黃 楊 江浪清 孔勁松 鄭 鑫 宮小康 阮建偉 王海寶

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）的主要特點(diǎn)是關(guān)節(jié)軟骨退行性改變。流行病學(xué)分析和研究[1]發(fā)現(xiàn)，OA的進(jìn)展與關(guān)節(jié)的炎性水平密切相關(guān)。由關(guān)節(jié)軟骨、關(guān)節(jié)滑膜，還有軟骨下骨中釋放的相關(guān)因子，引發(fā)關(guān)節(jié)內(nèi)的炎性反應(yīng)，可促進(jìn)凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)軟骨細(xì)胞凋亡[2-4]。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬表達(dá)后，可通過清除細(xì)胞內(nèi)有害及過剩的細(xì)胞器和病原體，減少細(xì)胞的凋亡，起到保護(hù)細(xì)胞的作用。中醫(yī)認(rèn)為，OA屬“骨痹”范疇，以肝腎不足為本，寒濕、痰瘀痹阻經(jīng)絡(luò)為標(biāo)，故治療時強(qiáng)調(diào)補(bǔ)益肝腎。在臨床上多用補(bǔ)腎溫陽中藥治療OA，但防治干預(yù)機(jī)制尚不明確。已有研究[5]證實(shí)，溫陽補(bǔ)腎中藥能消除骨痹癥中的炎癥反應(yīng)。本研究觀察右歸飲對OA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞自噬和凋亡相關(guān)蛋白以及血清白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）表達(dá)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動 物 4周齡雄性Sprague Dawley大鼠30只，體質(zhì)量（200±20）g，購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動物中心/上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，大鼠在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心SPF級動物房中飼養(yǎng)，動物實(shí)驗(yàn)條件合格證：SYXK（浙）2013-0184。

1.2 藥 物 右歸飲（《景岳全書》），由熟地黃、制附子各 9g，肉桂 3g，山藥 6g，山茱萸 3g，枸杞 6g，炙甘草3g，姜杜仲6g組成，經(jīng)過煎煮、過濾、離心以及濃縮等程序，灌胃時將右歸飲細(xì)粉溶化至每毫升含生藥0.69g，備用。

1.3 試劑及儀器 ELISA試劑盒（批號20170601）購自江蘇酶標(biāo)生物科技公司，免疫印跡檢測抗體（批號Bcl-2兔抗 AG04279476、Bax兔抗 AG05085355、Becin-1 兔抗 AF07044415、mTOR 兔抗AF12262669）由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。電泳系統(tǒng)（美國Bio-RAD公司），高壓滅菌器（HVP-50，日本HIRAYAMA公司），三孔電熱恒溫水槽（上海齊欣科學(xué)儀器廠），凝膠成像儀（ChemiDoc XRS+System，美國Bio-RAD公司），電動玻璃勻漿機(jī)（DY89-Ⅱ，寧波新芝生物科技股份有限公司）。所有實(shí)驗(yàn)均在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模與給藥 （1）采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只雄性SD大鼠分為右歸飲組、模型組和空白對照組，每組10只。于動物房中飼養(yǎng)1周后，精確稱體質(zhì)量；（2）右歸飲組和模型組大鼠按0.3mL/100g體質(zhì)量水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉成功后，在大鼠的右側(cè)膝關(guān)節(jié)用Hulth法[6]進(jìn)行造模：用刀片沿右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱向切開1.5cm，暴露出內(nèi)側(cè)副韌帶及關(guān)節(jié)囊，挑斷內(nèi)側(cè)副韌帶后，繼續(xù)鈍性分離和松解關(guān)節(jié)囊，將髕骨推向外側(cè)脫位，暴露并切斷前叉韌帶，摘除內(nèi)側(cè)半月板，剪斷后交叉韌帶，經(jīng)抽屜實(shí)驗(yàn)檢查確認(rèn)造模成功后，復(fù)位髕骨，縫合關(guān)節(jié)囊及皮膚。術(shù)后肌注青霉素（4萬U/mL）1mL抗感染，連續(xù)注射3天?？瞻捉M大鼠無任何處理。（3）從造模當(dāng)日起，對所有大鼠進(jìn)行正常飼養(yǎng)。在造模后的第4周，對右歸飲組大鼠每次10g/kg體質(zhì)量的右歸飲灌胃治療，同時以模型組和空白對照組大鼠等量的生理鹽水灌胃，每天1次，至造模后第8周。

