米鐵柱， 張 梅， 甄 毓??

(1. 中國海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100； 2.中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100； 3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071)

微藻是十分重要的生物資源，在生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，具有很高的生態(tài)價值。同時，微藻種質(zhì)資源豐富，且具有分布廣泛、種類眾多、數(shù)量龐大、繁殖迅速等特點(diǎn)，因而，其可觀的經(jīng)濟(jì)利用價值和巨大的開發(fā)潛力受到了科學(xué)界的廣泛關(guān)注。目前對微藻的開發(fā)利用主要包括生物活性物質(zhì)、生物柴油、功能性飼料、抗腫瘤藥物以及藻類處理污水等幾個方面[1-5]。其中，生物柴油以及生物活性物質(zhì)中的多不飽和脂肪酸的開發(fā)利用都與微藻的脂肪酸生物合成密切相關(guān)。

脂肪酸生物合成是生物的基本生理過程之一，在生命過程中起著至關(guān)重要的作用。作為細(xì)胞的重要組分之一，生物體中的脂肪酸大部分以結(jié)合態(tài)存在，少量游離在細(xì)胞中。脂肪酸不僅可以作為重要的儲能物質(zhì)存在于細(xì)胞中，而且對植物的組織結(jié)構(gòu)和功能十分重要。研究表明脂肪酸在防止機(jī)械損傷、植物抗寒性、細(xì)胞識別、特異性和組織免疫等方面也起到了積極的作用[6]。綜上所述，研究微藻的脂肪酸生物合成途徑不僅具有生態(tài)學(xué)和經(jīng)濟(jì)學(xué)意義，而且有助于我們更加深入地了解微藻的生理學(xué)特征。本文主要就國內(nèi)外微藻脂肪酸生物合成的研究進(jìn)展展開討論，以期為后續(xù)研究提供一定參考。

1 微藻脂肪酸生物合成途徑解析

2007年，萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)基因組的成功測序首次向人們展示了微藻的基因藍(lán)圖，這一發(fā)現(xiàn)有助于對藻類代謝工程進(jìn)行更深入的研究[7]?；蚪M測序不僅能揭示物種的遺傳機(jī)制，找到功能相關(guān)的特異基因，也是分子生物學(xué)研究的前提。目前，已完成基因組測序的真核微藻至少有20種[8-11]，如表1所示。另外，隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)已在微藻的生理生化研究中廣泛應(yīng)用。通過對微藻的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測序，利用多種數(shù)據(jù)庫對微藻的測序結(jié)果進(jìn)行注釋，能在沒有微藻基因組信息的情況下對其基因組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的解析，得到參與不同代謝途徑的編碼基因，在此基礎(chǔ)上，可以對微藻的多種代謝途徑進(jìn)行解析，其中，包括微藻脂肪酸的生物合成途徑。

基于基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)微藻脂肪酸的生物合成途徑包括3個方面：脂肪酸的從頭合成、碳鏈的延伸以及不飽和脂肪酸的生成。脂肪酸的從頭合成發(fā)生在葉綠體中，其起始于乙酰-CoA羧化酶(acetyl-CoA carboxylase, ACCase)催化乙酰-CoA生成丙二酰-CoA，這一步被認(rèn)為是微藻脂肪酸生物合成的限速步驟[12]。正因?yàn)槿绱耍珹CCase 已成為致力于提高微藻脂肪酸產(chǎn)量的關(guān)鍵酶。接下來，丙二酰-CoA在丙二酰-CoA:ACP轉(zhuǎn)酰酶(malonyl-CoA:ACP transacylase, MCAT)的作用下被加載到?；d體蛋白(acyl carrier protein, ACP)上。隨后，β-酮酰-ACP合酶III(beta-ketoacyl-ACP synthase III, KASIII)催化丙二酰-ACP與乙酰-CoA 發(fā)生縮合反應(yīng)生成乙酰乙酰-ACP。之后，其在β-酮酰-ACP還原酶(beta-ketoacyl-ACP reductase, KAR)、β-酮酰-ACP脫水酶(beta-hydroxyacyl-ACP dehydratase, HAD)以及烯酰-ACP還原酶(enoyl-ACP reductase, EAR)的作用下被充分還原成丁酰-ACP。在之后的反應(yīng)中，丁酰-ACP和另1分子的丙二酰-ACP作為新的底物，進(jìn)行新一輪的縮合、還原反應(yīng)，如此循環(huán)6次或7次，最終生成C16:0-ACP或 C18:0-ACP。其中，與第一輪反應(yīng)不同的是，KASI催化C6至C16產(chǎn)物的生成，KASII催化C18產(chǎn)物的生成。

