沙 洪 ，趙 東 ，廖東華 ，仝小林 ，Hans Gregersen，趙靜波

（1.中日友好臨床醫(yī)學(xué)研究所 臨床醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)與項(xiàng)目管理平臺，北京100029；2.Department of Clinical Medicine，Aarhus University， 8200 Aarhus N，Denmark；3.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶 400044；4.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053）

國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）2015年發(fā)布，全世界范圍有4.15億人患有糖尿病，中國占1.1億人，糖尿病已成為影響國民健康重大公共衛(wèi)生問題[1]。糖尿病并發(fā)胃腸道功能紊亂（DGID）發(fā)病率高達(dá)75%，與非糖尿病狀態(tài)下單純的胃腸道節(jié)律失常完全不一樣，療效不佳[2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究尚不能完全闡明DGID的發(fā)病機(jī)制。本研究通過檢測鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠空腸腸壁腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 （brain-derived neurotrophic factor，BDNF）及其受體TrkA和TrkB表達(dá)變化，分析腸壁形態(tài)學(xué)和生物力學(xué)重構(gòu)的相關(guān)性，探討DGID發(fā)病可能機(jī)制及糖胃安作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑：鏈脲佐菌素（美國Sigma公司），一抗和二抗（美國Abcam公司），血糖試紙（美國強(qiáng)生公司），10%水合氯醛。實(shí)驗(yàn)動物：采用清潔級雄性SD大鼠 （動物生產(chǎn)許可證號SCXK （京）2009-0007）30 只，體重 220～250g，清潔級飼料。 中國藥品生物檢定所實(shí)驗(yàn)動物中心提供。糖胃安煎劑：中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院提供 （符合 《中國藥典》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)），制備成浸膏，4℃保存，臨用前稀釋。采用超高效液相色譜質(zhì)譜法測定化學(xué)組成，其主要成分柚皮甙、新橙皮甙、黨參炔苷、白術(shù)內(nèi)酯和大黃素。

1.2 方法

1.2.1 建立糖尿病模型實(shí)驗(yàn)

30只SD大鼠，10只設(shè)為對照組，20只注射鏈脲佐菌素（STZ）40mg/kg，造模成功后隨機(jī)分為糖尿病組和糖胃安治療組。

糖胃安組灌胃給藥，10g/kg/d，周期60d。24h大鼠禁食，4%水合氯醛麻醉。取空腸上段，測量長度和濕重。從近端切取腸壁組織環(huán)，用于無載荷和零應(yīng)力狀態(tài)的研究；剩余腸段用于沖壓實(shí)驗(yàn)。有關(guān)零應(yīng)力狀態(tài)研究，沖壓實(shí)驗(yàn)和普通組織學(xué)的研究方法和結(jié)果我們已發(fā)表[3]。

1.2.2 免疫組化染色

取10%福爾馬林固定小腸。酒精脫水，石蠟包埋，切片；60°C，60min；常規(guī)脫蠟；3%過氧化氫育10min，PBS沖洗抗原修復(fù)，滴加一抗，放入4°C冰箱過夜；二抗溫育40min；PBS沖洗，DAB液顯色約5～15min，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。

1.3 數(shù)據(jù)分析

BDNF、TrkA和TrkB陽性染色區(qū)域均為棕黃色。根據(jù)成色在組織中的分布，通過公式計(jì)算BDNF、TrkA和TrkB在黏膜、黏膜下層和肌層染色的面積百分比：染色面積百分比=免疫染色陽性面積/測量總面積采用Sigmascan Pro4.0（Jandel Scientific，德國）專業(yè)圖形處理軟件確定有效測定區(qū)域，根據(jù)染色強(qiáng)度閾值確定和區(qū)分免疫染色范圍和強(qiáng)度。利用Matlab程序 （MATLAB 7.1，The MathWorks公司，美國）計(jì)算BDNF、TrkA和 TrkB陽性染色面積比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SigmaPlot11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組資料間比較采用單因素方差分析，BDNF、TrkA和TrkB的表達(dá)與形態(tài)組織學(xué)和生物力學(xué)重構(gòu)參數(shù)的關(guān)系采用線性回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 體重和形態(tài)學(xué)指標(biāo)

表1示，糖尿病組的空腸腸段單位重量/體重，無載荷壁厚和橫截面積均顯著高于正常組（均P＜0.01）。糖胃安能顯著降低這些形態(tài)學(xué)參數(shù)（P＜0.05，P＜0.01）。

2.2 組織學(xué)測量指標(biāo)