2.2 標(biāo)本采集 （1）造模結(jié)束后第8周，對所有大鼠進(jìn)行心臟采血，注入抗凝管靜置2h后，3000r/min離心20min，將上層血清分離，56℃滅活30min，抽濾除菌后，分裝，-20℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩＃?）大鼠心臟采血后，迅速行手術(shù)截取大鼠的右下肢，切開皮膚和皮下筋膜，剝離關(guān)節(jié)囊，暴露出右膝關(guān)節(jié)，由關(guān)節(jié)面上下各1.5cm截骨，獲取膝關(guān)節(jié)組織標(biāo)本，對每組5只大鼠取其關(guān)節(jié)滑膜用于本實(shí)驗(yàn)的免疫印跡檢測。（3）對每組其余5只大鼠的膝關(guān)節(jié)樣本使用10%的磷酸鹽緩沖液甲醛固定3天，然后用14%EDTA脫鈣4周，石蠟包埋。

2.3 ELISA法檢測血清IL-1β、TNF-α及iNOS水平

采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）測定各組SD大鼠血清白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）水平。

2.4 免疫印跡檢測關(guān)節(jié)滑膜自噬與凋亡蛋白表達(dá)采用Western-blot檢測大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜自噬蛋白Beclin-1、mTOR 和凋亡蛋白 Caspase-3、Bax表達(dá)水平。

2.5 膝關(guān)節(jié)組織標(biāo)本病理學(xué)檢測 膝關(guān)節(jié)標(biāo)本經(jīng)過石蠟包埋后，采用HE染色觀察軟骨形態(tài)學(xué)改變，Mankin’s評分方法定量分析軟骨損傷情況。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間差異采用兩兩比較的q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大鼠血清IL-1β、TNF-α和iNOS表達(dá) 與空白對照組比較，右歸飲組、模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α 和 iNOS水平顯著增高（P均＜0.01）；右歸飲組大鼠血清IL-1β、TNF-α、iNOS表達(dá)水平明顯低于模型組（P＜0.01），見表 1。

表 1 各組大鼠血清 IL-1β、TNF-α、iNOS 水平比較（±s）

表 1 各組大鼠血清 IL-1β、TNF-α、iNOS 水平比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；IL-1β：白細(xì)胞介素1β；TNF-α：腫瘤壞死因子；iNOS：誘導(dǎo)型一氧化氮合酶

組別空白對照組模型組右歸飲組鼠數(shù)10 10 10 IL-1β（pg/mL）11.98±1.51 26.76±1.93*20.27±1.41*△TNF-α（pg/mL）89.87±13.54 221.34±19.38*162.63±10.76*△iNOS（U/mL）5.15±0.66 10.13±0.96*7.32±0.48*△

3.2 大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜蛋白表達(dá) 與空白對照組比較，右歸飲組、模型組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜Beclin、Bax、Caspase表達(dá)量顯著增高（P均＜0.01）；右歸飲組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜mTOR和Beclin-1表達(dá)量顯著高于模型組（P＜0.01），Caspas-3和 Bax表達(dá)量顯著低于模型組（P＜0.01），見封二圖 1、表 2。

3.3 膝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)檢測 膝關(guān)節(jié)組織標(biāo)本經(jīng)過石蠟包埋后，采用HE染色觀察軟骨形態(tài)學(xué)改變，同時采用Mankin’s評分方法[7]定量分析關(guān)節(jié)軟骨損傷情況（見表3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白對照組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)染色成粉紅色，細(xì)胞核被染成深藍(lán)色，軟骨細(xì)胞的排列均勻，潮線結(jié)構(gòu)完整，關(guān)節(jié)面光滑，層次分明。模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞排列紊亂，軟骨面有大面積缺損，潮線大量破壞；右歸飲組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表面毛糙，部分潮線破壞，軟骨細(xì)胞排列尚均勻。Mankin,s評分結(jié)果，模型組與右歸飲組評分高于空白對照組（P均＜0.01），模型組評分高于右歸飲組（P＜0.01）。見封二圖 2。

圖1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜蛋白表達(dá)

