劉曉婷，朱曉慶，楊 莉，馬 昭，喬彥杰，張保軍，谷新利，商云霞

(石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003)

近年來，由于抗生素的濫用，病原體的變異，強(qiáng)毒株的出現(xiàn)等原因，在畜禽生產(chǎn)中普遍存在疫苗接種效果不佳或免疫失敗等問題。有臨床實(shí)踐表明，疫苗與免疫佐劑或免疫增強(qiáng)劑配合使用，是疫苗發(fā)揮良好防疫效果的有效手段之一。中藥多糖是從中草藥中提取出的具有免疫增強(qiáng)、抗感染、抗病毒及調(diào)節(jié)造血功能等多種生物活性作用的成分之一，它毒副作用小，體內(nèi)殘留量低，具有開發(fā)成療效確定、性質(zhì)穩(wěn)定及毒副作用小的免疫增強(qiáng)劑的前景[1]。多糖類物質(zhì)是一種T細(xì)胞依賴性抗原，能被MHC II類分子處理和呈遞，進(jìn)而被TCR識別，參與機(jī)體細(xì)胞免疫，亦能有效激活B淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生[2]。目前已發(fā)現(xiàn)上百種中藥多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗感染等多種生理活性，其免疫調(diào)節(jié)作用是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。

主要組織相容性復(fù)合體(MHC)參與機(jī)體內(nèi)、外抗原的呈遞，影響機(jī)體對疾病的抵抗力，是動(dòng)物抗病育種的主要候選基因群之一[3]。有研究表明，雞MHCB-Lβ基因多態(tài)性對機(jī)體免疫反應(yīng)具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，且與禽類對傳染性疾病的抗性高度相關(guān)[4-5]。朱曉慶等[6]研究發(fā)現(xiàn)，MHCB-LβII基因HinII位點(diǎn)的多態(tài)性能夠影響中藥復(fù)方多糖有效免疫劑量的篩選。由于雞MHCB-LβII基因多態(tài)性的存在，使得MHC II類分子接納與遞呈抗原肽有一定的選擇性，導(dǎo)致不同基因型個(gè)體對同一抗原表現(xiàn)出免疫應(yīng)答強(qiáng)弱的差異。另外，中醫(yī)藥自古講求用藥個(gè)體化，因此中藥多糖作為調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的外源性抗原之一，根據(jù)機(jī)體遺傳變異的特性給予不同劑量的中藥多糖，對保障疫苗效力、增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力及提高其存活率有著重要意義。

本試驗(yàn)擬排除因MHCB-LβII基因多態(tài)性而導(dǎo)致的不同基因型個(gè)體免疫應(yīng)答能力的差異，確定中藥復(fù)方多糖能顯著增強(qiáng)雞機(jī)體免疫力的最佳劑量，從而為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

中藥復(fù)方多糖由石河子大學(xué)中獸醫(yī)學(xué)研究室提供。復(fù)方由當(dāng)歸、黨參、川芎、熟地、山楂、何首烏、淫羊藿、麥冬、茯苓、補(bǔ)骨脂與黃芪11味中藥按一定配比組成，經(jīng)水提—醇沉法得到中藥復(fù)方多糖粗提物后，再由AB-8大孔吸附樹脂吸附，最終得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為77.10%的精制復(fù)方多糖。用滅菌超純水將復(fù)方多糖配制成50 mg/mL(高劑量)、25 mg/mL(中劑量)和12.5 mg/mL(低劑量)3個(gè)質(zhì)量濃度，4 ℃保存，備用。

1.2 主要試劑

白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、白細(xì)胞介素(IL-15)ELISA試劑盒均購自上海藍(lán)基生物科技有限公司；雞傳染性法氏囊病毒抗體(IBDV Ab)試劑盒購于江蘇綠葉生物科技有限公司；雞新城疫病毒(La Sota株)、傳染性支氣管炎病毒(M41株)二聯(lián)滅活疫苗，購自普萊柯生物工程股份有限公司；雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗(La Sota 株+H120株)及雞傳染性法氏囊病活疫苗(B87株)均購自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司；禽流感二價(jià)滅活疫苗(H5N1 Re-6株+H9N2 Re-2株)購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

