王敏 耿清偉 高亞麗 華優(yōu) 宋秀祖

310009杭州，安徽醫(yī)科大學(xué)杭州臨床學(xué)院 杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科

自噬是真核細(xì)胞一種重要代謝過程，通過溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)變性的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器等物質(zhì)以維持正常生理功能。既往研究證實[1?4]，白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞存在自噬異常，通過促進(jìn)自噬恢復(fù)黑素細(xì)胞正常生理功能可能對白癜風(fēng)的治療具有重要意義。窄譜中波紫外線（NB?UVB）治療白癜風(fēng)效果顯著，既往研究已經(jīng)證實，NB?UVB可以促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖、黑素合成及黑素細(xì)胞遷移，但具體機(jī)制尚未完全闡明[5]。本研究擬觀察NB?UVB對黑素細(xì)胞自噬水平及自噬信號途徑的影響，進(jìn)一步明確NB?UVB治療白癜風(fēng)的機(jī)制。

資料與方法

1.細(xì)胞、試劑及儀器：經(jīng)杭州市第三人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意并獲得患者知情同意，人黑素細(xì)胞取自本院泌尿外科包皮環(huán)切廢棄皮膚，按文獻(xiàn)[6]方法采用Hu16完全黑素細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。單丹（磺）酰戊二胺（MDC）為美國Sigma公司產(chǎn)品。鼠抗磷酸化磷酸腺苷蛋白激酶（p?AMPK）單克隆抗體、兔抗磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（p?mTOR）單克隆抗體、兔抗微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）多克隆抗體及鼠抗P62單克隆抗體（美國Abcam公司）；SS?01型NB?UVB輻照儀（上海希格瑪高技術(shù)有限公司），NB?UVB輻照儀（美國Solarlight公司）經(jīng)過Solar PMA輻射計校正。圖像采集使用Olympus BX?51熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

2.NB?UVB照射：體外培養(yǎng)的人黑素細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長至80%融合時進(jìn)行NB?UVB照射。照射前除去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗1次后，加入薄層PBS，以剛好覆蓋細(xì)胞為度。NB?UVB照射劑量設(shè)定0、50、100及200 mJ/cm2四組（照射時間分別為0、5、9及18 s）。照射后除去上覆的PBS，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。

3.MDC染色法標(biāo)記自噬體：黑素細(xì)胞經(jīng)NB?UVB照射后24h，加入5 mmol/L MDC，調(diào)整MDC終濃度為0.05 mmol/L。再放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育30 min。除去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，加入4%多聚甲醛溶液室溫固定40 min。熒光顯微鏡觀察拍照，細(xì)胞內(nèi)散在亮綠色熒光即為自噬體。每個細(xì)胞內(nèi)自噬體超過3個為自噬體陽性細(xì)胞。每組選擇8個視野，對各組細(xì)胞進(jìn)行自噬體陽性細(xì)胞計數(shù)并統(tǒng)計陽性百分率。

4.免疫印跡檢測自噬信號表達(dá)：黑素細(xì)胞經(jīng)NB?UVB照射后24h，常規(guī)提取蛋白并定量。將定量后的蛋白進(jìn)行凝膠電泳，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶液室溫封閉1h。分別加入兔抗p?mTOR、LC3抗體及鼠抗p?AMPK、P62抗體，4℃孵育過夜，TBST液洗膜3次，每次10 min。加入辣根過氧化物酶（HPR）標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔IgG，室溫孵育1h，TBST液洗膜3次?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測目的條帶，用Image J軟件分析條帶的灰度值，以目的片段與β肌動蛋白灰度比值作為蛋白表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

5.透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)：黑素細(xì)胞經(jīng)NB?UVB照射后24h，消化離心收集細(xì)胞，2.5%戊二醛固定，1%鋨酸后固定，乙醇梯度脫水，丙酮處理，包埋，切片及染色，透射電鏡下觀察。每組選擇8個視野觀察與拍照，計數(shù)黑素小體、自噬體及自噬溶酶體。

6.統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組間MDC染色、免疫印跡結(jié)果采用單因素方差分析比較，SNK法進(jìn)行兩兩比較。黑素小體、自噬體與自噬溶酶體數(shù)量采用Kruskal?Wallish檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，并用Mann?Whitney檢驗進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.MDC法測定黑素細(xì)胞自噬體變化：熒光顯微鏡下黑素細(xì)胞核周可見亮綠色熒光聚集，4組間自噬體陽性細(xì)胞百分率（表1）差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），100、200 mJ/cm2組均顯著高于對照組和50 mJ/cm2組，與對照組相比，q值分別為6.75、10.68；與50 mJ/cm2組相比，q值分別為5.55、8.48；均P＜ 0.05。而50 mJ/cm2組與對照組、200 mJ/cm2與100 mJ/cm2組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（q值分別為0.76、1.11，均P＞ 0.05）。見圖1、表1。

