劉騁躍， 周演根,2??， 董 亢， 曹逸銘， 孫大江,2， 高勤峰,2， 董雙林,2

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(中國海洋大學(xué))，山東 青島 266100；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266235)

不論是昆蟲[1]、魚類[2]還是哺乳動物[3]，磷脂在其細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成中均扮演著重要角色。磷脂是唯一已知可以通過脂肪酸的補(bǔ)償重組來適應(yīng)環(huán)境變化的生物膜結(jié)構(gòu)成分，并且可以改變膜上蛋白質(zhì)的功能[4-8]。Hazel[9]已經(jīng)證明環(huán)境溫度的下降可以明顯提高虹鱒(Oncorhynchusmykiss)肝臟膜磷脂的流動性?；|(Dicentrarchuslabrax)在鹽度升高時(shí)其肌肉磷脂中飽和脂肪酸顯著上升使生物膜變的更具剛性[10]。

淡水和海水環(huán)境相差較大，其中離子濃度相差大約在1 000倍，但是不同魚類血液中離子差別僅在3倍左右[11]。因此，無論魚類生活在淡水還是海水環(huán)境中，均需要通過機(jī)體中各組織器官進(jìn)行滲透壓調(diào)節(jié)，來維持體內(nèi)離子平衡[12]。在淡水中，魚類通過分泌尿液和離子的被動流失來維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[13]；而在海水中，魚類可通過離子耦合液體的吸收和主動運(yùn)輸離子來維持機(jī)體滲透壓的穩(wěn)定[14]。

虹鱒屬于鮭科(Salmonidae)魚類，是重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖種類之一。由于鮭鱒魚類肉質(zhì)鮮美并且富含多種人體所需的多不飽和脂肪酸，因而人們對其需求量不斷增加，尤其是在中國[15]。經(jīng)海水馴化后的虹鱒在生長速率、抗病能力以及口感上都遠(yuǎn)優(yōu)于淡水養(yǎng)殖的虹鱒[16-18]。因此，海水養(yǎng)殖虹鱒逐漸流行并具有良好的前景。

魚類海水馴化(鹽度脅迫)對于磷脂脂肪酸組成和膜的流動性的研究主要集中在淡水魚以及廣鹽性魚類中，而關(guān)于洄游性鮭科魚類的研究不多。本實(shí)驗(yàn)通過測定虹鱒海水馴化前后鰓、肌肉和肝臟中磷脂脂肪酸的組成，發(fā)現(xiàn)不同組織器官在適應(yīng)海水過程中引起磷脂變化的關(guān)鍵脂肪酸，以此探究其對海水馴化的適應(yīng)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)于2017年7月2日—8月1日在中國海洋大學(xué)魚山校區(qū)水產(chǎn)館實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)材料為三倍體虹鱒，取自日照萬澤豐漁業(yè)有限公司鮭鱒魚繁育場(日照，山東)。

實(shí)驗(yàn)用虹鱒先在實(shí)驗(yàn)室條件暫養(yǎng)2周(溫度(16±0.5)℃)，鹽度0)。然后選取規(guī)格相似((195.23 ± 15.75) g)、生長狀況良好的虹鱒60尾，隨機(jī)分成3組分別養(yǎng)殖在3個(gè)(277 L；高：58 cm；半徑：39 cm)圓形玻璃纖維水缸中。實(shí)驗(yàn)開始后，采用逐漸添加海水的方式將水缸水的鹽度從0升到30，鹽度增加速度為2/天，以使虹鱒可以適應(yīng)新的鹽度變化。暫養(yǎng)以及實(shí)驗(yàn)過程中每天于08:00和18:00投喂2次，日投喂量為總體重的2%，餌料為商品飼料(七好鮭鱒魚飼料)，其脂肪酸組成如表1所示。投喂2 h后換水，每次換水量為總體積的一半。由溫控系統(tǒng)(ZKH-WK 2000，中科海，青島，中國)控制水溫。溶氧含量不低于6 mg/L。光照周期為12 h光照：12 h黑暗。每天監(jiān)測并記錄水溫、溶解氧(DO)、酸堿度(pH)和鹽度等水質(zhì)數(shù)據(jù)，測定儀器為YSI專業(yè)水質(zhì)檢測儀(Yellow Spring，Ohio，USA)。

海水馴化過程中水質(zhì)均保持在良好狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)魚類無死亡、受傷情況。分別在鹽度變化前(0)和海水(30)適應(yīng)一周后取樣。采樣前一天停止進(jìn)食，每個(gè)水缸隨機(jī)取3尾魚。用麻醉劑MS-222(濃度為70 mg/L)將魚麻醉，然后取鰓絲、背肌和肝臟并迅速放到液氮中，然后將樣品轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱(New Brunswick Scientific，Edison，New Jersey，USA)中備用。

