王 艷，熊顯榮，韓 杰，王 斌，楊顯英，阿果約達(dá)，李 鍵

(西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

牦牛(Bosgrunniens)是分布在中國青藏高原及毗鄰高寒牧區(qū)的特有牛種資源。因其能適應(yīng)高原生態(tài)環(huán)境并提供優(yōu)質(zhì)畜產(chǎn)品，已成為當(dāng)?shù)厝罕娭饕慕?jīng)濟(jì)來源之一[1]。受環(huán)境及自身因素影響，牦牛自然繁殖能力僅為30%～40%，嚴(yán)重制約牦牛的生產(chǎn)效率。提高牦牛繁殖性能是提高牦牛生產(chǎn)效率的關(guān)鍵，但公牦牛的體成熟和性成熟均較晚，嚴(yán)重阻遏牦牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。睪丸是激素分泌和精子產(chǎn)生的主要器官，睪丸的發(fā)育與精子的質(zhì)量對(duì)雄性牦牛的繁殖性能有顯著影響。因此，研究睪丸發(fā)育與精子生成對(duì)提高高原地區(qū)牦牛業(yè)的發(fā)展有重要意義。

從胎兒到性成熟，睪丸一直處于發(fā)育狀態(tài)，精子發(fā)生是睪丸中進(jìn)行的一種特殊細(xì)胞分化過程，兩者都受到多種調(diào)節(jié)因素影響，并在復(fù)雜的分子機(jī)制控制下完成，其中表觀遺傳協(xié)調(diào)基因表達(dá)是重要的調(diào)控機(jī)制，組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶在時(shí)空上平衡甲基化狀態(tài)是重要的表觀修飾，正確的組蛋白修飾對(duì)睪丸發(fā)育及精子持續(xù)生成至關(guān)重要。前期研究發(fā)現(xiàn)，敲除組蛋白去甲基化酶FBXL10上JmjC結(jié)構(gòu)域后成年小鼠的生精小管退化、附睪中精子減少，證實(shí)組蛋白去甲基化在睪丸發(fā)育和精子生成中發(fā)揮重要作用[3]。

組蛋白賴氨酸去甲基化酶2A(KDM2A)是由1 162個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)，其N末端上存在負(fù)責(zé)去甲基化酶活性的JmjC結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域特異性地作用于組蛋白H3的36位賴氨酸位點(diǎn)，進(jìn)行去甲基化修飾[4]。該蛋白上還存在2個(gè)鋅指，一個(gè)是與DNA結(jié)合的CXXC型，另一個(gè)是PHD型。C端有F-box和涉及蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用的LRR功能域[5-6]。KDM2A通過組蛋白去甲基化修飾調(diào)節(jié)細(xì)胞周期因子，對(duì)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和腫瘤形成起調(diào)控作用[7-8]。作為致癌基因，近年來對(duì)KDM2A的研究主要集中于胃癌[9]、乳腺癌[10-11]、肺腫瘤[12]等疾病的發(fā)生機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎缺失KDM2A導(dǎo)致E10.5～E12.5胚胎致死，表明KDM2A蛋白在小鼠胚胎各器官的增殖、分化過程中發(fā)揮重要作用[13]。該蛋白在雄性生殖中的作用尚未見報(bào)道，因此，本研究首次以牦牛睪丸為研究對(duì)象，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化技術(shù)，研究KDM2A在牦牛睪丸組織中的時(shí)空表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究 KDM2A基因在雄性牦牛生殖生理過程中的作用奠定基礎(chǔ)，為闡明牦牛睪丸發(fā)育及精子生成的分子機(jī)制提供借鑒，同時(shí)為提高雄性牦牛的繁殖性能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

試劑：PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR○RPremix ExTaqTMⅡ試劑盒均購于TaKaRa公司，Trizal試劑購于Invitrogen公司。儀器：離心機(jī)、熒光定量PCR儀購于美國Bio-red公司，核酸濃度測(cè)定儀購于日本島津，引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 樣本采集

樣本來源于四川省成都市青白江區(qū)向陽鎮(zhèn)屠宰場(chǎng)。屠宰后立即無菌采集牦牛胎兒(5～6月齡)、幼年時(shí)期(1～2歲)、性成熟時(shí)期(3～4歲)的睪丸組織，剝離白膜后取部分組織樣本放入已編號(hào)的凍存管，迅速投入液氮保存。另一部分放入4 g/100 mL福爾馬林中固定。