表1 已完成基因組測序的微藻

基于基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)微藻脂肪酸的生物合成途徑包括3個方面：脂肪酸的從頭合成、碳鏈的延伸以及不飽和脂肪酸的生成。脂肪酸的從頭合成發(fā)生在葉綠體中，其起始于乙酰-CoA羧化酶(acetyl-CoA carboxylase, ACCase)催化乙酰-CoA生成丙二酰-CoA，這一步被認(rèn)為是微藻脂肪酸生物合成的限速步驟[12]。正因?yàn)槿绱?，ACCase 已成為致力于提高微藻脂肪酸產(chǎn)量的關(guān)鍵酶。接下來，丙二酰-CoA在丙二酰-CoA:ACP轉(zhuǎn)酰酶(malonyl-CoA:ACP transacylase, MCAT)的作用下被加載到?；d體蛋白(acyl carrier protein, ACP)上。隨后，β-酮酰-ACP合酶III(beta-ketoacyl-ACP synthase III, KASIII)催化丙二酰-ACP與乙酰-CoA 發(fā)生縮合反應(yīng)生成乙酰乙酰-ACP。之后，其在β-酮酰-ACP還原酶(beta-ketoacyl-ACP reductase, KAR)、β-酮酰-ACP脫水酶(beta-hydroxyacyl-ACP dehydratase, HAD)以及烯酰-ACP還原酶(enoyl-ACP reductase, EAR)的作用下被充分還原成丁酰-ACP。在之后的反應(yīng)中，丁酰-ACP和另1分子的丙二酰-ACP作為新的底物，進(jìn)行新一輪的縮合、還原反應(yīng)，如此循環(huán)6次或7次，最終生成C16:0-ACP或 C18:0-ACP。其中，與第一輪反應(yīng)不同的是，KASI催化C6至C16產(chǎn)物的生成，KASII催化C18產(chǎn)物的生成。

當(dāng)一個成熟的脂肪酸到達(dá)自己特定的長度時，它可以通過原核途徑保留在質(zhì)體中，質(zhì)體中的脂酰-ACP與甘油-3-磷酸在?；D(zhuǎn)移酶的作用下生成磷脂酸及其相應(yīng)的衍生物。脂肪酸也可以通過真核途徑輸送到細(xì)胞溶質(zhì)中，脂酰-ACP在硫脂酶(thioesterase, TEs)的水解作用下釋放出游離的脂肪酸。隨后，游離脂肪酸會擴(kuò)散到質(zhì)體內(nèi)膜上并在脂酰-CoA合成酶(acyl-CoA synthetase, ACS)的作用下轉(zhuǎn)換成脂酰-CoA，接著脂酰-CoA從質(zhì)體內(nèi)膜上釋放到細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的脂酰-CoA延長酶(acyl-CoA elongase, ACE)可以催化脂酰-CoA產(chǎn)生更長碳鏈的脂肪酸，其延長機(jī)制與脂肪酸的從頭合成相似，但碳鏈延伸的供體為丙二酰-CoA。與葉綠體相對應(yīng)的是，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上存在另外一種?；D(zhuǎn)移酶，該酶以脂酰-CoA為原料，通過真核途徑合成磷脂酸以及相應(yīng)的衍生物。脂肪酸與甘油-3-磷酸結(jié)合形成甘油酯后，脂肪酸仍可進(jìn)一步進(jìn)行加工，葉綠體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上存在一系列的脂肪酸去飽和酶，每個去飽和酶在脂肪酸的特定部位產(chǎn)生雙鍵，在這些酶的作用下，最終產(chǎn)生不飽和脂肪酸(見圖1)。

(該圖為本文作者繪制，實(shí)線箭頭表示單次反應(yīng)，虛線箭頭表示多次反應(yīng)，圖中×6和×7表示反應(yīng)循環(huán)次數(shù)。The Figure is drawn by the author, Solid arrows indicate a single reaction, and dotted arrows indicate many reactions. In the Figure, ×6 and ×7 are the cycle times.)