圖1 不同劑量NB?UVB照射黑素細(xì)胞后MDC染色變化 與對照組相比，50 mJ/cm2組自噬體陽性細(xì)胞（白色箭頭）數(shù)量無明顯增多；100和200 mJ/cm2組顯著增多

表1 不同劑量NB?UVB照射黑素細(xì)胞后自噬體染色陽性率、黑素小體數(shù)量、自噬體與自噬溶酶體數(shù)量以及免疫印跡檢測自噬相關(guān)蛋白表達(dá)變化（±s）

表1 不同劑量NB?UVB照射黑素細(xì)胞后自噬體染色陽性率、黑素小體數(shù)量、自噬體與自噬溶酶體數(shù)量以及免疫印跡檢測自噬相關(guān)蛋白表達(dá)變化（±s）

注：n=8。以目的片段與β肌動蛋白灰度比值作為自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平。aF值；bH值

自噬相關(guān)蛋白組別對照組50 mJ/cm2組100 mJ/cm2組200 mJ/cm2組F/H值P值自噬體染色陽性率（%）21.83±3.50 23.66±4.12 38.08±4.10 40.23±1.45 37.88a＜0.05黑素小體（個/視野）18.50±4.18 39.12±9.42 57.38±7.11 59.75±15.15 23.58b＜0.05自噬體與自噬溶酶體（個/視野）1.88±1.18 2.88±1.36 5.12±1.13 5.25±1.04 20.73b＜0.05 p?AMPK 0.40±0.02 0.51±0.04 0.85±0.05 0.84±0.06 105.05a＜0.05 p?mTOR 0.82±0.03 0.81±0.04 0.64±0.04 0.63±0.01 37.03a＜0.05 LC3Ⅱ/Ⅰ1.06±0.04 1.11±0.04 1.49±0.09 1.47±0.08 41.81a＜0.05 P62 0.94±0.08 0.99±0.10 0.63±0.05 0.69±0.02 25.62a＜0.05

2.免疫印跡法檢測p?AMPK、p?mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ及P62的表達(dá)：見表1。4組間p?AMPK、p?mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ及P62表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。100、200 mJ/cm2組p?AMPK表達(dá)量顯著增多，與對照組比，q值分別為 17.34、13.38；與 50 mJ/cm2組比，q值分別為11.20、9.03；均P＜ 0.05；LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)亦顯著增加，與對照組比，q值分別為8.40、8.51；與50 mJ/cm2組比，q值分別為7.33、7.35；均P＜ 0.05。p?mTOR及P62蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)，p?mTOR與對照組相比，q值分別為7.47、11.34；與50 mJ/cm2組相比，q值分別為5.80、7.43；P62與對照組相比，q值分別為 6.29、5.55；與 50 mJ/cm2組相比，q值分別為6.58、5.89，均P＜ 0.05。見圖2、表1。

圖2 免疫印跡法檢測NB?UVB照射黑素細(xì)胞后p?AMPK、p?mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ及P62的表達(dá) 1 ～ 4：分別為0（對照組）、50、100、200 mJ/cm2組。100、200 mJ/cm2組p?AMPK、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)顯著增加，而p?mTOR及P62蛋白表達(dá)量顯著下降

3.透射電鏡觀察自噬體、自噬溶酶體及黑素小體變化：黑素細(xì)胞中見清晰的黑素小體，呈致密深黑色圓形或橢圓形顆粒狀結(jié)構(gòu)，著色程度不同，散在或聚集分布。同時可見雙層膜狀結(jié)構(gòu)的自噬體、單層膜結(jié)構(gòu)的自噬溶酶體。4組間自噬體與自噬溶酶體數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（H=20.731，P＜0.05）。見表1。100、200 mJ/cm2組自噬體與自噬溶酶體數(shù)量顯著增多，與對照組比，Z值分別為3.26、3.30，與 50 mJ/cm2組比，Z值分別為 2.86、3.03，均P＜ 0.05；200mJ/cm2組與100mJ/cm2組相比、50mJ/cm2組與對照組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Z值分別為0.27、1.48，均P＞ 0.05）。

4組間黑素小體數(shù)量差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（H=23.583，P＜ 0.05）。50、100、200 mJ/cm2組與對照組相比，黑素小體數(shù)量均顯著增多（Z值分別為3.37、3.37、3.37，均P＜ 0.05）；100、200 mJ/cm2組分別與50 mJ/cm2組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z值分別為3.10、2.52，均P＜ 0.05）；100 mJ/cm2組與200 mJ/cm2組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z=0.42，P＞ 0.05）。見圖3、表1。

