商二磊， 隋正紅， 劉 源， 米 萍， 劉昊昕

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003)

多胺是一類廣泛存在于植物中的脂肪族多聚陽(yáng)離子化合物[1-3]，為生物正常生長(zhǎng)發(fā)育所必須，在植物的發(fā)育和生理過(guò)程中扮演著十分重要的角色，如調(diào)控細(xì)胞增殖、種子萌發(fā)和衰老[4-7]。細(xì)胞中多胺的平衡受包括銅胺氧化酶(Copper-containing amine oxidase, CuAO)在內(nèi)的多胺氧化酶調(diào)控[1]。CuAO是一類重要的多胺氧化酶，存在于細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物細(xì)胞中[8]，主要催化多胺伯氨基的氧化，生成對(duì)應(yīng)的氨基醛、過(guò)氧化氫(H2O2)和NH3，如催化腐氨(putrescine, Put)生成4-氨基丁醛、H2O2和NH3[2, 9-10]。作為多胺的氧化產(chǎn)物之一，H2O2參與細(xì)胞的程序性死亡過(guò)程[2, 11-12]。銅胺氧化酶在植物的生長(zhǎng)發(fā)育[1]、應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫上都發(fā)揮著重要的作用[1-2]。

赤潮是一種有害的生態(tài)異?，F(xiàn)象，在消亡階段赤潮生物大量死亡，赤潮生物機(jī)體分解需要消耗水體的溶解氧，導(dǎo)致其它生物缺氧死亡，破壞海洋的生態(tài)平衡。另外，衰亡期的赤潮生物因死亡而釋放的有毒代謝產(chǎn)物也影響海洋生態(tài)系統(tǒng)和人類的健康。所以赤潮消亡機(jī)理的研究有著重要的意義。很多研究認(rèn)為，赤潮消亡是一種細(xì)胞程序性死亡的過(guò)程[13-16]。鏈狀亞歷山大藻(Alexandriumcatenella)是一種常見(jiàn)的甲藻，是引發(fā)中國(guó)近岸赤潮的種類之一，由其引起的赤潮也廣泛分布于世界各海域。鏈狀亞歷山大藻能產(chǎn)生麻痹性貝毒，該毒素能被貝類積累，通過(guò)食物鏈最終影響人類的健康[17]。目前有關(guān)由鏈狀亞歷山大藻引發(fā)赤潮衰亡過(guò)程中調(diào)控機(jī)制的研究仍不清楚。

本研究的目的是通過(guò)鏈狀亞歷山大藻中銅胺氧化酶基因的克隆及目的基因在該藻不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)研究，初步探究銅胺氧化酶基因在鏈狀亞歷山大藻生長(zhǎng)過(guò)程中的表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究該藻赤潮衰亡過(guò)程中的細(xì)胞生理變化與調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 材料的培養(yǎng)

鏈狀亞歷山大藻，保存于中國(guó)海洋大學(xué)藻種室。在無(wú)菌f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度(20±1) ℃，光暗周期12 h/12 h，光照強(qiáng)度30 μmol·m-2·s-1[18]。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的鏈狀亞歷山大藻進(jìn)行同步化處理[19]，即將藻置于黑暗下48 h，隨后將處理過(guò)的藻細(xì)胞以2×106cells/L的密度接種至無(wú)菌f/2培養(yǎng)基中，在如上條件下培養(yǎng)。在延遲期(第2天)、對(duì)數(shù)期(第7天)和衰亡期(第23天)進(jìn)行取樣。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 核酸的提取和cDNA的制備 將含約5×106個(gè)細(xì)胞的藻液通過(guò)孔徑為10 μm的無(wú)菌篩絹，然后用400 mL無(wú)菌f/2培養(yǎng)基沖洗，將藻細(xì)胞收集于1.5 mL EP管中，保存于-80 ℃冰箱備用。使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)和RNAiso Plus試劑盒(TaKaRa)按操作說(shuō)明分別提取鏈狀亞歷山大藻細(xì)胞的DNA和總RNA。對(duì)提取的RNA，先用DNase I(TaKaRa)消化DNA，用1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性，再用Nano Drop 2000檢測(cè)其濃度和質(zhì)量，選擇A260/A230 在2.0～2.2，A260/A280在1.8～2.0之間的RNA用于cDNA合成。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)按照操作說(shuō)明制備cDNA。