500羽1日齡京紅1號蛋雞，購自新疆昌吉市某一孵化場。根據(jù)MHCB-LβII基因第2外顯子PCR-SSCP的檢測結(jié)果分組，再將各組分為高、中、低劑量中藥多糖組和空白對照組。分別于8日齡肌肉注射50、25、12.5 mg/mL的中藥復(fù)方多糖和生理鹽水，每只0.2 mL，連續(xù)注射7 d。

所用試驗(yàn)雞1日齡馬立克疫苗噴霧免疫(于孵化場進(jìn)行)，7日齡新、傳二聯(lián)活疫苗點(diǎn)眼免疫，21日齡新、傳二聯(lián)活疫苗點(diǎn)眼與新、傳二聯(lián)滅活苗肌注免疫，14日齡法氏囊疫苗滴口免疫，28日齡禽流感二聯(lián)滅活苗免疫。在相同條件下常規(guī)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件、營養(yǎng)水平和飼養(yǎng)管理均一致，飼養(yǎng)期為7周，整個(gè)試驗(yàn)期雞群健康狀況良好。

1.4 PCR-SSCP基因型檢測

1.4.1 基因組DNA的提取 翅下靜脈采血每羽0.2 mL，置于肝素鈉抗凝采血管中搖勻，-20 ℃冷凍保存。用血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA，20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，-20 ℃保存，備用。

1.4.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中收錄的雞MHCB-LβII基因序列(NO.M29763.1)，應(yīng)用Oligo軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列為上游引物：5′-AAACCGACCGTCTGGCGTGCTA-3′，下游引物：5′-TTACCCCACGCCTGGCTGAT-3′，擴(kuò)增片段238 bp，引物由華大基因科技股份有限公司合成。

1.4.3 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增體系20 L：2×PCR Mix 10 L，模版DNA 2 L，上、下游引物各0.5 L，ddH2O 7 L。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94變性40 s，60.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸35 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取5 L PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物由20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.4.4 PCR-SSCP分析及序列測定 取3 L PCR產(chǎn)物加7 L 變性上樣緩沖液[體積分?jǐn)?shù)為98%去離子甲酰胺、10 mmol/L EDTA (pH 8.0)、0.5 g/L溴酚藍(lán)]，98 ℃變性10 min，變性結(jié)束后迅速置于冰上冰浴10 min。用10 %聚丙烯酰胺凝膠[m(Acr)∶m(Scr)=29∶1]電泳檢測，300 V電壓預(yù)電泳10 min，120 V電泳14 h后，固定、銀染、顯色，判定基因型，拍照保存。各取3個(gè)不同基因型個(gè)體的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，送華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序，對PCR-SSCP分型結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.5 檢測項(xiàng)目及方法

每組隨機(jī)抽取5只試驗(yàn)雞，于21、27、35、42、49日齡翅下靜脈采集非抗凝血3 mL，37 ℃靜置1 h，分離血清，測定血清中IL-1β、IL-10、IL-15的質(zhì)量濃度和IBDV 抗體效價(jià)(均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較，以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

用所設(shè)計(jì)的引物對基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，取所得PCR產(chǎn)物5 L于20 g/L瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果如圖1所示。由圖1可看出，所設(shè)計(jì)引物的擴(kuò)增結(jié)果較好，片段長度與預(yù)期238 bp大小一致，條帶清晰，無非特異性條帶，可直接進(jìn)行SSCP分析。

2.2 SSCP檢測

對所有DNA樣本的PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP多態(tài)性檢測，發(fā)現(xiàn)所擴(kuò)增片段有3種基因型，分別定義為AA (103羽)、BB(266羽)和BC(131羽)(圖2)。

M. Trans DNA maker I；1～7. 不同樣本個(gè)體MHCB-LβII基因擴(kuò)增產(chǎn)物MHCB-LβIIgene amplification product of different sample individual

圖1MHCB-LβII的PCR擴(kuò)增結(jié)果
Fig.1ThePCRamplificationresultsofMHCB-LβII

1、6、8、10.BC型 BC genotypes；2、4、7、9.BB型 BB genotypes；3、5：AA型 AA genotypes

2.3 不同基因型測序結(jié)果

選取不同基因型個(gè)體的PCR產(chǎn)物各3個(gè)，純化后送華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序。結(jié)果顯示，在擴(kuò)增位點(diǎn)有3種等位基因，分別為A、B和C，基因型有AA、BB和BC型，未檢測到AB和CC型。其中AA型與GenBank(No.M29763.1)發(fā)表的序列一致，定義為野生型。BB型與AA型相比有一處T1722C的單堿基突變，BB型與BC型相比有一處A1967T單堿基突變。

