童建波 杜蕾蕾 曾榮 王麗瑋 劉宇甄 段志敏 陳青 李岷

210042南京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所 江蘇省皮膚性病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（童建波、杜蕾蕾、曾榮、王麗瑋、劉宇甄、段志敏、李岷）；江蘇省血液中心（陳青）

由于廣譜抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑的廣泛使用，放療和化療、器官移植以及侵入性治療措施的急劇增加，艾滋病等免疫缺陷性疾病的流行，近年來侵襲性曲霉病的發(fā)病率快速上升[1]，致死率可高達(dá)50%～95%，而煙曲霉是最常見的致病菌[2]。宿主單核巨噬細(xì)胞作為固有免疫中重要的反應(yīng)細(xì)胞，能識別并清除入侵的煙曲霉[3]。本研究旨在探討煙曲霉能否激活人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系（THP?1）的信號分子p38絲裂原活化蛋白（MAPK）及誘導(dǎo)腫瘤壞死因子α（TNF?α）的分泌。

材料和方法

一、 菌株、細(xì)胞和主要試劑

煙曲霉Af293（ATCC MYA?4609，CBS 101355）、THP?1細(xì)胞株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）。兔抗人p38MAPK和磷酸化p38MAPK抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；iTaq通用型SYBR Green預(yù)混液（美國Bio?rad公司）；PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（日本TaKaRa公司）；TNF?α酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司）；丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）、β-葡聚糖、p38MAPK抑制劑SB2035805（美國Sigma公司）。

二、 細(xì)胞培養(yǎng)

煙曲霉Af293在蛋白胨沙氏瓊脂培養(yǎng)基（SDA）上37℃培養(yǎng)3d，收集煙曲霉孢子，經(jīng)56℃60 min水浴滅活后，配制成不同濃度菌懸液待用。THP?1細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。將THP?1細(xì)胞制備成2×105個(gè)/ml細(xì)胞懸液，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每孔2ml）及12孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每孔1ml），加入100 mg/L PMA刺激48h后，加入106和107CFU/ml滅活煙曲霉菌懸液共培養(yǎng)。

三、 實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR法檢測煙曲霉與THP?1細(xì)胞共孵育不同時(shí)間點(diǎn)TNF?α mRNA表達(dá)水平

106和107CFU/ml煙曲霉與2 × 105/ml THP?1細(xì)胞共孵育（106和107CFU/ml煙曲霉組），并設(shè)空白對照組（不加任何刺激，僅用培養(yǎng)基處理THP?1細(xì)胞）和陽性對照β-葡聚糖組（采用陽性刺激物100 mg/L β-葡聚糖孵育THP?1細(xì)胞），分別培養(yǎng)1、3、6h。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，刺激6h后TNF?α mRNA表達(dá)水平達(dá)到最高，繼續(xù)延長作用時(shí)間后其表達(dá)水平開始降低。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇刺激效果最強(qiáng)的6h作為觀察時(shí)間，選擇107CFU/ml煙曲霉作為刺激濃度。設(shè)置p38MAPK抑制劑SB203580阻斷組，即20 μmol/L SB203580預(yù)先與THP?1細(xì)胞共培養(yǎng)2h后，再用107CFU/ml煙曲霉、β-葡聚糖或培養(yǎng)基作用6h。同時(shí)設(shè)立SB203580未阻斷組，即僅采用107CFU/ml煙曲霉、β-葡聚糖或培養(yǎng)基作用THP?1細(xì)胞6h，檢測各組TNF?α mRNA表達(dá)水平。

采用Trizol法抽提各組THP?1細(xì)胞總RNA，按PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明書將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用實(shí)時(shí)定量PCR儀7300型（美國ABI公司），采用SYBR green法對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。以β肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照，引物TNF?α及β肌動(dòng)蛋白由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列TNF?α上游5′?CGAGTGAC AAGCCTGTAGC?3′，下游5′?GGTGTGGGTGAGGAG CACAT?3′，β肌動(dòng)蛋白上游5′?TCTGGCACCACACC TTCTA?3′，下游 5′?AGGCATACAGGGACAGCAC?3′。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃10 min，變性95℃15 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，循環(huán)數(shù)40。采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的變化水平。

四、 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測培養(yǎng)上清液中TNF?α含量

107CFU/ml煙曲霉菌懸液（煙曲霉組）、β-葡聚糖（β-葡聚糖組）刺激THP?1細(xì)胞24h，同時(shí)設(shè)立僅培養(yǎng)基孵育THP?1細(xì)胞的空白對照組，按照試劑盒說明書檢測培養(yǎng)上清液中TNF?α含量。

五、 Western印跡法檢測p38MAPK和磷酸化p38MAPK的表達(dá)