1.2.2 目的基因的克隆及生物信息學(xué)分析 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有的鏈狀亞歷山大藻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(SRX368254)的注釋結(jié)果，從中檢索出兩個(gè)編碼CuAO的unigene基因，分別將其命名為cad-1(登錄號(hào)KY930889)和cad-2(登錄號(hào)KY930890)?；谵D(zhuǎn)錄組中cad-1和cad-2的序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)ORF全長(zhǎng)擴(kuò)增引物，引物信息見(jiàn)表1。以DNA和cDNA分別作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，cad-1以cad-1fs/cad-1fa為引物，使用LA Taq DNA聚合酶(TaKaRa)，反應(yīng)程序：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。cad-2以cad-2fs/cad-2fa為引物，使用Gflex DNA聚合酶(TaKaRa)，反應(yīng)程序：94 ℃ 1 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，68 ℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)；68 ℃ 10 min。PMD19-T作為連接載體，對(duì)目的條帶進(jìn)行亞克隆，挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證后，送青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)ORF finder預(yù)測(cè)基因開(kāi)放閱讀框；使用在線工具Protparam預(yù)測(cè)蛋白的理化性質(zhì)；使用Predictprotein軟件預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；使用在線分析工具NetPhos 2.0預(yù)測(cè)蛋白的磷酸化位點(diǎn)；使用TMHMM 2.0軟件預(yù)測(cè)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；使用Clustal W軟件做氨基酸多序列比對(duì)；使用MEGA 6.0以鄰位連接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 熒光定量PCR 使用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)cad-1和cad-2在鏈狀亞歷山大藻不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)水平。cad-1和cad-2熒光定量PCR的擴(kuò)增引物分別為qp-cad-1S/qp-cad-1A和qp-cad-2S/qp-cad-2A；gapdh和actin為內(nèi)參基因，擴(kuò)增引物分別為gapdhS/gapdhA和actinS/actinA。使用SYBR I試劑盒(Roche)在Light Cycler?480ⅡPCR熒光定量?jī)x上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為20 μL，其中cDNA 1 μL，SYBR I 10 μL，正反引物的終濃度為0.5 μmol/L，剩余體積用無(wú)菌ddH2O補(bǔ)充，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)?；虻南鄬?duì)表達(dá)量用2-ΔΔCT法[20]進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 本實(shí)驗(yàn)中每組處理均設(shè)置3個(gè)平行樣。使用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 21.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，顯著性差異水平P≤0.05。

表1 PCR使用的引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的克隆和測(cè)序

根據(jù)ORF finder的預(yù)測(cè)結(jié)果，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序驗(yàn)證。電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。 以cDNA為模板對(duì)cad-1進(jìn)行擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度為1 068 bp序列，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1 023 bp；以DNA為模板擴(kuò)增所得的序列與cDNA一致。以cDNA為模板對(duì)cad-2進(jìn)行擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度為1 802 bp序列，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1 800 bp；而以DNA為模板擴(kuò)增所得序列長(zhǎng)度為2 867 bp，比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，該序列上除含有開(kāi)放閱讀框外，還有一個(gè)1 065 bp的內(nèi)含子。cad-2DNA和cDNA序列比較圖2。cad-1和cad-2 ORF全長(zhǎng)的比較見(jiàn)圖3，它們有一個(gè)較為保守的重疊區(qū)，重疊區(qū)核酸的比對(duì)見(jiàn)圖4，有11個(gè)核苷酸的差異。

(M泳道：DL 2000 marker；A：泳道1和2是分別是以DNA和cDNA為模板擴(kuò)增cad-1得到的條帶；B：泳道1是以DNA為模板擴(kuò)增cad-2得到的條帶；C：泳道1是以cDNA為模板擴(kuò)增cad-2得到的條帶。M: DL 2000 marker; A: line1 and 2 mean bands that amplified from template DNA and cDNA forcad-1 respectively; B: line1 means band that amplified from template DNA forcad-2; C: line1 means band that amplified from template cDNA forcad-2.)

