許新雅 許慶芳 鄭躍 黎鈺瑩 黃云芬 龔子鑒 陸春 賴維

510630廣州，中山大學附屬第三醫(yī)院皮膚科

晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE）是蛋白質(zhì)、脂類、核酸等大分子物質(zhì)的游離氨基與還原糖通過非酶糖化反應(yīng)生成不可逆及不易降解的大分子棕色產(chǎn)物。AGE在光老化皮膚中大量堆積，并在光老化多個環(huán)節(jié)中起重要作用[1]。AGE被巨噬細胞、成纖維細胞等胞吞后，可被泛素蛋白酶體或溶酶體蛋白酶降解[2?4]。我們發(fā)現(xiàn)，光老化的人皮膚成纖維細胞溶酶體組織蛋白酶B（CatB）、CatD等表達降低以及對吞入胞內(nèi)AGE降解減少，且尚不清楚何種蛋白酶調(diào)控皮膚成纖維細胞可降解吞入胞內(nèi)的AGE。本研究觀察蛋白酶活性抑制劑、慢病毒轉(zhuǎn)染介導的蛋白酶高表達對皮膚成纖維細胞降解吞入胞內(nèi)AGE的影響。

材料與方法

一、 實驗材料

Dulbecco改良Eagle高糖培養(yǎng)基（DMEM）、胰酶、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（PBS）、青鏈霉素均為美國Gibco公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白（BSA）、AGE?BSA（美國Biovision公司）；一抗兔抗人CatD?IgG抗體、內(nèi)參兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆IgG抗體、二抗辣根過氧化物酶（HRP）-羊抗兔IgG均為美國Cellsignalingtechnology公司產(chǎn)品。二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（美國Pierce公司）。增強化學發(fā)光（ECL）顯色試劑盒（美國Millipore公司），預(yù)染Marker（加拿大Mbi fermentas公司）?？俁NA提取試劑Trizol（美國Invitrogen公司）。PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix EX TaqTM試劑盒（日本Takara公司）。CatB、CatD、CatL活性檢測試劑盒（美國Biovision公司）。蛋白酶抑制劑CA074Me、天冬氨酸酶抑制劑（pepstatin A）、MG?132均為美國MedChemExpress公司產(chǎn)品。酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Biotek公司），流式細胞儀（美國BD Biosciences公司），激光掃描共聚焦顯微鏡（德國ZEISS公司）。

二、 方法

1.原代皮膚成纖維細胞培養(yǎng)：取中山大學附屬第三醫(yī)院泌尿外科健康兒童包皮環(huán)切術(shù)后的包皮組織，所選人群年齡5～9歲，平均6歲。參照文獻[5]分離培養(yǎng)皮膚成纖維細胞，第3代細胞凍存。細胞復(fù)蘇后4～10代細胞行后續(xù)實驗。在予AGE?BSA孵育細胞前及AGE?BSA孵育細胞過程中，均以含2%胎牛血清細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)各組細胞。本研究經(jīng)過中山大學附屬第三醫(yī)院倫理委員會批準。

2.CCK8法檢測蛋白酶抑制劑對細胞活性的影響：將細胞按5×103個/孔密度接種于96孔板，每孔含100 μl細胞培養(yǎng)液。實驗分4組，每組各設(shè)3個復(fù)孔，即細胞培養(yǎng)24h后，各組分別加入1 μmol/L CA074Me、75 μmol/L pepstatin A、1 μmol/L MG?132及等量PBS（對照組）。孵育4h，去除抑制劑，每孔加入10 μl CCK8試劑，37℃孵育4h，酶聯(lián)免疫檢測儀上測定A450值，細胞增殖率=（實驗組A值－空白A值）/（對照組A值－空白A值）×100%。另設(shè)37.5、75、150 μmol/L pepstatin A組及空白對照組（加PBS處理），步驟同上，檢測各組細胞增殖活性，實驗重復(fù)3次。