1.3 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

睪丸組織液氮研磨后，嚴(yán)格按照Trizol說明書的步驟提取組織總RNA。DEPC水處理后核酸濃度測(cè)定儀檢測(cè)總RNA的質(zhì)量濃度及純度。選擇A260nm～A280nm為1.8～2.0的RNA樣本按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTMRT Reagent Kit說明書，以O(shè)ligo(dT)為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA產(chǎn)物，-20 ℃保存。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成

參考NCBI數(shù)據(jù)庫中瘤牛(Bosindicus) KDM2A(GenBank登錄號(hào)：XM_019954720.1)及GAPDH(GenBank登錄號(hào)：AC_00162.1)基因mRNA序列，Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物后由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成，詳見表1。

表1 KDM2A基因和內(nèi)參基因引物序列Table 1 The Primers of KDM2A and GAPDH gene

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

利用SYBR○RPremix ExTaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)體系15 μL：酶7.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，模板1 μL，ddH2O 5.5 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s,循環(huán)40次，每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)。

1.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

利用免疫組化法檢測(cè) KDM2A的分布。將福爾馬林固定液中睪丸組織取出，經(jīng)酒精梯度脫水、二甲苯脫脂、浸蠟、包埋制成石蠟切片。切片脫水后在8.82×102mmol/L H2O2液中封閉，0.01 mol/L PBS洗滌液清洗3次，φ=0.05%的胎牛血清封閉，滴加一抗兔抗 KDM2A 抗體，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌后滴加生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育2 h，PBS洗滌后加入DAB顯色液，孵育3 min，經(jīng)過蘇木精復(fù)染后，脫水、透明、封片。免疫組織化學(xué)染色后顯微鏡觀察，判定棕黃色為陽性。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，使用SPSS 19對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行分析。以胎牛Ct值為參照，對(duì)不同發(fā)育階段進(jìn)行差異定量分析。P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR檢測(cè)

通過RT-PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，在250 bp左右獲得單一清晰條帶，與預(yù)期目的基因 KDM2A片段大小一致，證明引物特異性良好(圖1)。

2.2 KDM2A基因的時(shí)序表達(dá)譜

由圖2可知， KDM2A基因在牦牛睪丸組織中的表達(dá)量隨年齡的增長呈上升趨勢(shì)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明(圖3)，以GAPDH為參照，幼年時(shí)期是胎兒時(shí)期的2.5倍(P<0.01)；性成熟期是胎兒時(shí)期的5倍(P<0.01)，幼年時(shí)期的2倍(P<0.01)。

2.3不同發(fā)育階段牦牛睪丸中KDM2A的定位

免疫組化檢測(cè) KDM2A在睪丸中的定位結(jié)果見圖4， KDM2A在3個(gè)發(fā)育時(shí)期睪丸各級(jí)生精細(xì)胞和支持細(xì)胞中均有表達(dá)，但表達(dá)水平存在差異。在胎牛睪丸中(圖4-A)，精原干細(xì)胞與支持細(xì)胞均呈陽性。隨著睪丸發(fā)育，到幼年時(shí)期，KDM2A蛋白的分布更為廣泛(圖4-B，4-C)，精原細(xì)胞、支持細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、圓形精子及精子形成期均有表達(dá)，精原細(xì)胞表達(dá)水平最高(著色最深)，支持細(xì)胞與初級(jí)精母細(xì)胞次之(著色較深)，精子形成期較低(著色較淺)，圓形精子最低(著色最淺)，到性成熟時(shí)期(圖4-D)，隨著睪丸生精上皮明顯增厚，性成熟后圓形精子與精子形成期較幼年時(shí)期明顯增高。

M. DNA marker DL2000; 1. KDM2A; 2. 空白對(duì)照 Blank control

圖1牦牛睪丸組織中KDM2A基因的RT-PCR結(jié)果
Fig.1RT-PCRamplificationofKDM2Agenefromyaktesticle