圖1 微藻脂肪酸合成示意圖

Fig.1 The sketch map of fatty acid biosynthesis in microalgae

2 影響微藻脂肪酸生物合成的因素

研究發(fā)現(xiàn)，微藻脂肪酸的含量和組成因物種以及環(huán)境因子的不同而不同(見表2)。影響脂肪酸含量和成分的環(huán)境因子主要有化學(xué)因素和物理因素兩種。化學(xué)因素主要指的是微藻生長時的營養(yǎng)條件，目前相關(guān)的研究主要集中在碳、氮、磷、硅以及鐵5種元素上。物理因素則主要包括光照強(qiáng)度、溫度、pH以及鹽度等。

2.1 化學(xué)因素對微藻脂肪酸合成的影響

表2 部分微藻的產(chǎn)油情況以及優(yōu)化的培養(yǎng)方式

微藻具有多種不同的營養(yǎng)方式，大多數(shù)是以光合自養(yǎng)的方式生長，也有部分微藻具有利用外加有機(jī)物進(jìn)行異養(yǎng)生長的能力。能被微藻利用的有機(jī)物種類較多，目前研究最多的主要包括有機(jī)酸、氨基酸、糖類以及醇類等。劉平懷等[17]利用4種不同有機(jī)碳源對單針藻(Monoraphidiumsp.)進(jìn)行混合營養(yǎng)培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，葡萄糖和蔗糖對Monoraphidiumsp.總脂的積累具有明顯的促進(jìn)作用，而甘氨酸和乙酸鈉則表現(xiàn)為抑制作用。這說明碳源種類不同，微藻所作出的生理響應(yīng)也會相應(yīng)不同，從而導(dǎo)致藻細(xì)胞總脂積累的差異。

2.1.2 氮元素 氮元素是微藻進(jìn)行正常的生命活動所必需的化學(xué)元素，不同種類的氮源以及氮源濃度都會影響微藻的生長情況、脂肪酸的含量和組成。Ruangsomboon[18]利用相同濃度的4種氮源(KNO3、NaNO3、CH4N2O以及NH4HCO3)對布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)進(jìn)行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，以KNO3為氮源的培養(yǎng)體系的生物量以及脂肪酸含量明顯高于其它3種，并且4種不同氮源條件下脂肪酸的組成也顯示出較大差異。對于4種小球藻Chlorellazofingiensis、C.vulgaris、Chlorellasorokiniana、Chlorellaprotothecoides以及微擬球藻(Nannochloropsissp. F&M-M24)在內(nèi)的一些微藻而言，如果處于氮限制培養(yǎng)條件時，微藻會表現(xiàn)出脂肪酸過量積累的現(xiàn)象[19-23]，但是對四鞭片藻(TetraselmissuecicaF&M-M33)等一些微藻來說，氮限制只會小幅度提高脂肪酸生產(chǎn)量，甚至造成脂肪酸含量的顯著降低[20]。氮限制可以促進(jìn)脂肪酸積累，但會影響微藻細(xì)胞正常的生長、發(fā)育和繁殖。因此，僅靠氮限制來獲取足夠的脂肪酸生產(chǎn)這個方法并不可行。研究者試圖用兩步培養(yǎng)法來獲取足夠的脂肪酸生產(chǎn)。首先將微藻在最適的生長條件下培養(yǎng)至指數(shù)后期，之后將微藻置于氮限制或無氮源的體系中培養(yǎng)。通過分析發(fā)現(xiàn)，上述培養(yǎng)方式可以促進(jìn)脂肪酸生產(chǎn)量的增加[18,24-25]。

現(xiàn)有理論認(rèn)為，當(dāng)?shù)闯渥銜r，微藻細(xì)胞生長旺盛，能夠正常合成蛋白、核酸以及脂肪酸等有機(jī)質(zhì)。而在氮限制培養(yǎng)的初期，微藻尚能進(jìn)行正常的光合作用，細(xì)胞內(nèi)的碳源比較充足，但由于氮元素的缺乏導(dǎo)致細(xì)胞無法合成相關(guān)的蛋白質(zhì)和核酸，脂肪酸的合成過程不受氮元素的限制，促使主要的碳代謝流轉(zhuǎn)向脂肪酸的生物合成[26]。