表1 餌料中脂肪酸的組成Table 1 Fatty acid composition of the diet /%

1.2 磷脂脂肪酸的提取和測定

總脂和磷脂的提取參考了Hazel[9]的方法。取0.1 g組織樣品，加入3.3 mL甲醇溶液，用勻漿機(jī)勻漿1 min，再加入6.6 mL氯仿溶液，倒入10 mL甲酯化試管中，在搖床中震蕩30 min(37 °C，130 r/min)，過濾后用氯仿/甲醇(2∶1，v/v)混合液定容至10 mL，4 °C下靜置過夜。取氯仿層氮?dú)獯蹈珊笥檬兔褟?fù)溶至10 mL，放到-20 °C保存。取2 mL油脂和石油醚混合液到4 mL EP管中，氮?dú)獯蹈?，加?0 μL石油醚，用毛細(xì)管吸取后均勻地點(diǎn)在硅膠板(10 cm× 5 cm, Yinlong Company, Yantai, China)上，在中性展開劑(正己烷∶乙醚∶乙酸=85∶14∶1)中展開，用單質(zhì)碘顯色后將極性脂刮下放入甲酯化試管中，加入2 mL 甲酯化試劑(HCl-甲醇溶液)，充入氮?dú)夂蠓胖玫剿″佒? h(90℃)，加入1 mL色譜級正己烷，振蕩均勻后靜置，待分層后取含有脂肪酸甲酯的上層正己烷溶液，氮?dú)獯蹈珊笥蒙V級正己烷復(fù)溶至50 μL，放入氣相色譜進(jìn)樣瓶中待測。

脂肪酸甲酯的檢測使用氣相色譜儀(Shimadzu GC-2010 plus，Kyoto，Japan)，進(jìn)樣量為1 μL，檢測器為火焰電離化檢測器(GC-2010，Shimadzu，Kyoto，Japan)，氣相色譜柱為RTX-WAX石英毛細(xì)管柱(長30 m×直徑0.25 mm×厚0.25 μm, Phenomenex，Torrance，California，USA)。升溫程序?yàn)椋?0℃維持1.0 min，以10℃/min的升溫速度升到190℃，然后以2.0℃/min的升溫速度升到260℃，維持0.6 min。色譜峰的定性是通過與37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)品(Supelco，Bellefonte，Pennsylvania，USA)的保留時(shí)間相比較的方式進(jìn)行，定量采用的是面積歸一法(外標(biāo)法，5點(diǎn)定標(biāo))。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以9個(gè)重復(fù)(3個(gè)平行，每個(gè)平行取3尾魚)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± SD)表示。采用SAS 9.4(SAS Institute Incorporated，Cary，North Carolina，USA)統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，將不同組織海水馴化前后磷脂脂肪酸的組成進(jìn)行t檢驗(yàn)分析(t-test)，以P<0.05為有顯著相關(guān)性。

為了對不同組織中磷脂脂肪酸的組成進(jìn)行更好的表述，我們參照Snyder等[19]和Williams等[20]的方法，使用了不飽和指數(shù)(Unsaturation index；UI)、不飽和率(Unsaturated to saturated fatty acids ratio；U/S)和平均脂肪酸長度(Average number of C-atoms of the unsaturated fatty acid；Length)對組織器官中磷脂脂肪酸進(jìn)行整體評價(jià)。計(jì)算方法如下：

UI = ∑(% monoenes+2×%dienes+3×% trienes …)/100；

U/S = ∑(% UFA)/∑(% SFA)；

LENGTH = ∑(18×% 18 C-UFA +19×% 19 C-UFA + 20×% 20 C-UFA…)。

式中：%表示其所占百分比；monoenes、dienes、trienes…分別表示還有1、2、3…雙鍵的脂肪酸；18C-UFA、19C-UFA、20C-UFA…分別表示碳鏈長度為18、19、20…的不飽和脂肪酸。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)魚脂肪酸組成