1～3依次為胎兒時(shí)期、幼年時(shí)期、性成熟時(shí)期牦牛睪丸組織 Represents the testicle of fetal, juvenile periods, sexual maturation periods of yak, respectively

圖2RT-PCR檢測(cè)不同發(fā)育階段牦牛
睪丸KDM2AmRNA表達(dá)
Fig.2ExpressionofKDM2AmRNAinyaktesticleatdifferentgrowthstagesbythemeansofRT-PCR

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01) Different capital letter mean extreme significant difference(P<0.01)

3 討 論

在雄性動(dòng)物睪丸發(fā)育及精子生成過程中組蛋白修飾起重要作用，研究表明KDM2亞家族基因敲除或敲除特定功能結(jié)構(gòu)域會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎致死或精子減少、生精小管退化[3,13]。作為該家族的重要成員， KDM2A能夠?qū)3K36me1/2/3和H3K4me3去甲基化[14]，同時(shí)作為轉(zhuǎn)錄抑制因子， KDM2A可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化及衰老。因此，研究 KDM2A基因?yàn)檫M(jìn)一步了解牦牛睪丸發(fā)育及精子生成奠定基礎(chǔ)。

本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)牦牛睪丸中 KDM2A基因的時(shí)序表達(dá)譜，結(jié)果顯示其在3個(gè)發(fā)育階段均表達(dá)，且隨著年齡增長表達(dá)量增加。2016年Ozawa 等[3]檢測(cè)小鼠性成熟前睪丸中 KDM2A mRNA的表達(dá)，結(jié)果與本試驗(yàn)不同，小鼠睪丸中 KDM2A基因的表達(dá)在21日齡前呈遞增趨勢(shì)，21日齡表達(dá)量達(dá)到峰值，直至性成熟后無顯著變化。由此表明小鼠及牦牛睪丸中存在 KDM2A 基因的表達(dá)差異，原因可能是 KDM2A在不同物種中的作用不同。小鼠與牦牛睪丸中 KDM2B mRNA的表達(dá)均隨年齡增長表達(dá)量增高，但小鼠出生后，前10 d睪丸中 KDM2B的表達(dá)量增長緩慢，第10天出現(xiàn)激增并持續(xù)至性成熟，牦牛 KDM2A mRNA的表達(dá)量增長相對(duì)平緩，由此推測(cè) KDM2A與 KDM2B通過不同方式參與調(diào)節(jié)睪丸的生理活動(dòng)。

A:胎兒時(shí)期牦牛睪丸(200×) Fetal yak testicle(200×); B～C:幼年時(shí)期牦牛睪丸(40×) Juvenile yak testicle(40×); D:性成熟時(shí)期牦牛睪丸(40×) Yak testicle during sexual maturity(40×); As:精原干細(xì)胞 Spermatogonial stem cells; S:支持細(xì)胞 Sertoli cells; SP:精原細(xì)胞 Spermatogonium; P:初級(jí)精母細(xì)胞 Primary spermatocyte; RS:圓形精子 Round spermatid; IC:間質(zhì)細(xì)胞 Leydig cells; SS:精子形成期 Spermiogenesis

圖4不同發(fā)育階段牦牛睪丸免疫組化KDM2A蛋白
Fig.4ImmunohistochemistryofKDM2Aproteininyaktesticleatdifferentgrowthstages