2.1.3 磷元素 磷元素在微藻生長過程起著重要的作用，對維持細(xì)胞膜的完整性、發(fā)揮細(xì)胞機(jī)能具有重要意義。同時，磷元素還參與細(xì)胞體內(nèi)DNA、RNA、ATP、NADP及磷脂等物質(zhì)的生成[27-28]。Li等[29]利用不同濃度梯度的正磷酸鹽對月形藻(Scenedesmussp.)培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)磷的濃度在0.2～2 mg/L的范圍時，油脂含量占微藻干重的25%左右。但當(dāng)磷的濃度處于限制(0.1 mg/L)時，微藻細(xì)胞的油脂積累能力大幅度提高，油脂含量高達(dá)細(xì)胞干重的53%。Feng等[30]利用兩種培養(yǎng)基對小球藻(C.zofingiensis)進(jìn)行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，缺磷培養(yǎng)基中微藻的油脂積累能力明顯高于富磷培養(yǎng)基。研究者利用富氮(缺氮)—富磷(磷限制或缺磷)6種不同營養(yǎng)結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)基對斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)進(jìn)行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)為缺氮—富磷時，S.obliquus的油脂積累能力達(dá)到最大[31]。Pistocchi等[32]發(fā)現(xiàn)曲殼藻(Achnanthesbrevipes)、細(xì)柱藻(Cylindrothecafusiformis)、擬菱形藻(Pseudonitzschiasp.)以及中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)在磷限制條件下，多不飽和脂肪酸占總脂肪酸的比例下降，而單不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸所占比例則有所提高。尹遜棟等[33]對4種海洋微藻的研究表明，氮限制和磷限制均會促進(jìn)微藻總脂含量的增加，但磷限制比氮限制的影響更為顯著。因?yàn)槲⒃宸N類、實(shí)驗(yàn)條件以及操作方法的不同，不同研究之間微藻脂肪酸的生產(chǎn)率存在很大的變化。在之前的報(bào)道中，主要將精力集中在氮元素對微藻脂肪酸積累的研究上，而忽略了對磷元素的研究。因此，后續(xù)應(yīng)該加強(qiáng)磷元素對微藻脂肪酸積累的研究。

2.1.4 鐵元素 對光合生物而言，鐵元素是葉綠體電子傳遞系統(tǒng)一個重要的輔助因子[34]，它會影響光合器官碳固定、電子傳遞以及光利用的能力[35-37]。鐵元素的缺乏會導(dǎo)致植物光合活性、耗氧量以及生長速率的降低[38-40]。Liu等[41]利用不同濃度梯度的FeCl3對C.vulgaris進(jìn)行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，其在在高鐵培養(yǎng)基中的油脂積累能力明顯高于低鐵培養(yǎng)基。研究發(fā)現(xiàn)C.sorokiniana[42]、Monoraphidiumsp. FXY-10[43]、S.obliquus[44]等微藻在高鐵培養(yǎng)基中的油脂積累能力也明顯高于低鐵培養(yǎng)基。與上述結(jié)果相反的是，鐵濃度增加會提高C.reinhardtii的細(xì)胞密度和生長速率，但卻抑制了其油脂的積累，這表明鐵元素對不同種類微藻碳源流向的調(diào)控存在一定差異[45]。通過不同濃度的FeSO4對三角褐指藻(Phacodactylumtricornutum)培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，不同鐵濃度對其脂肪酸的含量影響顯著，隨著鐵濃度的升高，P.tricornutum的脂肪酸含量呈先上升后下降的趨勢[46]。這說明鐵濃度過高并不能繼續(xù)促進(jìn)微藻油脂的積累，反而會抑制脂肪酸的合成。

2.1.5 硅元素 硅元素是硅藻生長所必需的營養(yǎng)元素，其不但參與硅藻細(xì)胞壁的構(gòu)成，還參與蛋白質(zhì)、DNA、光合色素等的生物合成以及細(xì)胞分裂等多種代謝途徑和生長過程[47]。研究發(fā)現(xiàn)，硅缺乏會引起脂肪酸生物合成過程中起關(guān)鍵作用的乙酰-CoA羧化酶活性的增強(qiáng)，促使主要的碳代謝流轉(zhuǎn)向細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的生物合成，同時，細(xì)胞內(nèi)之前合成的非脂化合物也可以逐漸轉(zhuǎn)化為脂類，在上述過程的雙重作用下，促使微藻細(xì)胞內(nèi)脂肪酸含量的增加[48-49]。程軍等人[50]通過研究纖細(xì)角毛藻(Chaetocerosgracilis)和新月細(xì)柱藻(Cylindrothecaclosterium)兩種硅藻發(fā)現(xiàn)，在缺氮缺硅條件下適當(dāng)延長收獲時間能夠顯著提高兩種微藻的油脂含量，造成上述現(xiàn)象的原因可能是硅藻光合作用生成的有機(jī)物更多的轉(zhuǎn)向了脂肪酸合成，而在缺氮情況下生成的蛋白質(zhì)的量相對的減少。