3.熒光法檢測成纖維細胞CatB、CatD、CatL、20S蛋白酶體酶活性：提取CA074Me組、pepstatin A組、1 μmol/L MG?132組及相應(yīng)對照組的總蛋白，BCA法蛋白定量。取50 μl細胞裂解后上清液加入50 μl反應(yīng)緩沖液，混合后分別加入CatB+CatL、CatD及20S蛋白酶體相應(yīng)的底物7-氨基-4-三氟甲基香豆素（AFC）、7-甲氧基-4-乙?；愣顾兀∕CA）及熒光多肽底物（LLVY?R110），使其終濃度為200 μmol/L，37℃孵育1.5h。多功能酶標儀分別檢測游離AFC[激發(fā)光波長（λex）400 nm，發(fā)射光波長（λem）505 nm]，MCA（λex 328 nm，λem 460 nm），LLVY?R110（λex 480 nm，λem 520 nm）的熒光強度。計算每組細胞用酶標儀檢測的熒光強度值與其蛋白濃度比值即為該組細胞酶的相對活性。

分別提取37.5、75和150 μmol/L pepstatin A組及對照組總蛋白，BCA法蛋白定量。按上述實驗步驟，多功能酶標儀分別檢測游離MCA熒光強度。計算每組MCA熒光強度與蛋白濃度比值即為細胞酶的相對活性。

4.流式細胞儀檢測蛋白酶抑制劑對皮膚成纖維細胞降解吞入胞內(nèi)AGE?BSA的影響：參照前期研究[6]，以200 mg/L AGE?BSA為本實驗濃度。實驗分為8組，對照組、CA074Me組、pepstatin A組和MG?132組細胞分別加入PBS、1 μmol/L CA074Me、75 μmol/L pepstatin A和1 μmol/L MG?132孵育4h；AGE?BSA組、AGE?BSA+CA074Me組、AGE?BSA+pepstatin A組和AGE?BSA+MG?132組分別加入PBS、1 μmol/L CA074Me、75 μmol/L pepstatin A、1 μmol/L MG?132 孵育4h（設(shè)為0h點）后，加入200 mg/L AGE?BSA孵育細胞8h（設(shè)為8h點），再去除AGE?BSA，分別以含相應(yīng)抑制劑的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h（設(shè)為32h點），收集這3個時間點各組細胞，流式細胞儀檢測吞入胞內(nèi)AGE?BSA熒光強度。實驗重復(fù)3次。

5.ELISA檢測皮膚成纖維細胞對吞入胞內(nèi)AGE?BSA的降解率：設(shè)37.5、75、150 μmol/L pepstatin A組，孵育細胞4h（設(shè)為0h點）。之后各組加入200 mg/L AGE?BSA孵育8h（設(shè)為8h點），再去除AGE?BSA并分別以含相應(yīng)濃度pepstatin A的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h（設(shè)為32h點），收集8h和32h點各組細胞蛋白并以BCA法進行蛋白定量。按照AGE ELISA試劑盒說明操作，繪制標準曲線。根據(jù)各樣品A值計算AGE濃度。AGE?BSA降解率 =（T8h-T32h）/T8h，T8h、T32h分別為8h、32h時的AGE濃度。

6.慢病毒轉(zhuǎn)染皮膚成纖維細胞：高表達CatD慢病毒（pCDH?CMV?MCS?EF1?CatD?copGFP）及空載病毒由上海吉瑪公司構(gòu)建。將細胞消化并接種至6 cm培養(yǎng)皿，每孔5×104，待細胞生長至70%融合時轉(zhuǎn)染。實驗分為3組：空白對照組，不予處理；空載病毒轉(zhuǎn)染組（空載轉(zhuǎn)染組），細胞中加入空載病毒液；CatD高表達慢病毒轉(zhuǎn)染組（CatD轉(zhuǎn)染組），細胞中加入高表達CatD慢病毒。感染復(fù)數(shù)MOI=100，混勻，置于細胞培養(yǎng)箱。24h后換液，倒置熒光顯微鏡下觀察（λex 488 nm，λem 507 nm），轉(zhuǎn)染成功的細胞有綠色熒光蛋白表達。每皿隨機取3個無重疊視野，同一視野下分別以熒光顯微鏡計算熒光陽性細胞，以普通顯微鏡計算細胞總數(shù)，熒光率=（陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)）×100%。

7.RT?PCR檢測皮膚成纖維細胞CatD mRNA表達變化：按上述實驗分組，用Trizol試劑盒方法提取空白對照組、空載轉(zhuǎn)染組和CatD轉(zhuǎn)染組總RNA。檢測方法同文獻[7]。CatD上游引物序列5′?AGAAGCTGGT GGACCAGAACATC?3′，下游引物序列5′?TCCAGGT GGACCTGCCAGTA?3′，擴增片段長度 163 bp；GAPDH上游引物序列5′?GCACCGTCAAGGCTGAG AAC?3′，下游引物序列5′?TGGTGAAGACGCCAGTG GA?3′，擴增片段長度138 bp。