表2示，糖尿病組與正常組比較，其空腸腸壁的各層厚度均顯著高于正常組（P＜0.05，P＜0.01）。糖胃安能顯著降低黏膜層和黏膜下層的厚度（P＜0.05，P＜0.01），但對肌層無顯著作用（P＞0.05）。

2.3 生物力學(xué)指標(biāo)

表3示，糖尿病組與正常組比較，其展開角、內(nèi)殘余應(yīng)變的絕對值，腸壁周向和軸向的常數(shù)a均顯著增高（均P＜0.05）。糖胃安處理能顯著降低展開角、內(nèi)殘余應(yīng)變的絕對值，周向和軸向硬度（均 P＜0.05）。

表1 空腸腸段形態(tài)學(xué)測量結(jié)果（±s）

表1 空腸腸段形態(tài)學(xué)測量結(jié)果（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與糖尿病組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

形態(tài)學(xué)測量指標(biāo) 正常組 糖尿病組 糖胃安組單位重量（g/cm）與體重（g）比 0.000237 ± 0.0000123 0.000719±0.0000401** 0.000389±0.0000637*#腸壁厚度 （mm） 1.07±0.06 1.34±0.06** 1.13±0.08*#腸壁橫截面積（mm2） 10.38±0.87 15.64±0.78** 11.42±.04*##

表2 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)腸壁各層厚度組織學(xué)測量結(jié)果（±s）

表2 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)腸壁各層厚度組織學(xué)測量結(jié)果（±s）

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與糖尿病組比較，#P<0.05。

腸壁厚度 正常組 糖尿病組 糖胃安組黏膜（μm） 518.92±64.69 852.76±69.21**697.64±64.73*#黏膜下層 （μm） 17.67±1.35 23.12±1.34* 16.92±1.64#肌層 （μm） 56.04±2.68 68.64±2.92* 68.47±2.37*

表3 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)生物力學(xué)指標(biāo)測量結(jié)果（±s）

表3 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)生物力學(xué)指標(biāo)測量結(jié)果（±s）

注：與正常組比較，*P<0.05；與糖尿病組比較，#P<0.05。

生物力學(xué)指標(biāo) 正常組 糖尿病組 糖胃安組展開角 （度） 103.4±18.6 142.1± 22.6* 91.6±16.8#內(nèi)壁殘余應(yīng)變 -0.23±0.04 -0.29± 0.02* -0.22±0.02#外壁殘余應(yīng)變 0.27±0.07 0.32± 0.11 0.29±0.06周向材料參數(shù) a 1.07±0.06 1.34± 0.06* 1.13±0.08#軸向材料參數(shù) a 10.38±0.87 15.64± 0.78* 11.42±1.04#

2.4 免疫組化分析結(jié)果

BDNF，TrkA和TrkB在空腸腸壁中的分布結(jié)果如圖1（見封二）和表4所示，黏膜、黏膜下層和肌層均有著色。糖尿病組與正常組相比，空腸腸壁各層BDNF、TrkA和TrkB染色顯著減弱。除黏膜層BDNF和TrkA外，其余差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。糖胃安組與糖尿病組相比，空腸腸壁各層BDNF、TrkA和TrkB表達(dá)上調(diào)。除黏膜層BDNF和TrkA外，其余差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。

圖1 各組空腸腸壁BDNF、TrkA和TrkB免疫組織化學(xué)染色結(jié)果舉例。糖尿病組與正常組相比，空腸腸壁各層BDNF、TrkA和TrkB染色顯著減弱。糖胃安組與糖尿病組相比，空腸腸壁各層BDNF、TrkA和TrkB表達(dá)上調(diào)。（標(biāo)尺=100微米）

腸壁的單位濕重、腸壁壁厚和壁面積、腸壁各層厚度以及周向和軸向材料參數(shù)腸壁的單位濕重，腸壁壁厚和壁面積，腸壁各層厚度以及周向和軸向材料參數(shù)與BDNF、TrkA和TrkB表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（R=0.357～0.825，P＜0.01）。 圖 2 示一些相關(guān)分析的結(jié)果。

表4 BDNF、TrkA和TrkB各層染色面積百分比（%，±s）

表4 BDNF、TrkA和TrkB各層染色面積百分比（%，±s）

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與糖尿病組比較，#P<0.05，##P<0.01。

檢測蛋白 腸壁分層 正常組 糖尿病組 糖胃安組BDNF 黏膜層 0.197±0.026 0.185±0.041 0.207±0.021黏膜下層 0.576±0.029 0.432±0.024* 0.621±0.027#肌層 0.575±0.031 0.431±0.035* 0.691±0.027#TrkA 黏膜層 0.354±0.038 0.236±0.037* 0.257±0.032*黏膜下層 0.556±0.019 0.336±0.021** 0.526±0.017#肌層 0.525±0.045 0.288±0.036** 0.557±0.029##TrkB 黏膜層 0.332±0.029 0.173±0.015* 0.328±0.043#黏膜下層 0.479±0.048 0.309±0.022* 0.432±0.011#肌層 0.586±0.033 0.383±0.022* 0.496±0.015#