2.2 物理因素對微藻脂肪酸合成的影響

2.2.1 光照強(qiáng)度 光照是微藻生長、發(fā)育以及繁殖的能量來源，當(dāng)光照強(qiáng)度適宜時，能促進(jìn)微藻進(jìn)行光合作用，從而使更多的碳代謝流轉(zhuǎn)向蛋白質(zhì)以及脂肪酸等物質(zhì)的生物合成。Ra等[51]利用紅、藍(lán)、紫、綠4種不同顏色的發(fā)光二極管(LEDs)以及日光燈作為光源對綠藻Picochlorumatomus進(jìn)行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)光源為LEDs時，微藻的生物量以及脂肪酸含量明顯高于日光燈。其中，當(dāng)光源為紅色LEDs時，微藻的生物量最大，而當(dāng)光源為綠色LEDs時，微藻的脂肪酸積累能力最強(qiáng)。因此，研究者決定通過兩步光照培養(yǎng)法來提高P.atomus脂肪酸的收獲量，首先使用紅色LEDs作為光源來獲得微藻的最大生物量，其次利用綠色LEDs作為光源來促進(jìn)微藻的脂肪酸積累。另有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)藍(lán)色LEDs作為光源時，Chlorellasp.的脂肪酸積累能力最強(qiáng)[52]。這說明微藻種類不同，促進(jìn)微藻脂肪酸進(jìn)行最大積累的光源種類也可能有區(qū)別。Goold等[53]發(fā)現(xiàn)C.reinhardtii在持續(xù)光照條件下三酰甘油的生產(chǎn)率明顯高于氮限制培養(yǎng)條件，這表明持續(xù)光照有可能是促進(jìn)微藻脂肪酸大規(guī)模生產(chǎn)的關(guān)鍵要素。

大量研究表明，在一定的光照強(qiáng)度范圍內(nèi)，微藻脂肪酸的積累能力隨著光照強(qiáng)度的升高而增強(qiáng)；而當(dāng)光照強(qiáng)度過飽和時，細(xì)胞內(nèi)參與光合作用的細(xì)胞器受到光氧化損傷，繼而影響對光的吸收能力和利用效率，造成微藻脂肪酸合成率的降低。Ra等[54]利用綠色發(fā)光二極管作為光源培養(yǎng)3種微擬球藻NannochloropsisOculata、NannochloropsisOceanica以及Nannochloropsissalina后發(fā)現(xiàn)，這3種微擬球藻脂肪酸的積累能力都隨著光照強(qiáng)度的升高呈現(xiàn)出先升后降的趨勢。同時，該研究還發(fā)現(xiàn)，上述3種微藻進(jìn)行油脂最大積累的最適光照強(qiáng)度為100 μmol·m-2·s-1。但對于月形藻(Scenedesmussp. 11-1)而言，利于其脂肪酸積累的最適光強(qiáng)大約為250 μmol·m-2·s-1[55]。這說明微藻種類不同，促進(jìn)微藻脂肪酸進(jìn)行最大積累的光照強(qiáng)度也可能會有區(qū)別。

