成魚主要依靠視覺進(jìn)行捕食及逃避捕食者等活動[29-30]，雌性斑馬魚視覺追蹤能力顯著下降說明10和100 μg/L BPS長期暴露可能會影響雌性斑馬魚的攝食行為，進(jìn)而影響其生長和繁殖。Neuhauss等[31]認(rèn)為斑馬魚眼睛追蹤能力的變化可能與眼睛轉(zhuǎn)動發(fā)生機(jī)械障礙有關(guān)。污染物對生物體正常生理功能的影響存在一個閾值(即安全劑量)，只有當(dāng)污染物濃度達(dá)到這一閾值時才能引發(fā)效應(yīng)[32]，例如，Wang等[13]的研究發(fā)現(xiàn)0.125 mg/L多氯聯(lián)苯(PCB)暴露對斑馬魚視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和厚度均無顯著影響，而0.25 mg/L PCB暴露顯著增加斑馬魚眼睛寬度；0.32 μg/L多溴聯(lián)苯醚(DE-71)暴露對斑馬魚視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)目無明顯影響，而濃度達(dá)3.58 μg/L時便能顯著降低其數(shù)目[15]。本研究中1 μg/L暴露組OKR慢速相值無顯著變化，可能與BPS濃度較低有關(guān)。

OMR實驗中，斑馬魚的身體沒有被固定，能跟隨感知的黑白光柵運動[33]，可通過檢測斑馬魚對黑白光柵的趨向性來研究其視覺運動能力[23]，視覺未受損傷的魚類會追隨光柵運動[34-35]，追隨百分比越高表示斑馬魚的視覺功能越好，本研究中無論CW還是CCW，雌性斑馬魚的追隨百分比均無顯著性變化，Neuhauss[36]發(fā)現(xiàn)斑馬魚同金魚[37]一樣，其OMR反應(yīng)依賴于視桿細(xì)胞和某種視錐細(xì)胞中的視蛋白，斑馬魚含有五種視蛋白，視桿細(xì)胞中的視紫紅質(zhì)視蛋白(zfrho)，視錐細(xì)胞中的綠光敏感視蛋白(zfgr)、紅光敏感視蛋白(zfred)、藍(lán)光敏感視蛋白(zfblue)和紫外敏感視蛋白(zfuv)，它們由光感受器合成，決定視色素的光譜敏感性[38]。Orger 和 Baier[39]的研究表明成年斑馬魚OMR識別視錐細(xì)胞中的zfred、zfgr和視桿細(xì)胞的zfrho。本研究中BPS長期暴露對雌性斑馬魚追隨百分比無顯著性影響可能與zfrho的表達(dá)量在各暴露組均無顯著性變化有關(guān)。另外，BPS長期暴露顯著上調(diào)了雌性斑馬魚中zfred、zfgr、zfblue和zfuv的基因轉(zhuǎn)錄水平，Xu等[40]也發(fā)現(xiàn)斑馬魚經(jīng)PBDEs暴露后，其五種視蛋白基因的表達(dá)也都出現(xiàn)了顯著性上調(diào)，推測可能是視色素的另一組成成分生色團(tuán)視黃醛減少后的代償性反應(yīng)，以增強(qiáng)斑馬魚對紅光、綠光、藍(lán)光和紫外的敏感性。

(n=3；表示P< 0.05，表示P< 0.01。means P< 0.05, means P<0.01.)

BPS暴露不僅影響斑馬魚的視覺行為，還會對其視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。視網(wǎng)膜組織切片結(jié)果顯示BPS長期暴露并未對雌性斑馬魚的視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)分層等造成嚴(yán)重?fù)p傷，雌激素通過與雌激素受體(ERs)結(jié)合對視網(wǎng)膜發(fā)揮保護(hù)作用[41-42]。ERs在視網(wǎng)膜中分布廣泛，且存在年齡和性別差異，ERα主要分布在年輕女性的視網(wǎng)膜上[41,43]，已有的研究表明BPS具有雌激素效應(yīng)[7-8, 44]，BPS長期暴露能顯著上調(diào)雌激素E2的水平[9]，因此，我們推測上調(diào)的E2對視網(wǎng)膜的保護(hù)作用可能是雌性斑馬魚視網(wǎng)膜分層及細(xì)胞排列無明顯變化的原因。斑馬魚的視網(wǎng)膜在損傷后具有很強(qiáng)的再生能力，能自我修復(fù)多種因損傷導(dǎo)致的視覺功能缺失[45]。因此我們推測1 000 μg/L BPS暴露促進(jìn)了雌性斑馬魚視網(wǎng)膜細(xì)胞再生，導(dǎo)致視網(wǎng)膜及其各層厚度增加，進(jìn)而使得最高濃度組OKR慢速相值無顯著變化。另外，許多眼科疾病如糖尿病視網(wǎng)膜病變[46]、中心性漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變[47]等均與視網(wǎng)膜厚度異常增加有關(guān)，高濃度BPS導(dǎo)致的視網(wǎng)膜厚度異常增加雖然對雌性斑馬魚視覺追蹤能力沒有造成明顯影響，但可能會升高上述一些眼科疾病的發(fā)病率。

綜上，本研究首次從分子、組織學(xué)和個體等不同水平探究了BPS長期暴露對雌性斑馬魚的視覺毒性及潛在機(jī)制，證實了BPS長期暴露顯著降低了雌性斑馬魚的視覺追蹤能力，而高濃度BPS增加了視網(wǎng)膜及其各層的厚度，可能會導(dǎo)致視網(wǎng)膜病變的風(fēng)險升高。環(huán)境中BPS可能長期存在且較難降解，因此，BPS長期暴露可能對人的視覺健康造成潛在威脅，需引起研究者廣泛關(guān)注。