圖2 相關(guān)分析結(jié)果舉例

3 討論

糖胃安煎劑是多年臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)及研究形成的治療DM胃腸病變的復(fù)方制劑，由白術(shù)、枳實(shí)、榔片、酒軍、半夏、桃仁及小量人參組成。課題組以結(jié)構(gòu)化信息采集數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，歸納了門診1331例（共計(jì)3030人次）病例數(shù)據(jù)，初步證明糖胃安方治療糖尿病胃腸道功能紊亂具有健脾行氣活血之功效，且副作用少，復(fù)發(fā)率低[4～6]。

神經(jīng)營養(yǎng)因子（neurotrophic factors，NTFs）產(chǎn)生于膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)所支配的組織 （如平滑肌細(xì)胞）當(dāng)中[7]。越來越多的研究證實(shí)：NTFs作為特殊的蛋白分子，可直接調(diào)控胃腸道功能[8，9]。小鼠動物實(shí)驗(yàn)中，BDNF可引起腸神經(jīng)一平滑肌形態(tài)及功能重構(gòu)，興奮腸道平滑肌肌條的收縮活動，影響小鼠腸動力[10]。BDNF可增加小鼠回腸、近端結(jié)腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸肌條的收縮幅度，表明BDNF可以興奮回腸和結(jié)腸平滑肌肌條的收縮活性，發(fā)揮促進(jìn)腸道動力作用[11]。在臨床實(shí)驗(yàn)中，通過肌注給予BDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子，逆轉(zhuǎn)高血糖誘導(dǎo)的腸道病變，從而提高腸道動力[12，13]。

我們的前期基礎(chǔ)試驗(yàn)證實(shí)：（1）糖尿病大鼠在高糖狀態(tài)下，胃腸道平滑肌收縮的壓力和應(yīng)力的閾值發(fā)生了明顯改變，其收縮張力對肌肉收縮刺激劑的反應(yīng)也發(fā)生了明顯變化，導(dǎo)致胃腸道平滑肌組織結(jié)構(gòu)、構(gòu)型異常，引起胃腸道形態(tài)學(xué)和被動生物力學(xué)發(fā)生了重構(gòu)[3]。（2）1型和2型糖尿病大鼠的小腸平滑肌對充壓刺激所引起應(yīng)力-應(yīng)變收縮的敏感性增加，單位平滑肌纖維的應(yīng)力-應(yīng)變的收縮力減弱[14，15]。即在糖尿病狀態(tài)下，腸壁平滑肌收縮張力改變，胃腸道管壁組織的主動生物力學(xué)特性發(fā)生了重構(gòu)，導(dǎo)致腸道功能受損，影響胃腸動力，最終發(fā)生 DGID[14,16～18]。 （3）我們研究還發(fā)現(xiàn)：糖胃安在一定程度上可以改善腸道組織結(jié)構(gòu)和構(gòu)型，恢復(fù)其生物力學(xué)特性異常，改善腸道組織的病理損害[3，19]。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：發(fā)生生物力學(xué)重構(gòu)的糖尿病大鼠腸壁組織中，BDNF及其受體TrkA、TrkB的表達(dá)水平下降，并且這些蛋白分子與生物力學(xué)重構(gòu)具有一定相關(guān)性。糖胃安減輕胃腸道生物力學(xué)重構(gòu)改善胃腸動力的同時(shí)，明顯增加腸壁BDNF的表達(dá)水平。由于腸道平滑肌是腸道收縮的直接效應(yīng)器，平滑肌細(xì)胞是生物力學(xué)主要的功能細(xì)胞，我們提出推測：在DGID的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，糖尿病狀態(tài)導(dǎo)致胃腸道BDNF表達(dá)下降，直接影響平滑肌結(jié)構(gòu)和功能，造成平滑肌收縮和張力異常，導(dǎo)致胃腸道生物力學(xué)重構(gòu)，是最終導(dǎo)致糖尿病胃腸功能紊亂的途徑之一。糖胃安煎劑可能通過影響胃腸道神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體水平進(jìn)對生物力學(xué)重構(gòu)的改善發(fā)揮了作用。

4 參考文獻(xiàn)