2.2.2 溫度 溫度是影響酶活的重要因素之一，酶活性的變化會對微藻生物質(zhì)產(chǎn)量、脂肪酸積累等生理過程產(chǎn)生一定的影響。溫度脅迫能夠強(qiáng)烈影響微藻對營養(yǎng)元素的利用以及對CO2的固定作用，進(jìn)而導(dǎo)致藻細(xì)胞生長速率、脂肪酸含量和組成發(fā)生變化[56]。研究表明，在一定的溫度范圍內(nèi)，微藻的脂肪酸積累能力隨著溫度的升高而加強(qiáng)，當(dāng)超過最適溫度時，脂肪酸的積累能力隨之減弱。然而，溫度對微藻脂肪酸積累的影響因種而異，四尾柵藻(Scenedesmusquadricauda)和C.vulgaris的脂肪酸積累最適溫度為30℃，小型黃絲藻(Tribonemaminus)在25和35 ℃下的油脂積累能力相當(dāng)，而月形藻(Scenedesmussp. LX1)在20℃下的脂肪酸積累能力最強(qiáng)[57-59]。溫度是影響微藻脂肪酸組成的重要因素之一，Vince等[60]發(fā)現(xiàn)不同的溫度條件下3種小球藻的脂肪酸組成和含量都有所差別。通常情況下，溫度降低可以促進(jìn)微藻不飽和脂肪酸的生成，而溫度升高則有助于提高飽和脂肪酸的含量，但研究者發(fā)現(xiàn)改變溫度對小球藻Chlorellasp. MACC-728的脂質(zhì)產(chǎn)量和脂肪酸甲酯的組成并沒有顯著的影響[60-62]。研究發(fā)現(xiàn)，一些微藻生長和脂肪酸積累的最適溫度并不一致，為了解決上述矛盾，可以利用微藻在最適生長溫度下積累生物量而在最適脂肪酸積累溫度下積累脂肪酸的特點(diǎn)，采用兩步溫度培養(yǎng)法促使微藻的脂肪酸積累達(dá)到最大，即微藻先在最適生長溫度條件下積累生物量，培養(yǎng)一定時期后再轉(zhuǎn)移至最適脂肪酸積累溫度條件下積累脂肪酸。

2.2.3 鹽度 能生存于較大鹽度范圍的生物稱為廣鹽性生物，反之為狹鹽性生物。鹽度較大幅度變化時，因?yàn)闈B透作用的關(guān)系，細(xì)胞可能萎縮或漲破。生活在不同水體環(huán)境中的微藻都能產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物(多糖、油脂、小分子蛋白等)來維持與外界環(huán)境的滲透壓平衡[59]。因此，培養(yǎng)體系中鹽度的改變可能會造成微藻細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的含量和組成發(fā)生變化。小球藻C.sorokinianaHS1能夠在高鹽度的環(huán)境中生存，當(dāng)培養(yǎng)液中NaCl濃度從0 g/L上升到60 g/L(鹽度為60)時，微藻細(xì)胞內(nèi)油脂的含量隨NaCl濃度的升高呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，其中，當(dāng)NaCl的濃度為30 g/L時，微藻油脂的積累能力最強(qiáng)[63]。對雙眉藻(Amphorasubtropica)和杜氏藻(Dunaliellasp.)的研究表明，當(dāng)培養(yǎng)液中NaCl的濃度從0.5 mol/L上升至2 mol/L時，2種微藻飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸的含量均有所增加，而多不飽和脂肪酸所占比例則相應(yīng)減小[64]。研究表明，部分微藻在較低鹽度下生長較好，而在較高鹽度則有利于微藻脂肪酸的積累。因此，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的鹽度可以促進(jìn)微藻脂肪酸積累。

2.3 其他因素

除上訴因素外，維生素、植物生長激素、微量元素、接種密度、溶解氧、通氣速率以及生物反應(yīng)器的類型等也是微藻培養(yǎng)過程中要考慮的關(guān)鍵因素，其對微藻生物質(zhì)生產(chǎn)和脂肪酸積累具有重要的影響[68]。

3 微藻脂肪酸生物合成基因工程研究進(jìn)展

微藻通常在生長繁殖速率受限的條件下才能促進(jìn)脂肪酸的最大積累，所以，很難實(shí)現(xiàn)微藻生長繁殖和脂肪酸大量積累的同步提高。因此，微藻脂肪酸的產(chǎn)業(yè)開發(fā)仍需尋找新的途徑去解決。隨著測序技術(shù)的逐漸發(fā)展，基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)以及代謝組學(xué)等組學(xué)技術(shù)的相繼出現(xiàn)使得我們對微藻脂肪酸生物合成的機(jī)理有了一定的認(rèn)識，在此基礎(chǔ)上，可以對已經(jīng)進(jìn)行基因測序的微藻進(jìn)行基因操縱，從而改變微藻細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的含量和組成(表3為微藻脂肪酸生物合成基因工程的部分實(shí)例)。