本研究對虹鱒肌肉、鰓和肝組織中的磷脂脂肪酸進(jìn)行了測定，共檢測出15～20種脂肪酸(見表2～4)，包括飽和脂肪酸(SFA)4～7種，單一不飽和脂肪酸(MUFA)4～5種，多不飽和脂肪酸(PUFA)7～8種。在虹鱒鹽度馴化前后3種組織器官的磷脂中，飽和脂肪酸所占比例最高的是棕櫚酸(Palmitic acid，16:0)，單不飽和脂肪酸所占比例最高的是油酸(Oleic acid，18:1n9)，多不飽和脂肪酸所占比例最高的是DHA(Docosahexaenoic acid，22:6n3)，這3種脂肪酸總量在磷脂中所占比例均超過60%。另外含量較多的脂肪酸還有硬脂酸(Stearic acid，18:0)、亞麻酸(Linoleic，18:2n6)、ARA(Arachidonic acid，20:4n6)和EPA(Eicosapentaenoic acid，20:5n3)。

2.2 海水馴化前后虹鱒不同組織磷脂脂肪酸組成的變化

如表2所示，雖然海水馴化后虹鱒肌肉組織磷脂脂肪酸中 MUFA和n-6 PUFA的比例沒有顯著變化，但是PUFA中20:4n6，20:5n3以及22:6n3的比例顯著降低，同時(shí)SFA(尤其是16:0)上升。這些變化使虹鱒肌肉磷脂中n-3 PUFA、UI、U/S和LENGTH均顯著下降。

虹鱒適應(yīng)海水后，鰓中磷脂16:0、20:4n6和22:6n3比例顯著上升，而 18:2n6、18:3n3和20:5n3的比例顯著下降?？傮w上看，SFA、PUFA、n-6 PUFA和U/S變化顯著，而MUFA、n-3 PUFA、UI和LENGTH不存在顯著變化(見表3)。

與淡水虹鱒肝臟磷脂脂肪酸相比，海水使其肝臟磷脂中18:1n9、20:5n3和22:6n3的比例顯著上升，16:0、18:0則顯著下降。這些變化使SFA顯著下降，MUFA、n-3 PUFA、UI、U/S和LENGTH均顯著上升，而n-6 PUFA則變化不顯著(見表4)。

3 討論

魚類對海水的適應(yīng)是通過一系列生理生化、形態(tài)及行為的復(fù)雜變化完成，這些變化獨(dú)立但又相互協(xié)調(diào)并且需要消耗大量的能量[22-23]。生物膜是細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境物質(zhì)交換的介質(zhì)。生物膜磷脂的變化會直接影響生物膜的物理性質(zhì)和生物功能，如流動性、膜相行為、膜厚度、膜滲透性和與膜相關(guān)酶的活性[21]。因此，在魚類適應(yīng)環(huán)境因素變化的過程中，組織器官生物膜磷脂脂肪酸組成的改變起到了重要作用。

魚類肌肉組織對周圍環(huán)境的變化較為敏感，尤其是鹽度和溫度[24]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過海水馴化后虹鱒肌肉磷脂中以16:0為主的SFA顯著上升，同時(shí)PUFA顯著下降。這些變化導(dǎo)致肌肉磷脂的UI、U/S和LENGTH顯著下降，表明細(xì)胞膜的黏性提高。Cordier等[10]在對法國帕拉瓦萊弗洛海域(Palavas les flots，Herault，F(xiàn)rance)花鱸肌肉脂肪酸一年的跟蹤監(jiān)測發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果，在6～8月海水溫度和鹽度均上升時(shí)肌肉磷脂中22:6n3、20:5n3的比例下降。尼羅羅非魚在養(yǎng)殖環(huán)境鹽度從5升高到25后，其肌肉磷脂中飽和脂肪酸16:0和18:0所占比例均顯著提高[25]。不論是飽和脂肪酸比例的增加還是多不飽和脂肪酸比例的下降，會造成生物膜磷脂黏性的增加，這可以減緩離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的速度，以此降低魚類在高滲脅迫環(huán)境中產(chǎn)生的不利影響[26]。但是，孔雀魚(Poeciliareticulate)[27]和鰻鱺(Anguillarostrata)[28]經(jīng)過高鹽脅迫后肌肉磷脂脂肪酸的變化與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有所不同，這可能是由于物種、攝食成分或者溫度的差異造成的。在虹鱒適應(yīng)海水過程中，由于海水中離子濃度遠(yuǎn)高于魚類血液中的離子濃度，這會導(dǎo)致壞境中大量離子進(jìn)入肌肉組織細(xì)胞內(nèi)，因此細(xì)胞為了維持內(nèi)外環(huán)境離子動態(tài)平衡以及正常的生理功能，肌肉膜磷脂會通過增加SFA來提高生物膜的黏性(剛性)。

表2 海水馴化前(淡水)后(海水)虹鱒肌肉磷脂脂肪酸的組成Table 2 Fatty acid compositions of phospholipid in the muscle of rainbow trout before (freshwater: FW) and after (seawater: SW) acclimation /%

注：數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，同行中帶有“*”表示具有顯著差異(P<0.05)。

FW：淡水處理組；SW：海水處理組；SFA：飽和脂肪酸；MUFA：單一不飽和脂肪酸；PUFA：多不飽和脂肪酸；n-3 PUFA：亞麻酸族不飽和脂肪酸；n-6 PUFA：亞油酸族不飽和脂肪酸；UI：不飽和指數(shù)；U/S：不飽和率；LENGTH：平均脂肪酸長度。

Note: Values are mean ± SD, Significant differences (P<0.05) each row are indicated by superscript “*”.