圖1cad-1和cad-2全長(zhǎng)序列擴(kuò)增的電泳圖

Fig.1 Amplification ofcad-1 andcad-2

圖2 DNA和cDNA上cad-2開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)的比較

圖3 cad-1和cad-2 ORF全長(zhǎng)序列的比較

圖4 cad-1和cad-2重疊區(qū)核酸序列的比對(duì)

2.2 基因序列的生物信息學(xué)分析

序列分析發(fā)現(xiàn)，cad-1編碼340個(gè)氨基酸；ProtParam軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，其編碼蛋白質(zhì)(Cad-1)的分子式為C1661H2589N487O499S9，分子量為37.7 kDa，理論等電點(diǎn)為5.96；在線軟件NetPhos 2.0預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)共15個(gè)(絲氨酸位點(diǎn)8個(gè)、蘇氨酸位點(diǎn)7個(gè))；Predictprotein預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示， Cad-1由α螺旋(3.82%)、β折疊(31.47%)、和無(wú)規(guī)則卷曲(64.71%)組成。TMHMM預(yù)測(cè)結(jié)果顯示， Cad-1無(wú)跨膜域。

cad-2編碼599個(gè)氨基酸，其編碼的蛋白質(zhì)(Cad-2)分子式為C2871H4451N801O848S22，分子量為64.5 kDa，理論等電點(diǎn)為5.75； Cad-2的磷酸化位點(diǎn)共29個(gè)(絲氨酸位點(diǎn)19個(gè)、蘇氨酸位點(diǎn)7個(gè)、酪氨酸位點(diǎn)3個(gè))；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示， Cad-2由α螺旋(12.69%)、β折疊(26.38%)和無(wú)規(guī)則卷曲(60.93%)組成。TMHMM預(yù)測(cè)結(jié)果顯示， Cad-2的1～34位氨基酸在膜內(nèi)，35～57位氨基酸形成一個(gè)跨膜螺旋，58～599位氨基酸位于膜外。

不同物種的CuAO氨基酸序列Clustal W比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖5。不同物種CuAO氨基酸序列的相似性不高，但具有一個(gè)共同的保守結(jié)構(gòu)域“NYDY”，由Asn-Tyr-Asp-Tyr四個(gè)氨基酸殘基組成，且均含有3個(gè)組氨酸殘基。NCBI blastp比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Cad-1和Cad-2與顆石藻Emilianiahuxleyi(XP_005787067.1)銅胺氧化酶的Identities 分別為37%和34%，Positives分別為51%和49%。

(酸桿菌Acidobacteriabacterium(AMY12828.1)；擬南芥Arabidopsisthaliana(NP_174452.2)；水稻Oryzabrachyantha(XP_006659924.1)；高粱Sorghumbicolor(XP_002461776.1)；萊茵衣藻Chlamydomonasreinhardtii(XP_001693748.1)；顆石藻Emilianiahuxleyi(XP_005787067.1。虛線方框?yàn)榈鞍椎谋Ｊ赜颉癗YDY”，實(shí)線方框?yàn)槿齻€(gè)組氨酸保守位點(diǎn)，“*”表示完全保守的位點(diǎn)，“：”表示保守性較高的位點(diǎn)，“.”表示保守性較低的位點(diǎn)。Red square indicate the conserved active site “NYDY” of CuAO proteins, blue squares indicate the conservative sites of three histidine residues, “*” indicate full conserved site, “:” indicate high conserved site, “.” indicate low conserved site.)

圖5 CuAO蛋白部分氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

Fig.5 The result of amino acid sequence alignment of CuAO proteins

為了分析鏈狀亞歷山大藻的CuAO與其它物種相關(guān)蛋白的進(jìn)化關(guān)系，選取14個(gè)物種CuAO的氨基酸序列，以亞硝化侏儒菌Nitrosopumilus為外類群，使用MEGA 6.0構(gòu)建基于NJ法的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(見(jiàn)圖6)。進(jìn)化樹(shù)分為2支，鏈狀亞歷山大藻中的Cad-1和Cad-2先與顆石藻和抑食金球藻聚為一小支，而后與圓柱擬脆桿藻和萊茵衣藻聚為一支，表明鏈狀亞歷山大藻與顆石藻和抑食金球藻銅胺氧化酶的親緣關(guān)系較近；其它綠藻、紅藻、藍(lán)藻、微擬球藻和玉米聚為一支。