3.1 藍(lán)藻脂肪酸合成的基因工程

藍(lán)藻是可以進(jìn)行光合作用的原核生物，又叫藍(lán)綠藻或藍(lán)細(xì)菌。在藻類生物中，藍(lán)藻是結(jié)構(gòu)最簡單、最原始的單細(xì)胞生物。因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)簡單，藍(lán)藻比真核藻類更容易進(jìn)行基因操作，并可以操控游離脂肪酸分泌到培養(yǎng)基中，這個培養(yǎng)體系可以減少微藻脂肪酸收獲、脫水以及提取的經(jīng)濟(jì)成本。正因?yàn)槿绱?，藍(lán)藻脂肪酸合成工程以及游離脂肪酸分泌的研究逐漸成為科學(xué)界研究的熱點(diǎn)[69]。2009年，研究者首次利用基因插入技術(shù)將植物的脂肪酸合成酶成功轉(zhuǎn)入五代突變藻株集胞藻(Synechocystissp. PCC 6803)中，通過研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)藻細(xì)胞密度為1.5×108cells/mL時，其能以每天(133±12) mg/L的產(chǎn)量分泌脂肪酸[70]。Liu等[71]在五代突變菌株Synechocystissp. PCC 6803的基礎(chǔ)上對其進(jìn)行第六代改良后發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞密度增加到1.0×109cells/mL的情況下，其脂肪酸的分泌速率增加到(197±14) mg/L。然而，研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)藻的脂肪酸含量較低，從經(jīng)濟(jì)可行性出發(fā)，如若進(jìn)行大規(guī)模的脂肪酸生產(chǎn)以及使用，目前還存在一定的困難。

表3 微藻脂肪酸生物合成基因工程的部分實(shí)例

3.2 真核微藻脂肪酸合成的基因工程

與藍(lán)藻相比，真核微藻的油脂含量較高，一般情況下，富油微藻的油脂含量可達(dá)其干重的30%～50%，美國水生物種項(xiàng)目(Aquatic Species Program, ASP)篩選的富油藻種中，多為硅藻和綠藻。為了有效促進(jìn)微藻的脂肪酸生物合成，我們必須對微藻的脂肪酸合成途徑進(jìn)行詳細(xì)的生化研究并闡明其固有的調(diào)控模式。目前，國內(nèi)外研究的內(nèi)容主要包括ACCase基因和TEs基因兩個方面。在植物的脂肪酸合成步驟中，ACCase被認(rèn)為是第一個關(guān)鍵限速酶。研究發(fā)現(xiàn)從小環(huán)藻(Cyclotellacryptica)和球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)中純化得到的ACCase的動力學(xué)特征與其他植物的ACCase相似[72-73]；研究者利用基因槍技術(shù)將C.cryptica的ACCase基因在C.cryptica和舟形藻(Naviculasaprophila)中過量表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，ACCase基因的過量表達(dá)沒有造成兩種微藻脂肪酸生產(chǎn)量的增加[74]。上述現(xiàn)象的產(chǎn)生可能與脂肪酸生物合成途徑的反饋抑制有關(guān)，ACCase活性雖然增強(qiáng)但是被其他代謝途徑所抵消，導(dǎo)致脂肪酸的含量沒有明顯提高。研究已經(jīng)證實(shí)甘藍(lán)型油菜中的ACCase對聚山梨酸酯的生成具有抑制作用[75]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在不同的生長周期和營養(yǎng)條件下，Chromeravelia和Isochrysisaff.galbana兩種微藻細(xì)胞中ACCase表達(dá)量的變化并不一定會引起脂肪酸積累的變化[76]，這說明ACCase酶并不是影響微藻脂肪酸生物合成的唯一調(diào)控因素。