8.Western印跡法檢測皮膚成纖維細胞CatD蛋白表達變化：方法同文獻[7]。按上述分組，提取空白對照組、空載轉(zhuǎn)染組和CatD轉(zhuǎn)染組的總蛋白，置-80℃保存。蛋白定量、電泳，電轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯膜上。各組分別加入一抗兔抗人CatD?IgG（1∶1 000稀釋），兔抗人GAPDH?IgG（1∶4 000），4℃搖床孵育過夜，TBST液洗膜，加入HRP-羊抗兔IgG（1∶2 000），37℃孵育1h，TBST液洗膜3次，ECL顯色。實驗重復(fù)3次。

9.高表達CatD慢病毒轉(zhuǎn)染對成纖維細胞降解吞入胞內(nèi)AGE?BSA的影響：按上述分組，高表達CatD慢病毒轉(zhuǎn)染細胞48h后，加入AGE?BSA孵育8h后去除，以新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。ELISA法檢測各組細胞AGE?BSA濃度，計算降解率。

10.統(tǒng)計學處理：采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，各組數(shù)據(jù)均以±s表示。兩獨立樣本間比較采用獨立樣本t檢驗，同一組不同處理前后比較采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩多重比較采用LSD?t檢驗。P＜0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、 蛋白酶抑制劑對皮膚成纖維細胞CatB+CatL、CatD及蛋白酶體活性的影響

CA074Me組、75 μmol/L pepstatin A組及MG?132組細胞增殖活性分別為（97.36±0.97）%、（96.60±0.70）%、（97.23±1.44）%，對照組為100%，4組間差異無統(tǒng)計學意義（F=1.525，P＞0.05）。

CA074Me組 CatB+CatL 酶活性、75 μmol/L pepstatin A組CatD酶活性及MG?132組蛋白酶體活性分別為0.90±0.04、0.83±0.10、11.59±1.64，均顯著低于相應(yīng)對照組（分別為1.18±0.05、1.20±0.05、21.85 ± 3.91，t值分別為8.317、5.985、4.196，均P＜0.05）。因此，本實驗所選用的抑制劑濃度均可有效抑制相應(yīng)的酶活性。

二、 蛋白酶抑制劑對皮膚成纖維細胞降解吞入胞內(nèi)AGE?BSA的影響

見圖1。流式細胞儀檢測顯示，細胞在8h點，無AGE?BSA處理的對照組、pepstatin A組、CA074Me組和MG?132組AGE?BSA熒光強度均分別顯著低于相對應(yīng)加AGE?BSA處理組，t值分別 為 21.765、24.573、25.822、22.552，均P＜0.05。去除AGE?BSA 24h后，CA074Me+AGE?BSA組和MG?132+AGE?BSA組胞內(nèi)AGE?BSA熒光強度與同時間點AGE?BSA組差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），但均較其相應(yīng)8h點顯著下降（配對t值分別為4.778、6.154，均P＜ 0.05）。而pepstatin A+AGE?BSA組8h和32h點的熒光強度差異無統(tǒng)計學意義（配對t=0.887，P＞0.05），但均分別顯著高于AGE?BSA組（均P＜0.05）。

三、 不同濃度pepstatin A對皮膚成纖維細胞降解吞入胞內(nèi)AGE?BSA的影響

CCK8法檢測顯示，37.5、75、150 μmol/L pepstatin A組及對照組細胞增殖活性差異無統(tǒng)計學意義；熒光法檢測顯示，CatD酶活性差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且各濃度pepstatin A組顯著低于對照組（均P＜0.05）。見表1。

ELISA 檢測結(jié)果顯示，37.5、75和150 μmol/L pepstatin A組24h內(nèi)對胞內(nèi)AGE?BSA降解率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。組間兩兩比較差異亦有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