(團(tuán)藻Volvoxcarterif.nagariensis(XP 002959097.1)；小球藻Chlorellavariabilis(XP 005851907.1)；微胞藻Micromonaspusilla(XP_003057454.1)；單針藻Monoraphidiumneglectum(XP 013904686.1)；微擬球藻Nannochloropsisgaditana(EWM22333.1)；膠球藻Coccomyxasubellipsoidea(XP 005651923.1)；溫泉紅藻Galdieriasulphuraria(EME27392.1)；單細(xì)胞紅藻Cyanidioschyzonmerolae(BAM83045.1)；玉米Zeamays(XP 008663089.1)；萊茵衣藻Chlamydomonasreinhardtii(XP 001693748.1)；圓柱擬脆桿藻Fragilariopsiscylindrus(OEU12233.1)；顆石藻Emilianiahuxleyi(XP 005787067.1)；抑食金球藻Aureococcusanophagefferens(EGB06404.1)；鏈狀亞歷山大藻Cad-1和Cad-2；亞硝化侏儒菌Nitrosopumilussp(WP_050555097.1))

圖6 CuAO氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析

Fig.6 The phylogenetic tree of amino acid sequence of CuAO

2.3 基因cad-1和cad-2的表達(dá)

因兩目的基因間存在一段較為保守的重疊區(qū)，故將兩對(duì)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)在非重疊區(qū)內(nèi)。使用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期鏈狀亞歷山大藻中cad-1和cad-2在RNA水平上的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，延遲期作為對(duì)照，計(jì)算其它取樣點(diǎn)基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果見(jiàn)圖7。在鏈狀亞歷山大藻中，對(duì)數(shù)期cad-1的表達(dá)量是延遲期的2.54倍；衰亡期的表達(dá)量是延遲期的8.43倍；cad-2的相對(duì)表達(dá)量和cad-1有著相似的變化，對(duì)數(shù)期相比延遲期下調(diào)2.98倍，衰亡期比延遲期上調(diào)14.92倍。

3 討論

CuAO是細(xì)胞中一類重要的多胺氧化酶，存在于原核生物和真核生物中。研究表明，CuAO參與很多生命過(guò)程，如植物的生長(zhǎng)、發(fā)育以及應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫[1-2, 21-22]。Rea等研究發(fā)現(xiàn)[23]，鷹嘴豆(Cicerarietinum)組織的損傷能引起CuAO基因表達(dá)水平的增加。An等和吳夢(mèng)瑤等都發(fā)現(xiàn)，蠶豆(Viciafaba)保衛(wèi)細(xì)胞中CuAO參與氣孔關(guān)閉[24-25]。也有研究發(fā)現(xiàn)，在脅迫等條件下，多胺氧化酶催化多胺氧化產(chǎn)生的過(guò)量過(guò)氧化氫(H2O2)參與細(xì)胞程序性死亡[11-12, 26]。

(*表示其它取樣點(diǎn)相對(duì)延遲期有顯著性差異。Asterisk indicate significant difference.)

圖7 不同生長(zhǎng)時(shí)期無(wú)菌鏈狀亞歷山大藻中基因的相對(duì)表達(dá)量

Fig.7 The gene relative expressions at different growth stages of sterileAlexandriumcatenella