107CFU/ml煙曲霉菌懸液分別作用THP?1細(xì)胞15、30、60 min，并設(shè)置僅培養(yǎng)基孵育THP?1細(xì)胞的空白對照組。收集各組THP?1細(xì)胞，裂解細(xì)胞，提取總蛋白。等量蛋白的不同樣品梯度十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。5%牛血清蛋白（BSA）封閉2h，兔抗人單克隆抗體4℃孵育過夜。TBST液洗膜3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG第二抗體反應(yīng)2h，TBST液洗膜3次，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光Supersignal?試劑顯色發(fā)光，檢測p38MAPK和磷酸化p38MAPK的水平。

六、 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、 煙曲霉對THP?1細(xì)胞TNF?α mRNA水平的影響

煙曲霉刺激THP?1細(xì)胞后3、6h，經(jīng)雙因素方差分析，106和107CFU/ml煙曲霉組、β-葡聚糖組、空白對照組TNF?α mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=110.983，P＜ 0.001，v=3）。見表1。106和107CFU/ml煙曲霉、β-葡聚糖作用THP?1細(xì)胞后，TNF?α mRNA水平在3h出現(xiàn)上升，6h上升更明顯，即THP?1細(xì)胞TNF?α mRNA水平隨培養(yǎng)時(shí)間延長而增高（F=701.680，P＜ 0.001，v=2）。LSD?t檢驗(yàn)顯示，刺激后3h，107CFU/ml煙曲霉組和β-葡聚糖組TNF?α mRNA水平顯著高于空白對照組（均P＜0.01），而刺激后 6h，106和 107CFU/ml煙曲霉組及β-葡聚糖組均顯著高于空白對照組（均P＜0.001）。刺激后1、3、6h，106CFU/ml煙曲霉組與β-葡聚糖組間TNF?α mRNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。107CFU/ml煙曲霉作用THP?1細(xì)胞6h后，TNF?α mRNA表達(dá)水平明顯高于106CFU/ml煙曲霉組及β-葡聚糖組（均P＜0.01）。見表1。

表1 煙曲霉對THP?1細(xì)胞腫瘤壞死因子α mRNA表達(dá)水平的影響（2?ΔΔCt± s）

表1 煙曲霉對THP?1細(xì)胞腫瘤壞死因子α mRNA表達(dá)水平的影響（2?ΔΔCt± s）

注：n=3。與同時(shí)間點(diǎn)空白對照組比較，aP＜0.01；bP＜0.001

組別106CFU/ml煙曲霉組107CFU/ml煙曲霉組β-葡聚糖組空白對照組刺激后1h 1.75±1.15 1.22±0.78 1.84±0.69 0.93±0.16刺激后3h 7.58±0.28 10.43±0.84a 9.27±1.82a 1.04±0.11刺激后6h 49.42±12.35b 199.18±24.25b 67.63±6.43b 1.19±0.71

二、 煙曲霉對THP?1細(xì)胞TNF?α蛋白分泌的影響

107CFU/ml煙曲霉刺激THP?1細(xì)胞后24h，煙曲霉組、β-葡聚糖組、空白對照組上清液中TNF?α蛋白含量分別為（6 236.30±437.12）、（3 011.08±312.00）、（132.10± 0.61）ng/L。經(jīng)單因素方差分析，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=9，F(xiàn)=71.25，P＜0.01）。煙曲霉組和β-葡聚糖組均明顯高于空白對照組（P＜0.01、＜0.05），煙曲霉組高于β-葡聚糖組（P＜ 0.01）。

三、 煙曲霉對THP?1細(xì)胞p38MAPK激活的影響

107CFU/ml煙曲霉刺激后30 min，與空白對照組相比，磷酸化p38MAPK蛋白水平已明顯升高，60 min時(shí)開始減弱；而p38MAPK蛋白水平在刺激后30 min、1h均無明顯變化。見圖1。

四、p38MAPK信號通路抑制劑SB203580對煙曲霉上調(diào)TNF?α mRNA水平的影響

使用SB203580后，煙曲霉組和β-葡聚糖組TNF?α mRNA表達(dá)水平均較使用前顯著降低（P＜0.01）。見表2。

表2 p38MAPK信號通路抑制劑SB203580對煙曲霉上調(diào)THP?1細(xì)胞TNF?α mRNA水平的影響（±s）

表2 p38MAPK信號通路抑制劑SB203580對煙曲霉上調(diào)THP?1細(xì)胞TNF?α mRNA水平的影響（±s）

注：n=3。a與空白對照組比較，P＜0.001；b與未用SB203580阻斷組比較，P＜0.01

組別煙曲霉組β-葡聚糖組空白對照組未用SB203580 187.23±21.62a 62.14±2.36a 1.13±0.36加SB203580 3.83±0.62b 5.26±1.39b 1.08±0.25