四、 慢病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)皮膚成纖維細胞CatD表達和活性

見圖2、3。慢病毒轉(zhuǎn)染細胞48h后，空白對照組細胞未見熒光，空載轉(zhuǎn)染組和CatD轉(zhuǎn)染組熒光率均＞80%。CatD轉(zhuǎn)染組、空白對照組、空載轉(zhuǎn)染組間CatD mRNA、蛋白表達及酶活性差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜ 0.05）。見表2。LSD?t檢驗顯示，CatD轉(zhuǎn)染組CatD mRNA、蛋白表達及酶活性顯著高于空白對照組及空載轉(zhuǎn)染組（均P＜0.05），但空白對照組與空載轉(zhuǎn)染組相比差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

五、 高表達CatD對皮膚成纖維細胞降解吞入胞內(nèi)AGE?BSA的影響

ELISA顯示，AGE?BSA組、空載轉(zhuǎn)染 +AGE?BSA組和CatD轉(zhuǎn)染+AGE?BSA組細胞對吞入胞內(nèi)AGE?BSA的降解率分別為14.57%±0.21%、14.67%±0.61%和20.33%±1.52%，差異有統(tǒng)計學意義（F=24.33，P＜ 0.05）。LSD?t檢驗顯示，CatD轉(zhuǎn)染 +AGE?BSA組明顯高于另2組（均P＜0.05），且另2組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 流式細胞儀檢測蛋白酶活性抑制劑對皮膚成纖維細胞降解吞入胞內(nèi)AGE?BSA的影響 a：與AGE?BSA組相比，P＜0.05

表1 不同濃度pepstatin A對皮膚成纖維細胞增殖活性、CatD活性和降解胞內(nèi)AGE的影響（±s）

表1 不同濃度pepstatin A對皮膚成纖維細胞增殖活性、CatD活性和降解胞內(nèi)AGE的影響（±s）

注：n=3。pepstatin A：天冬氨酸酶抑制劑；CatD：溶酶體組織蛋白酶D；AGE?BSA：晚期糖基化終末產(chǎn)物-牛血清白蛋白

組別 細胞增殖活性（%）32h時AGE?BSA濃度（mg/g）8h時 降解率（%）對照組37.5 μmol/L pepstatin A 75 μmol/L pepstatin A 150 μmol/L pepstatin A F值P值100 99.01±0.26 98.92±0.36 98.63±0.45 1.607＞0.05 CatD酶相對活性1.20±0.05 0.43±0.05 0.22±0.04 0.07±0.02 68.844＜0.05 332.33±8.50 347.00±10.54 363.00±6.56 300.33±11.59 327.33±9.02 350.67±5.03 9.64±1.27 5.62±0.47 3.21±0.73 45.876＜0.05

討 論

既往認為AGE極難降解，而現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，AGE可被巨噬細胞、成纖維細胞等胞吞后被溶酶體CatB、CatL、CatD或泛素蛋白酶體降解清除[2?4]。我們前期研究已發(fā)現(xiàn)[8]，皮膚成纖維細胞可胞吞和降解胞外AGE，光老化抑制了皮膚成纖維細胞對吞入胞內(nèi)AGE降解。值得注意的是，光老化皮膚成纖維細胞中蛋白酶體活性以及一些組織蛋白酶表達和活性均下降[9]，提示AGE降解減少可能與該酶表達及活性下降有關(guān)。然而，哪種蛋白酶參與調(diào)控皮膚成纖維細胞降解吞入胞內(nèi)AGE尚不清楚。

本實驗先以流式細胞儀研究抑制蛋白酶活性對皮膚成纖維細胞降解吞入胞內(nèi)AGE影響。結(jié)果顯示，抑制CatB、CatL及蛋白酶體活性對皮膚成纖維細胞降解吞入胞內(nèi)AGE?BSA無顯著影響，但抑制CatD活性可顯著降低皮膚成纖維細胞對吞入胞內(nèi)AGE?BSA的降解。然后，我們采用ELISA檢測不同濃度CatD抑制劑pepstatin A對皮膚成纖維細胞降解吞入胞內(nèi)AGE?BSA的影響，發(fā)現(xiàn)pepstatin A可抑制皮膚成纖維細胞降解吞入胞內(nèi)AGE?BSA，呈濃度依賴性。因pepstatin A除了抑制CatD活性外，還抑制CatE活性。為排除CatE的調(diào)控作用，我們進一步通過構(gòu)建CatD過表達慢病毒載體，研究特異性上調(diào)皮膚成纖維細胞CatD表達和活性對其降解吞入胞內(nèi)AGE?BSA影響，結(jié)果顯示，高表達CatD可顯著促進皮膚成纖維細胞對吞入胞內(nèi)AGE?BSA的降解。