2.4 中藥復(fù)方多糖對不同基因型雞血清中IL-1β、IL-10和IL-15質(zhì)量濃度的影響

2.4.1 對IL-1β質(zhì)量濃度的影響 由表1可知，與對照組相比，高、中、低3個(gè)劑量的中藥復(fù)方多糖均能顯著提高不同基因型雞血清中IL-1β 的質(zhì)量濃度，但不同基因型雞中最有效地提高其血清中IL-1β 質(zhì)量濃度所需的中藥復(fù)方多糖劑量不同。其中，AA基因型雞中，各日齡中劑量多糖組血清中IL-1β的質(zhì)量濃度顯著高于高、低劑量組(P<0.05)；BB基因型雞，各日齡高劑量多糖組血清中IL-1β的質(zhì)量濃度顯著高于中、低劑量組(P<0.05)；BC基因型雞，除27日齡高劑量多糖組血清中IL-1β 的質(zhì)量濃度顯著高于低劑量組外，其余日齡各劑量多糖組間均無顯著差異(P>0.05)。

2.4.2 對IL-10質(zhì)量濃度的影響 由表2可知，與對照組相比，高、中、低3個(gè)劑量的中藥復(fù)方多糖均能顯著降低不同基因型雞血清中IL-10 的質(zhì)量濃度。其中，AA基因型雞中，21、27和35日齡時(shí)，中劑量多糖組血清中IL-10的質(zhì)量濃度顯著低于高、低劑量組(P<0.05)，42日齡時(shí)，中劑量多糖組低于高、低劑量組，但無顯著水平(P>0.05)；BB基因型雞中，除49日齡外，其他各日齡高劑量多糖組血清中IL-10顯著低于中、低劑量組(P<0.05)；BC基因型雞中，各劑量多糖組間血清中IL-10無顯著差異(P>0.05)。

2.4.3 對IL-15質(zhì)量濃度的影響 由表3可知，與對照組相比，高、中、低3個(gè)劑量的中藥復(fù)方多糖組均能顯著提高不同基因型雞血清中IL-15 的質(zhì)量濃度。在AA基因型雞中，27、35和42日齡時(shí)中劑量多糖組血清中IL-15質(zhì)量濃度顯著高于高、低劑量組(P<0.05)，其他各日齡均高于高、低劑量組，但無顯著差異(P>0.05)；在BB基因型雞中，27、35和42日齡高劑量多糖組血清中IL-15 質(zhì)量濃度顯著高于中、低劑量組(P<0.05)；在BC基因型雞中，各劑量多糖組間血清中IL-15質(zhì)量濃度無顯著差異(P>0.05)。

2.5 中藥復(fù)方多糖對不同基因型雞血清中IBDV抗體效價(jià)的影響

由圖3可知，在傳染性法氏囊疫苗首免后7～35 d，試驗(yàn)組及對照組雞血清IBDV抗體效價(jià)均呈升高趨勢，且與對照組相比，首免后13～35 d，高、中、低3個(gè)劑量的中藥復(fù)方多糖組均能顯著提高不同基因型雞血清中IBDV抗體效價(jià)，但不同基因型雞中，最有效提高其血清中IBDV 抗體效價(jià)的中藥復(fù)方多糖劑量不同。其中，AA基因型雞中，中劑量多糖組雞血清中IBDV 抗體效價(jià)顯著高于高、低劑量組(P<0.05)；BB基因型雞中，高劑量多糖組雞血清中IBDV 抗體效價(jià)顯著高于中、低劑量組(P<0.05)；BC基因型雞中，各劑量多糖組間雞血清中IBDV 抗體效價(jià)無顯著性差異(P>0.05)。

表1 不同MHC B-Lβ II基因型蛋雞血清中IL-1β的質(zhì)量濃度Table 1 Serum levels of IL-1β in different MHC B-Lβ II genotype hens pg/mL

注：同基因型組中，同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Notes: In the same genotype group,different lowercase letters in the same column mean significant difference (P<0.05). The same below.