免疫組化結(jié)果表明 KDM2A在精原干細(xì)胞及支持細(xì)胞均呈陽性。朱俊峰[15]研究幼齡牦牛(3月齡)睪丸中的細(xì)胞形態(tài)，認(rèn)為生精小管中僅存在精原細(xì)胞和少量支持細(xì)胞，表明牦牛胎兒時(shí)期睪丸的變化主要是以生精小管發(fā)育為主，且主要與精原干細(xì)胞和支持細(xì)胞增殖相關(guān)。睪丸中由精原干細(xì)胞分化而來的各級(jí)生精細(xì)胞與支持細(xì)胞在精子發(fā)生過程中起重要作用[16]。說明胎牛時(shí)期生精小管的發(fā)育為后續(xù)精子持續(xù)發(fā)生奠定基礎(chǔ)。筆者推測(cè)，胎牛時(shí)期 KDM2A主要在精原干細(xì)胞及支持細(xì)胞的增殖過程中起重要作用。已證實(shí) KDM2A可以特異性地將DUSP3的近端啟動(dòng)子和5′端的H3K36me2去甲基化；同時(shí)作為轉(zhuǎn)錄抑制因子， KDM2A介導(dǎo)DUSP3的轉(zhuǎn)錄抑制，兩者偶聯(lián)遏制DUSP3的活性[12]。作為ERK1/2抑制蛋白，DUSP3通過抑制ERK1/2活性影響Ras/ERK1/2信號(hào)通路，該信號(hào)通路在精原細(xì)胞自我更新及誘導(dǎo)減數(shù)分裂中發(fā)揮重要作用[17-18]。1997年Cadigan等[19]發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)睪丸支持細(xì)胞的增殖分化起促進(jìn)作用，其中β-catenin的活性直接影響Wnt信號(hào)通路[20-21]，研究證實(shí)細(xì)胞核中的 KDM2A可以通過調(diào)控β-catenin的降解進(jìn)而防止Wnt信號(hào)過度活化[22]。因此推測(cè) KDM2A通過介導(dǎo)ERK1/2和Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性調(diào)節(jié)精原干細(xì)胞與支持細(xì)胞的增殖分化。

精子發(fā)生是復(fù)雜而有規(guī)律的細(xì)胞分化過程，這一過程必然經(jīng)歷精原細(xì)胞有絲分裂和精母細(xì)胞減數(shù)分裂。本研究結(jié)果顯示，幼年及性成熟牦牛睪丸中精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞及圓形精子中均表達(dá) KDM2A，說明 KDM2A參與調(diào)控精原細(xì)胞的增殖與精母細(xì)胞的分化。 KDM2A調(diào)節(jié)維持著絲粒異染色質(zhì)狀態(tài)的異染色質(zhì)蛋白1(HP1)的功能，進(jìn)而介導(dǎo)著絲粒異染色質(zhì)的狀態(tài)，該異染色質(zhì)區(qū)能夠吸引連接因子，從而確保染色體正確分裂[23-24]，同時(shí)基于對(duì) KDM2A表觀修飾學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白的JmjC結(jié)構(gòu)域能抑制著絲粒衛(wèi)星DNA的轉(zhuǎn)錄，后者轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的累積會(huì)造成染色體分離和著絲粒功能所需的著絲粒相關(guān)蛋白的錯(cuò)誤定位[25-26]。由此推測(cè) KDM2A通過調(diào)節(jié)著絲粒的狀態(tài)介導(dǎo)精原細(xì)胞增殖和精母細(xì)胞分化，減少細(xì)胞分裂過程中染色體的錯(cuò)誤分離，進(jìn)而確保精子質(zhì)量。

KDM2A在精子形成期表達(dá)，成熟精子中不表達(dá)，表明在精子形成期該蛋白發(fā)揮一定作用。在精子形成期，精子細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生變化，核染色質(zhì)變形濃縮，向一側(cè)偏移形成精子頭部，核體積變小的主要原因是染色質(zhì)中的核蛋白由組蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)轸~精蛋白，染色質(zhì)重新包裝形成精子核[27-28]。研究表明組蛋白H2A在核染色質(zhì)濃縮變形過程中發(fā)揮作用，其通過泛素化使核小體去穩(wěn)定，進(jìn)而促進(jìn)組蛋白向魚精蛋白轉(zhuǎn)變的過程[29]。通過小鼠胚胎 KDM2A敲除試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲除 KDM2A后H2A泛素化水平明顯降低[7]。由此推測(cè) KDM2A通過調(diào)節(jié)H2A泛素化水平參與精子的形成。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)通過RT-qPCR及免疫組化法檢測(cè)不同發(fā)育階段牦牛睪丸組織中 KDM2A的時(shí)空表達(dá)，發(fā)現(xiàn)不同階段睪丸中存在表達(dá)差異，表明 KDM2A參與調(diào)節(jié)生精細(xì)胞的增長、分化，介導(dǎo)支持細(xì)胞的增殖過程。本研究為進(jìn)一步研究 KDM2A在牦牛生殖生理中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為揭示牦牛睪丸發(fā)育和精子發(fā)生的分子機(jī)制提供依據(jù)。