圖2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨病理

表 3 各組 Mankin’s評分表（分，±s）

表 3 各組 Mankin’s評分表（分，±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01

組別空白對照組模型組右歸飲組鼠數(shù)5 5 5 Mankin’s評分0.60±0.55 8.20±0.84*5.20±0.84*△

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)，OA關(guān)節(jié)中炎性因子iNOS、IL-1β、TNF-α等與軟骨表面受體結(jié)合，從而激活軟骨細(xì)胞中C-Jun氨基末端激酶（C-Jun N-terminal Kinase，JNK）JNK、核轉(zhuǎn)錄因子-kB（nuclear factor-Kappa B，NF-kB）、p38絲裂原化蛋白激酶（mitogen-actirated protein kinase，p38 MAPK）等信號通路[8]，誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨釋放基質(zhì)金屬蛋白激酶（matrix metalloproteinase，MMPs），破壞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成與空間正常結(jié)構(gòu)。自噬是真核細(xì)胞降解自身成分的一種代謝途徑，通過溶酶體機(jī)制清除變性的胞漿成分、毒素和病原體，維持細(xì)胞的存活和穩(wěn)態(tài)。

mTOR信號通路是目前研究最多的一種自噬調(diào)節(jié)機(jī)制[9]，通過激活mTOR通路啟動自噬，而Beclin-1為自噬的相關(guān)性蛋白，常常用于檢測細(xì)胞的自噬水平，可反應(yīng)自噬水平的高低。自噬在免疫應(yīng)答中與炎性反應(yīng)關(guān)系密切，研究發(fā)現(xiàn)自噬基因Atg16L1的缺乏可導(dǎo)致大量的炎性因子的釋放[10-11]。自噬通路及相關(guān)蛋白平衡機(jī)體免疫和炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的利弊效應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體抗感染、自身免疫及炎性等疾病，可以達(dá)到保護(hù)機(jī)體的目的。

右歸飲作為補(bǔ)腎溫陽的代表方，以溫腎陽為主，而陰陽兼顧，肝脾腎并補(bǔ)[12]。OA的中醫(yī)病機(jī)主要是腎陽虧虛，氣滯血瘀。臨床報道[13-14]血循環(huán)瘀滯，血液凝血酶和凝血因子復(fù)合物增加，會刺激血管內(nèi)皮合成和釋放 IL-1β、TNF-α、iNOS、IL-6、IL-8、MCP-1、CRP等炎性因子，且炎性因子釋放水平與血瘀證呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，右歸飲治療后，大鼠滑膜自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達(dá)上調(diào)，mTOR蛋白表達(dá)量下調(diào)。同時，凋亡蛋白Bax、Caspase-3含量減少（P均＜0.01），說明右歸飲治療可以誘導(dǎo)大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜自噬表達(dá)上調(diào)，減少細(xì)胞的凋亡。右歸飲組大鼠血清IL-1β、TNF-α、iNOS 等炎性因子水平明顯降低，而HE染色觀察到膝關(guān)節(jié)面破壞和軟骨缺失程度較輕且Mankin評分較低，說明右歸飲治療后大鼠關(guān)節(jié)內(nèi)炎性浸潤緩解，軟骨破壞得到有效的改善。

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜蛋白表達(dá)量比較（±s）

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜蛋白表達(dá)量比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.01;與模型治療組比較，△P＜0.01；Caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；Bax：B細(xì)胞淋巴瘤基因-2相關(guān)X蛋白；Beclin-1：BECN-1基因編碼蛋白；mTOR：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶

組別空白對照組模型組右歸飲組鼠數(shù)5 5 5 Caspase-3/GAPDH 0.08±0.02 0.60±0.12*0.25±0.07*△Bax/GAPDH 0.19±0.05 0.79±0.11*0.48±0.14*△Beclin-1/GAPDH 0.26±0.12 0.54±0.08*0.94±0.11*△mTOR/GAPDH 0.49±0.13 0.16±0.09*0.61±0.18*△

本研究結(jié)果顯示，右歸飲可能通過上調(diào)自噬的表達(dá)，下調(diào)膝關(guān)節(jié)組織中細(xì)胞的凋亡，緩解炎性浸潤，減輕軟骨細(xì)胞的破壞。