表2 不同MHC B-Lβ II基因型蛋雞血清中IL-10的質(zhì)量濃度Table 2 Serum levels of IL-10 in different MHC B-Lβ II genotype hens pg/mL

表3 不同MHC B-Lβ II基因型蛋雞血清中IL-15的質(zhì)量濃度Table 3 Serum levels of IL-15 in different MHC B-Lβ II genotype hens pg/mL

圖3 不同基因型雞血清中IBDV抗體效價(jià)的比較Fig.3 Comparison of serum titers of IBDV antibodies in different genotypes of hens

3 討 論

雞MHCB-LβII基因豐富的多態(tài)性與機(jī)體的免疫性狀相關(guān)，能引起不同個(gè)體對相同抗原的不同的免疫反應(yīng)[5]。研究表明，不同MHCB-LβII基因型雞對腸炎沙門氏菌、流感性布魯氏桿菌、綿羊紅細(xì)胞、禽流感和新城疫等的抗體滴度，及機(jī)體內(nèi)淋巴細(xì)胞活性與細(xì)胞因子質(zhì)量濃度等有所不同[7]。李福偉等[5]對3個(gè)地方雞種的MHCB-LβII基因遺傳變異與綿羊紅細(xì)胞、禽流感和新城疫等免疫性狀進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)個(gè)體甚至品種水平上存在免疫能力的差異。楊紅洋等[8]研究表明，不同MHCB-LβII基因型白羽肉雞血清中IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ 和TNF-α的質(zhì)量濃度不同。本試驗(yàn)的空白對照組中，不同MHCB-LβII基因型雞血清中IL-1β、IL-10和IL-15質(zhì)量濃度及IBDV抗體效價(jià)均有不同，提示MHCB-LβII基因的多態(tài)性與部分機(jī)體免疫活性具有相關(guān)性，能夠?qū)е聶C(jī)體免疫功能具有個(gè)體差異。

細(xì)胞因子是由細(xì)胞分泌的一類能夠執(zhí)行信號傳導(dǎo)的蛋白活性分子，可促進(jìn)靶細(xì)胞的增殖、分化和成熟，在抗感染、調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中起著重要的作用[9]。IL-1β是IL-1的主要亞型之一，具有高度生物活性，可以誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的增殖分化，刺激抗體產(chǎn)生，調(diào)節(jié)免疫作用等[10]。IL-10是一種由Th2細(xì)胞產(chǎn)生的抑制炎癥應(yīng)答的免疫抑制細(xì)胞因子，其能夠通過降低抗原提成細(xì)胞(APC)表面MHC II分子及CD80+和CD86+等共刺激分子的表達(dá)，抑制Th1細(xì)胞產(chǎn)生IL-1、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)等促炎因子等各種途徑降低APC抗原提成能力，間接降低T細(xì)胞的激活，誘導(dǎo)T細(xì)胞的免疫耐受[11-12]。IL-15是機(jī)體重要的促炎因子，其受體分布于樹突細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞，不僅可激活先天性免疫反應(yīng)，而且對后續(xù)的獲得性免疫具有進(jìn)一步的調(diào)控作用[13]。

研究表明，植物多糖能夠通過TLR4、TLR2受體激活免疫細(xì)胞內(nèi)信號通路提高轉(zhuǎn)錄水平，促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[14]。李馨[15]研究表明，北冬蟲夏草多糖可以增加脾臟IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)量且隨劑量的增加而增加，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫力。江澤波等[16]研究表明，豬苓多糖可通過TLR4信號通路活化M1巨噬細(xì)胞，劑量依賴性的上調(diào)IL-1β、IL-6和TNF-α 的分泌量，從而起到增強(qiáng)機(jī)體免疫力的效應(yīng)。馬振乾[17]研究表明，沈氏免疫增強(qiáng)劑能抑制雛雞血清中IL-10的分泌，從而降低其在血清中的質(zhì)量濃度。王永偉[18]研究表明，雞IL-15能夠維持IBDV VP2蛋白誘導(dǎo)的中和性抗體的持續(xù)時(shí)間。本研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方多糖組各基因型雞血清中IL-1β和IL-15的質(zhì)量濃度與對照組比較均有顯著提高，與李馨、江澤波等報(bào)道多糖能夠上調(diào)IL-1β mRNA表達(dá)量和IL-1β 分泌量的結(jié)果相似。但本研究中復(fù)方多糖對提高血清IL-1β 的不同基因型雞最佳劑量不同，除對BB基因型雞呈劑量依賴性提高血清中IL-1β 外，對AA和BC基因型雞血清中IL-1β 并不呈劑量依賴性提高。同時(shí)中藥復(fù)方多糖組與對照組相比均能顯著降低各基因型雞血清中IL-10的質(zhì)量濃度，此結(jié)果與馬振乾等的研究一致。出現(xiàn)不同劑量中藥復(fù)方多糖對調(diào)節(jié)雞血清中細(xì)胞因子的最適基因型不同的原因可能是：不同MHCB-LβII基因型雞機(jī)體的免疫系統(tǒng)對中藥多糖類外來抗原的感知存在數(shù)量與濃度上敏感性的差異，過高或過低劑量的中藥多糖均不會(huì)產(chǎn)生較好的免疫應(yīng)答，從而引起細(xì)胞因子質(zhì)量濃度的差異。