本研究中，從鏈狀亞歷山大藻中克隆了兩個(gè)銅胺氧化酶基因，分別為cad-1和cad-2。cad-1 ORF全長(zhǎng)1 023 bp；cad-2 ORF全長(zhǎng)1 800 bp，含一個(gè)1 065 bp的內(nèi)含子。cad-1和cad-2有一段重疊區(qū)，但有11個(gè)核苷酸的差異，表明它們是兩條不同的基因。Cad-1和Cad-2與其它物種銅胺氧化酶同源比對(duì)差異較大，是因?yàn)檫x擇的物種遺傳差異較大，且Cad-1和Cad-2同時(shí)進(jìn)行比對(duì)。blastp比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Cad-1和Cad-2與顆石藻E.huxleyi銅胺氧化酶的Identities 分別為37%和34%，Positives分別為51%和49%；Cad-1和Cad-2 均含有銅胺氧化酶的活性位點(diǎn)“NYD”[27]和可能與銅離子結(jié)合相關(guān)的3個(gè)組氨酸殘基[8]?？缒ゎA(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cad-1和Cad-2的“NYD”結(jié)構(gòu)域均位于膜外，推測(cè)鏈狀亞歷山大藻銅胺氧化酶的功能域可能在膜外。序列的比對(duì)結(jié)果表明，cad-1和cad-2是從基因組的不同位置轉(zhuǎn)錄的，同一種催化酶對(duì)應(yīng)著兩條序列不同的編碼基因，且結(jié)構(gòu)分析表明兩蛋白有不同的膜定位特征，兩基因在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的表達(dá)模式也有區(qū)別，這也印證了鏈狀亞歷山大藻基因組的復(fù)雜性，提示了基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性。系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果顯示， Cad-1和Cad-2先與顆石藻和抑食金球藻銅胺氧化酶聚為一小支，再與圓柱擬脆桿藻和萊茵衣藻銅胺氧化酶聚為一支，其它綠藻、紅藻、藍(lán)藻、微擬球藻和玉米聚為一支，表明CuAO的進(jìn)化與物種進(jìn)化關(guān)系基本一致。

Moschou等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在多胺氧化酶過(guò)表達(dá)的煙草中，增加的H2O2引發(fā)了嚴(yán)重的細(xì)胞程序性死亡；而在多胺氧化酶下調(diào)表達(dá)的煙草中，植物體H2O2的含量較少，表現(xiàn)出很少的細(xì)胞程序性死亡。Hiroshi等[11]發(fā)現(xiàn)，植物中多胺氧化酶是參與細(xì)胞程序性死亡的關(guān)鍵酶。有研究表明，赤潮消亡是一種細(xì)胞程序性死亡的過(guò)程[13-16]。馬金華等從細(xì)胞生理狀態(tài)變化的角度研究發(fā)現(xiàn)，衰亡期的鏈狀亞歷山大藻可溶性蛋白質(zhì)含量下降，超氧化物岐化酶活性顯著增加，丙二醛、H2O2含量增加，且出現(xiàn)了明顯的DNA ladder，表明鏈狀亞歷山大藻赤潮的衰亡是一種細(xì)胞程性序死亡的過(guò)程[28]。本文研究了銅胺氧化酶基因在鏈狀亞歷山大藻不同生長(zhǎng)時(shí)期表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示，相比延遲期，cad-1的相對(duì)表達(dá)量在對(duì)數(shù)期顯著下調(diào)，在衰亡期顯著上調(diào)；cad-2在不同時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量與cad-1一致。綜合馬金華等[28]的結(jié)果發(fā)現(xiàn)(對(duì)數(shù)期鏈狀亞歷山大藻細(xì)胞H2O2含量較低，衰亡期H2O2含量顯著增加)和本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，鏈狀亞歷山大藻銅胺氧化酶基因的表達(dá)量在對(duì)數(shù)期顯著下降，細(xì)胞H2O2含量較低，衰亡期銅胺氧化酶基因的表達(dá)量顯著增加，細(xì)胞H2O2含量也顯著增加，這與Moschou等[26]的發(fā)現(xiàn)一致。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，銅胺氧化酶可能參與了鏈狀亞歷山大藻衰亡過(guò)程的調(diào)控。

4 小結(jié)

本文從鏈狀亞歷山大藻中克隆了兩個(gè)銅胺氧化酶的基因cad-1和cad-2，cad-1的開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)為1 023 bp，編碼340個(gè)氨基酸；cad-2開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)為1 800 bp，編碼599個(gè)氨基酸。兩個(gè)基因編碼的蛋白含有保守結(jié)構(gòu)域“NYDY”。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，鏈狀亞歷山大藻與顆石藻和抑食金球藻的CuAO親緣關(guān)系較近。cad-1和cad-2在對(duì)數(shù)期和衰亡期分別下調(diào)和上調(diào)表達(dá)，依據(jù)銅胺氧化酶的功能和與鏈狀亞歷山大藻衰亡相關(guān)的生理研究，推測(cè)銅胺氧化酶可能參與鏈狀亞歷山大藻赤潮衰亡過(guò)程的調(diào)控。