圖2 熒光顯微鏡下觀察慢病毒轉(zhuǎn)染成纖維細胞的綠色熒光蛋白表達情況（×100） 2A：空白對照組；2B：空載病毒轉(zhuǎn)染組；2C：CatD高表達慢病毒轉(zhuǎn)染組

圖3 Western印跡法檢測各組成纖維細胞CatD蛋白表達變化1：空白對照組；2：空載病毒轉(zhuǎn)染組；3：CatD高表達慢病毒轉(zhuǎn)染組

表2 慢病毒轉(zhuǎn)染對皮膚成纖維細胞CatD mRNA及蛋白表達和CatD酶活性的影響（±s）

表2 慢病毒轉(zhuǎn)染對皮膚成纖維細胞CatD mRNA及蛋白表達和CatD酶活性的影響（±s）

注：n=3。CatD蛋白相對表達量=CatD灰度值/GAPDH灰度值。CatD：溶酶體組織蛋白酶D

組別空載病毒轉(zhuǎn)染組CatD高表達慢病毒轉(zhuǎn)染組空白對照組F值P值CatD mRNA（2-ΔΔCt）0.21±0.02 2.43±0.10 0.21±0.02 1 507.90＜0.05 CatD蛋白相對表達量0.92±0.04 1.51±0.05 0.96±0.04 135.76＜0.05 CatD酶相對活性1.19±0.06 3.14±0.08 1.20±0.06 879.76＜0.05

有學者證實[10]，在老年大鼠神經(jīng)元中CatD表達增高，且與脂褐素等衰老相關(guān)蛋白沉積位置相重合，提示CatD很可能在降解細胞內(nèi)堆積的變性蛋白中起重要作用。CatD還含有很強降解變性蛋白的肽鏈內(nèi)切酶，與公認能降解AGE的胃蛋白酶有類似化學結(jié)構(gòu)，且AGE在溶酶體酸性環(huán)境中變性后更易與蛋白水解酶的肽鍵結(jié)合并被降解[11]。更為重要的是，CatD可直接參與并調(diào)控細胞自噬[12?13]，進而調(diào)控 AGE在溶酶體內(nèi)的降解。然而，目前研究揭示溶酶體和泛素蛋白酶體在降解吞入胞內(nèi)變性蛋白中起協(xié)同作用。Stolzing等[2]以AGE?BSA孵育體外培養(yǎng)神經(jīng)小膠質(zhì)細胞，發(fā)現(xiàn)AGE?BSA能被胞吞，然后被胞內(nèi)20S蛋白酶體和溶酶體酶降解。但Bulteau等[3]發(fā)現(xiàn)，羧乙基賴氨酸（AGE主要結(jié)構(gòu)之一）能抵抗20S蛋白酶體降解。Grimm等[4]以純化CatD、CatB以及20S蛋白酶體等分別孵育AGE，發(fā)現(xiàn)20S蛋白酶體完全不能降解AGE，CatD、CatB能降解AGE，其中CatD降解活性顯著高于CatB。隨后，他們又研究鼠胚胎成纖維細胞和巨噬細胞系RAW264.7細胞對胞外AGE的降解，發(fā)現(xiàn)CatD在降解吞入胞內(nèi)的AGE中起重要作用[10]。這些不同的研究結(jié)果可能與采用不同的細胞系、不同種類及濃度AGE有關(guān)。溶酶體其他蛋白酶和蛋白酶體是否調(diào)控皮膚成纖維細胞降解其他種類AGE有待進一步研究。

CatD在皮膚成纖維細胞降解吞入胞內(nèi)AGE中起重要作用，而我們的前期研究發(fā)現(xiàn)光老化皮膚及皮膚成纖維細胞CatD表達均下降，并且光老化抑制了皮膚成纖維細胞對吞入胞內(nèi)AGE的降解。本實驗僅從皮膚成纖維細胞模型上研究，并證實了CatD對胞內(nèi)AGE降解的調(diào)控作用，而在動物模型、人體光老化皮膚中CatD表達是否與AGE堆積相關(guān)尚未研究。