討 論

白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制尚未明確，遺傳、環(huán)境、氧化應(yīng)激、自身免疫等因素均可能與其發(fā)病相關(guān)[7?8]。近年來研究表明，自噬在白癜風(fēng)的發(fā)病中亦發(fā)揮重要作用[3]。自噬缺陷的黑素細(xì)胞可導(dǎo)致氧化還原失衡，從而破壞黑素細(xì)胞，可能與白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[9]。進(jìn)一步研究證實，誘導(dǎo)白癜風(fēng)患者皮損周圍黑素細(xì)胞自噬，發(fā)現(xiàn)黑素細(xì)胞的小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、酪氨酸酶及酪氨酸酶相關(guān)蛋白1表達(dá)均顯著升高，促進(jìn)黑素合成[10]。因此推測自噬參與了白癜風(fēng)的發(fā)生、發(fā)展過程。

既往研究[11?12]證實，NB?UVB照射能促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖及黑素合成，并且可以促進(jìn)黑素細(xì)胞遷移，在白癜風(fēng)復(fù)色中發(fā)揮作用。NB?UVB還可通過下調(diào)黑素細(xì)胞miRNA?25的表達(dá)，促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖，增加酪氨酸酶活性及黑素生成[11?12]。既往研究發(fā)現(xiàn)[13?14]，適宜劑量的UVB照射可以促進(jìn)HaCaT細(xì)胞及人皮膚成纖維細(xì)胞自噬。我們的前期研究觀察到，UVB具有促進(jìn)表皮細(xì)胞自噬的作用[15]。本研究首先觀察了NB?UVB對正常黑素細(xì)胞自噬的影響，結(jié)果顯示，100、200 mJ/cm2NB?UVB照射正常黑素細(xì)胞，MDC染色強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，染色陽性細(xì)胞數(shù)量增多，表明NB?UVB可以促進(jìn)正常黑素細(xì)胞發(fā)生自噬。

為進(jìn)一步確證自噬的發(fā)生，我們采用透射電鏡觀察了正常黑素細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果顯示，正常黑素細(xì)胞中黑素小體隨著NB?UVB照射劑量的增大而增多，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見較多單層膜空泡狀的自噬溶酶體及較少的雙層膜自噬體。而100、200 mJ/cm2NB?UVB照射組與對照組相比，自噬體及自噬溶酶體形成顯著增多，證實NB?UVB照射對正常黑素細(xì)胞自噬具有促進(jìn)作用。Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，缺乏自噬蛋白Atg7的黑素細(xì)胞出現(xiàn)早衰，細(xì)胞內(nèi)累積了較多的氧化損傷產(chǎn)物、泛素化蛋白及銜接蛋白P62，并導(dǎo)致自噬缺陷小鼠出現(xiàn)表皮輕度色素減退。此外，有研究[17]發(fā)現(xiàn)，結(jié)節(jié)性硬化癥患者的色素減退斑與黑素細(xì)胞自噬失調(diào)相關(guān)。結(jié)合我們的研究結(jié)果及以往研究報道，推測NB?UVB可通過上調(diào)黑素細(xì)胞的自噬水平促進(jìn)黑素細(xì)胞存活，在白癜風(fēng)治療中發(fā)揮作用。

圖3 透射電鏡觀察黑素細(xì)胞經(jīng)不同劑量NB?UVB照射后黑素小體、自噬體與自噬溶酶體數(shù)量的變化 A：自噬體與自噬溶酶體；M：黑素小體。黑素小體數(shù)量的變化：對照組細(xì)胞核旁見少量黑素小體，部分聚集；50 mJ/cm2組可見胞質(zhì)中較為稀疏的黑素小體，較對照組稍增多；100與200 mJ/cm2組均見胞質(zhì)中密集分布的黑素小體。自噬體與自噬溶酶體：對照組可見自噬體和自噬溶酶體；50 mJ/cm2組較對照組稍增多；100與200 mJ/cm2組均較對照組與50 mJ/cm2組顯著增多

AMPK/mTOR信號途徑是自噬的重要信號通路[18]。LC3是自噬的標(biāo)志蛋白，LC3Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3Ⅱ的水平標(biāo)示著自噬的活化程度[19]。P62是選擇性自噬途徑中的重要蛋白，其作為泛素化蛋白與自噬囊泡銜接蛋白，將泛素化蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至自噬體中降解，其蛋白表達(dá)與自噬強(qiáng)度成反比，自噬缺陷的細(xì)胞中常觀察到P62蓄積[20?21]。我們的研究表明，NB?UVB照射培養(yǎng)的人正常黑素細(xì)胞，可以抑制其p?mTOR信號活化，促進(jìn)p?AMPK活化從而誘導(dǎo)自噬發(fā)生。進(jìn)一步研究觀察到，LC3Ⅱ/Ⅰ顯著升高，P62蛋白表達(dá)顯著下降。Bridgeman等[22]研究表明，芹菜素可通過活化AMPK，抑制mTOR信號通路，調(diào)節(jié)UVB照射誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞自噬水平。

綜上所述，NB?UVB照射正常黑素細(xì)胞，可以活化其自噬信號通路，促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)自噬體和自噬溶酶體增加。推測NB?UVB治療白癜風(fēng)的機(jī)制可能與其提高白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞的自噬水平相關(guān)，進(jìn)一步的動物或臨床試驗可加以證明。