FW: Freshwater treatment, SW: Seawater treatment, SFA: Saturated fatty acid, MUFA: Monounsaturated fatty acids, PUFA: Polyunsaturated fatty acid, n-3 PUFA: Omega-3 series polyunsaturated fatty acid, n-6 PUFA: Omega-6 series polyunsaturated fatty acid, UI: unsaturated index, U/S: the ratio of unsaturated and saturated fatty acid, LENGTH: the average length of fatty acid.

表3 海水馴化前(淡水)后(海水)虹鱒鰓磷脂脂肪酸的組成Table 3 Fatty acid compositions of phospholipid in the gill of rainbow trout before (freshwater: FW) and after (seawater: SW) acclimation /%

注：數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，同行中帶有“*”表示具有顯著差異(P<0.05)。

FW：淡水處理組；SW：海水處理組；SFA：飽和脂肪酸；MUFA：單一不飽和脂肪酸；PUFA：多不飽和脂肪酸；n-3 PUFA：亞麻酸族不飽和脂肪酸；n-6 PUFA：亞油酸族不飽和脂肪酸；UI：不飽和指數(shù)；U/S：不飽和率；LENGTH：平均脂肪酸長度。

Note: Values are mean ± SD, Significant differences (P<0.05) each row are indicated by superscript “*”.

FW: Freshwater treatment, SW: Seawater treatment, SFA: Saturated fatty acid, MUFA: Monounsaturated fatty acids, PUFA: Polyunsaturated fatty acid, n-3 PUFA: Omega-3 series polyunsaturated fatty acid, n-6 PUFA: Omega-6 series polyunsaturated fatty acid, UI: unsaturated index, U/S: the ratio of unsaturated and saturated fatty acid, LENGTH: the average length of fatty acid.

表4 海水馴化前(淡水；FW)后(海水；SW)虹鱒肝臟磷脂脂肪酸的組成Table 4 Fatty acid compositions of phospholipid in the liver of rainbow trout before (freshwater: FW)and after (seawater: SW) acclimation /%

注：數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，同行中帶有“*”表示具有顯著差異(P<0.05)。

FW：淡水處理組；SW：海水處理組；SFA：飽和脂肪酸；MUFA：單一不飽和脂肪酸；PUFA：多不飽和脂肪酸；n-3 PUFA：亞麻酸族不飽和脂肪酸；n-6 PUFA：亞油酸族不飽和脂肪酸；UI：不飽和指數(shù)；U/S：不飽和率；LENGTH：平均脂肪酸長度。

Note: Values are mean ± SD, Significant differences (P<0.05) each row are indicated by superscript “*”.

FW: Freshwater treatment, SW: Seawater treatment, SFA: Saturated fatty acid, MUFA: Monounsaturated fatty acids, PUFA: Polyunsaturated fatty acid, n-3 PUFA: Omega-3 series polyunsaturated fatty acid, n-6 PUFA: Omega-6 series polyunsaturated fatty acid, UI: unsaturated index, U/S: the ratio of unsaturated and saturated fatty acid, LENGTH: the average length of fatty acid.