討 論

外來病原體入侵機(jī)體時(shí)，啟動(dòng)固有性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，形成穩(wěn)固復(fù)雜的免疫網(wǎng)絡(luò)，清除致病菌。巨噬細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞通過細(xì)胞表面或內(nèi)部的模式識別受體識別暴露于病原微生物表面的病原相關(guān)分子模式，啟動(dòng)快速的炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，分泌大量炎癥細(xì)胞因子和趨化因子，觸發(fā)細(xì)胞的吞噬作用、呼吸爆發(fā)等功能，進(jìn)而啟動(dòng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，促進(jìn)機(jī)體對真菌病原體的清除。作為抗感染免疫反應(yīng)的第一道防線，單核巨噬細(xì)胞對識別、清除入侵的煙曲霉起重要作用[4?5]。TNF?α主要由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是炎癥起始階段非常關(guān)鍵的炎性細(xì)胞因子。體外試驗(yàn)表明[6]，TNF?α能增強(qiáng)肺泡巨噬細(xì)胞對分生孢子的特有吞噬作用以及中性粒細(xì)胞對真菌菌絲的破壞作用，拮抗TNF?α作用會導(dǎo)致感染煙曲霉的試驗(yàn)小鼠死亡率增高、肺部霉菌負(fù)荷增高，而TNF?α增效劑提高了其生存率。多項(xiàng)研究顯示[7?8]，接受抗TNF治療的患者更加容易罹患念珠菌病、曲霉菌病、組織胞漿菌病等深部真菌感染。

本研究初步發(fā)現(xiàn)，兩種濃度的煙曲霉作用THP?1細(xì)胞后，均上調(diào)TNF?α mRNA水平，并呈現(xiàn)時(shí)間依賴效應(yīng)。在刺激3h后TNF?α mRNA水平上升，刺激6h后106CFU/ml煙曲霉組mRNA水平約為3h的6.5倍，而107CFU/ml組則升高將近20倍。本研究采用β-葡聚糖作為激活THP?1細(xì)胞的陽性對照物，發(fā)現(xiàn)其也能誘導(dǎo)出相同的時(shí)間依賴效應(yīng)，刺激6h后TNF?α mRNA水平比3h組上升6.3倍。107CFU/ml煙曲霉作用THP?1細(xì)胞24h后，上清液中TNF?α含量明顯升高，表明煙曲霉不僅在mRNA水平誘導(dǎo)THP?1細(xì)胞上調(diào)TNF?α的轉(zhuǎn)錄，而且在蛋白水平提高該因子的分泌量。

研究發(fā)現(xiàn)[9?10]，在煙曲霉感染過程中，巨噬細(xì)胞可以通過其表面的C型凝集素受體1（Dectin?1）、Toll樣受體2（TLR?2）和NOD樣受體2（NOD2）促進(jìn)TNF?α的釋放。p38MAPK分子是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，是真核細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞外信號到細(xì)胞內(nèi)引起細(xì)胞反應(yīng)的一類重要信號系統(tǒng)[11]。p38MAPK作為MAPK家族成員之一，當(dāng)細(xì)胞接受適宜刺激后，p38MAPK被激活后可使一些轉(zhuǎn)錄因子，如轉(zhuǎn)錄活化因子1（ATF?1）、ATF?2、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白及轉(zhuǎn)錄激活蛋白的絲氨酸和蘇氨酸位點(diǎn)磷酸化，激活后可以轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。p38MAPK的激活可誘導(dǎo)多種基因的表達(dá)，共同調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，是促進(jìn)TNF?α產(chǎn)生的重要活化分子[12]。吡啶異咪噠唑化合物SB203580是p38MAPK激酶特異性抑制劑，能競爭性結(jié)合到p38α、p38β的ATP結(jié)合位點(diǎn)上，抑制其磷酸化，導(dǎo)致p38MAPK失去激酶活性，從而有效抑制p38MAPK信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[13?14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，煙曲霉刺激后15 min即出現(xiàn)p38MAPK蛋白磷酸化，30 min時(shí)p38MAPK磷酸化水平顯著升高。表明煙曲霉刺激人THP?1細(xì)胞后可出現(xiàn)p38MAPK蛋白磷酸化。進(jìn)一步通過p38MAPK信號通路的特異性抑制劑SB203580阻斷信號通路，發(fā)現(xiàn)TNF?α mRNA表達(dá)水平較未用SB203580組明顯減低。實(shí)驗(yàn)中選擇類似于人體內(nèi)單核巨噬細(xì)胞系的THP?1細(xì)胞，可以在體外一定程度上模擬煙曲霉感染人體、侵犯機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的過程。煙曲霉對人THP?1細(xì)胞刺激后可誘導(dǎo)p38MAPK途徑出現(xiàn)活化，TNF?α在mRNA水平、蛋白水平表達(dá)量升高，并且在一定程度內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性、時(shí)間依賴性。表明單核細(xì)胞可能參與抗煙曲霉感染固有免疫反應(yīng)。