在通過疫苗接種的方式對傳染性法氏囊疾病進(jìn)行防治的同時(shí)，輔以免疫增強(qiáng)劑可有效提高疫苗接種的成功率，法氏囊抗體效價(jià)是反應(yīng)法氏囊疫苗免疫后雞特異性免疫功能的指標(biāo)。王宏軍[19]以飼料添加劑的方式投喂不同劑量的五味子多糖，發(fā)現(xiàn)多糖能顯著提高新城疫疫苗與傳染性法氏囊疫苗抗體效價(jià)，增強(qiáng)雛雞的特異性免疫。楊靖松等[20]通過飲水給予不同濃度的黨參粗提物，發(fā)現(xiàn)其能提高青腳麻雞血清中IBDV的抗體效價(jià)，且以中劑量藥效為佳。王福傳等[21]研究表明，以黃芪、黨參、當(dāng)歸、白術(shù)、茯苓、砂仁、陳皮和甘草組成的復(fù)方中藥免疫增強(qiáng)劑能夠有效提高蛋雞血清中IBDV抗體效價(jià)。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比不同劑量的中藥復(fù)方多糖均可顯著提高IBDV抗體效價(jià)，與王宏軍、楊靖松、王福傳等研究結(jié)果一致。但在同一基因型同一時(shí)間內(nèi)，不同劑量的中藥復(fù)方多糖組中，雞血清中IBDV 抗體效價(jià)不同，這可能與MHCB-LβII基因多態(tài)性使機(jī)體存在免疫應(yīng)答能力的個(gè)體差異，導(dǎo)致機(jī)體同一劑量中藥復(fù)方多糖組中，提高雞血清中IBDV 抗體效價(jià)最適基因型不同。與此同時(shí)在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著日齡的增加雞血清中IBDV 抗體效價(jià)逐漸上升，在首免后13～20 d上升速度最快，而首免后20～35 d上升速度較慢，且不同復(fù)方多糖劑量組中雞血清中IBDV 抗體效價(jià)上升速度略有不同。其原因一方面可能與法氏囊活疫苗抗體消長規(guī)律有關(guān)，在法氏囊首免后2周左右可以產(chǎn)生大量抗體。另一方面可能與中藥復(fù)方多糖在機(jī)體內(nèi)的代謝過程有關(guān)。在此過程中多糖被降解成寡糖、低聚糖等小分子形式被 MHC class II 類分子提呈給 T 細(xì)胞而發(fā)揮免疫效應(yīng)。多糖的濃度不同，且機(jī)體對多糖降解、吸收和代謝速度的不同，多糖在體內(nèi)被降解成小分子糖的種類和數(shù)量的不同， 以及MHC class II 類分子提呈多糖分子的數(shù)量與能力不同，導(dǎo)致機(jī)體血清中IBDV 抗體效價(jià)上升速度不同。

從上述試驗(yàn)研究結(jié)果可以看出，不同MHCB-LβII基因型雞個(gè)體之間存在免疫應(yīng)答能力的差異，且在不同基因型雞中，最有效地提高機(jī)體免疫力的中藥多糖劑量略有不同。而本次試驗(yàn)中，僅僅研究了京紅1號蛋雞，且雞的數(shù)量及免疫相關(guān)指標(biāo)均較少，所以要確定中藥復(fù)方多糖最適免疫劑量的篩選是否受雞基因多態(tài)性的影響，還需增加雞的品種，擴(kuò)大試驗(yàn)雞的數(shù)量，增加體內(nèi)、體外免疫指標(biāo)，進(jìn)行深入研究。