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將TEs轉(zhuǎn)入到微藻細(xì)胞是一個可以改變脂肪酸成分的有效方法，因?yàn)門Es的作用是使脂肪酸碳鏈的延伸得以終止，它從功能上決定了脂肪酸生物合成的最終產(chǎn)物。高等植物的TEs具有高度的特異性和底物選擇性，例如，F(xiàn)atA TEs作用于C18:1-ACP，而FatB TEs則作用于一系列飽和的?；?ACP(C8-C14)[77]。與植物TEs相比，微藻TEs沒有顯示出高度的特異性和底物選擇性。例如，C.reinhardtii的基因組測序顯示CrTE是其基因組中發(fā)現(xiàn)的唯一的脂肪酸TEs，而研究卻發(fā)現(xiàn)C.reinhardtii生產(chǎn)的脂肪酸則是由多種不同長度以及不同飽和度的脂肪酸組成，這證明CrTE可以作用于一系列的脂?；?ACP碳鏈[78]。在綠藻C.reinhardtii葉綠體中過量表達(dá)內(nèi)源性CrTE基因后發(fā)現(xiàn)脂肪酸的碳鏈變短，同時肉豆蔻酸(C14:0)的生產(chǎn)量也有所增加，研究者認(rèn)為肉豆蔻酸生產(chǎn)量增加的原因可能是葉綠體中CrTE和脂?；?ACP之間化學(xué)計(jì)量的平衡被打破，從而使脂?；?ACP過早的發(fā)生了水解[79]。與之相反的是，在P.tricornutum中過量表達(dá)內(nèi)源性PtTE基因并沒有改變脂肪酸的組成[80]。最近的一些研究也嘗試將高等植物的TEs利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)入到真核藻類中去改變微藻的脂肪酸組成。通過基因工程的方法將加州月桂的FatB TEs(C12:0)基因和香樟的FatB TEs(C14:0)基因轉(zhuǎn)入到P.tricornutum中發(fā)現(xiàn)，脂肪酸的合成向理想的短鏈表型方向轉(zhuǎn)變，其中，C12:0的含量增加了6.2%，而C14:0增加了15%[81]，而將加州月桂和萼距花的TEs轉(zhuǎn)入到C.reinhardtii的葉綠體中并沒有觀察到脂肪酸組成的改變[79,82]。上述研究表明改變微藻的脂肪酸組成并不簡單，我們有必要進(jìn)一步發(fā)掘微藻脂肪酸生物合成的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制，從而有效改變微藻細(xì)胞脂肪酸的組成。

4 總結(jié)與展望

通過上述研究發(fā)現(xiàn)，提高微藻的脂肪酸含量可以通過環(huán)境因素調(diào)控和基因工程兩種方式來進(jìn)行。環(huán)境因素調(diào)控雖然會促進(jìn)微藻脂肪酸的積累，但大多是以犧牲細(xì)胞生長和增殖為代價的，因此需要對培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化以保證微藻可以正常生長繁殖。目前，科學(xué)界已經(jīng)對微藻的脂肪酸合成機(jī)制有了一定的認(rèn)識，在此基礎(chǔ)上，我們可以對微藻進(jìn)行基因工程操作。但脂肪酸的合成機(jī)制非常復(fù)雜，簡單的操縱一個基因或者幾個基因很難達(dá)到理想的效果，因而需要全面了解微藻脂肪酸的內(nèi)在合成機(jī)制。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)的快速發(fā)展，為全面了解微藻脂肪酸的內(nèi)在合成機(jī)制提供了可能。前期研究中，筆者對瑪氏骨條藻Skeletonemamarinoi不同生長時期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，構(gòu)建了S.marinoi的脂肪酸生物合成途徑，其與微藻脂肪酸合成示意圖(見圖1)基本一致；同時發(fā)現(xiàn)了一些與脂肪酸生物合成相關(guān)的編碼基因，如乙酰-CoA羧化酶基因、丙二酰-CoA:ACP轉(zhuǎn)酰酶基因以及硫脂酶基因等。通過分析S.marinoi不同生長時期脂肪酸合成途徑中的基因表達(dá)后推測，S.marinoi在穩(wěn)定期和衰亡期的脂肪酸合成能力高于指數(shù)期。造成上述結(jié)果的可能原因是微藻生長進(jìn)入穩(wěn)定期后，培養(yǎng)基中N和P等營養(yǎng)元素逐漸被耗盡，使微藻的生長處于營養(yǎng)限制條件下，從而導(dǎo)致S.marinoi脂肪酸的積累能力加強(qiáng)。后續(xù)研究可以從兩個方面對S.marinoi脂肪酸合成的分子機(jī)制進(jìn)行探索。首先可通過測定S.marinoi不同生長時期脂肪酸含量和組成來對前期研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，其次可利用相對定量的方法對不同實(shí)驗(yàn)條件下S.marinoi脂肪酸生物合成途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)進(jìn)行分析，研究其在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控途徑，進(jìn)而對不同實(shí)驗(yàn)條件下的S.marinoi進(jìn)行蛋白組分析，以期從多個層次來解釋S.marinoi脂肪酸合成的內(nèi)在分子機(jī)制。

現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展使了解和改造微藻的脂肪酸合成途徑成為可能，但要實(shí)現(xiàn)微藻脂肪酸的工業(yè)化生產(chǎn)，目前還存在很多困難。值得關(guān)注的是，高等植物的脂肪酸生物合成相關(guān)研究已經(jīng)取得了重要進(jìn)展，為微藻的脂肪酸合成研究提供了很好的借鑒，相信未來微藻脂肪酸生物合成研究一定會取得更大進(jìn)步。