對于魚類來說，鰓是主要的滲透壓調(diào)節(jié)器官并且與環(huán)境直接接觸。魚類鰓上皮細(xì)胞在淡水和海水中分別具有吸收和排泄離子的功能。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)虹鱒經(jīng)海水馴化后鰓中磷脂16:0、18:2n6、20:4n6、20:5n3和22:6n3變化顯著。雖然這些變化導(dǎo)致了SFA顯著升高而PUFA顯著下降，但是與膜流動性相關(guān)的UI和脂肪酸平均長度變化不顯著。Nemova等[30]的研究表明周圍環(huán)境鹽度的改變會使藍(lán)貽貝(Mytilusedulis)鰓磷脂脂肪酸發(fā)生重組，鹽度的升高(對照組：25，高鹽組：45)造成鰓磷脂中以22:6n3和20:5n3為主的PUFA顯著上升，而MUFA和SFA顯著下降。淡水中養(yǎng)殖的鰻鱺鰓磷脂中20:4n6和22:6n3的比例分別是8%和9%，而在經(jīng)歷海水馴化后，這2種脂肪酸分別上升至12%和19%[28]。眾所周知，膜磷脂脂肪酸可以通過脂?；溨刑荚优c蛋白質(zhì)特異性相互作用以及膜相行為的變化來抑制或者促進(jìn)酶的活性[31]。鰓上皮細(xì)胞對離子的調(diào)控主要通過Na+/K+-ATPase酶來實(shí)現(xiàn)，相關(guān)研究表明Na+/K+-ATPase酶的活性受鰓膜磷脂中脂肪酸的影響較為顯著[28，32-33]。Bystriansky等[34]發(fā)現(xiàn)在紅點(diǎn)鮭(Salvelinusalpinus)鰓中Na+/K+-ATP酶的活性與某些PUFA呈正相關(guān)關(guān)系，尤其是ARA(20:4n6)和DHA(22:6n3)。此外，Grant等[35]在奇努克鮭(Oncorhynchustshawytscha)飼料中添加魚油后(富含n-3 PUFA)發(fā)現(xiàn)鰓中Na+/K+-ATPase α1b mRMA的表達(dá)量顯著提升。此外，DHA(22:6n3)和EPA(20:5n3)作為魚類必須脂肪酸，其不僅會影響酶的活性并且還是一些激素的前體，如前列腺素[28]。前列腺素除了具有生殖作用外還具有滲透壓調(diào)節(jié)作用[29]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在海水馴化后，虹鱒鰓中磷脂脂肪酸也會像肌肉一樣通過增加SFA的比例來增加生物膜的剛性，但是為了排泄進(jìn)入體內(nèi)的多余離子，鰓中磷脂需要富集更多的PUFA，特別是與Na+/K+-ATP酶活性相關(guān)的ARA和DHA，因此鰓中磷脂脂肪酸組成的變化并沒有使生物膜流動性發(fā)生變化。

與鰓和肌肉不同，在經(jīng)過海水馴化后虹鱒肝臟磷脂中SFA(16:0)顯著下降，同時(shí)MUFA(18:1n9)和n-3 PUFA(22:6n3和20:5n3)顯著上升，而n-6 PUFA則變化不大，這些變化使得UI、U/S以及脂肪酸平均長度均顯著增加，導(dǎo)致肝臟膜磷脂流動性顯著提高。Borlongan等[36]的研究發(fā)現(xiàn)遮目魚(Chanoschanos)在適應(yīng)海水的過程中肝臟、腸磷脂的不飽和度均顯著提高，從而使生物膜的流動性增加。Snyder等[37]發(fā)現(xiàn)低溫也會使淡水鯡魚(Alosapseudoharengus)肝臟磷脂中n-3 PUFA和n-6 PUFA顯著上升，尤其是DHA和18:2n6。不論是對低溫還是海水的適應(yīng)魚類均需要消耗大量能量，這使生物體內(nèi)貯存物質(zhì)的代謝增加[38]。肝臟作為魚類主要的能量代謝器官，在環(huán)境變化的適應(yīng)過程中負(fù)責(zé)物質(zhì)代謝以及能量供應(yīng)，與此同時(shí)，大量的酶和激素會參與到肝臟對脂質(zhì)和糖類的代謝中[38-41]。生物膜流動性的增加可以促進(jìn)膜內(nèi)外的物質(zhì)交換以及膜上酶和受體的活性，因此肝臟膜磷脂流動性的增加能夠促進(jìn)物質(zhì)的代謝。

4 結(jié)語

虹鱒磷脂脂肪酸在鹽度馴化前后產(chǎn)生顯著的組織特異性變化。經(jīng)海水馴化后，為維持內(nèi)外環(huán)境離子動態(tài)平衡以及正常的生理功能，虹鱒肌肉膜磷脂中SFA的比例上升使生物膜的黏稠性(剛性)增加，減緩了離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的速度；虹鱒鰓中磷脂脂肪酸也會像肌肉一樣通過增加SFA的比例來增加生物膜的剛性，但是為了排泄進(jìn)入體內(nèi)的多余離子，鰓中磷脂需要富集更多的PUFA，特別是與Na+/K+-ATP酶活性相關(guān)的ARA和DHA；與淡水中虹鱒相比，適應(yīng)海水后虹鱒肝臟膜磷脂中PUFA和MUFA均顯著增加而SFA則顯著下降，使得膜流動性提高，這可能與肝臟中脂質(zhì)和糖類代謝相關(guān)酶的活性有關(guān)。