杜雅靜 王宇意 章丹婷 郭麗微 方杰 高夢煒 何文涓 鐘曉春

摘 要：目的 利用研磨珠均質(zhì)儀，從臨床增生性瘢痕組織樣本中充分提取蛋白質(zhì)。方法 臨床收集燒傷后增生性瘢痕組織樣本，通過玻璃勻漿器、研磨珠均質(zhì)儀等方法，提取樣本總蛋白，比較提取后殘?jiān)?，BCA測定總蛋白濃度，蛋白凝膠電泳考馬斯亮藍(lán)染色觀察蛋白質(zhì)條帶完整性，和western blot比較前列腺素D合成酶的含量（PTGDS）。結(jié)果 玻璃勻漿器與研磨珠均質(zhì)儀聯(lián)合方法殘?jiān)市鯛罹鶆?，獲得蛋白質(zhì)量最大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），蛋白凝膠電泳考馬斯亮藍(lán)染色樣本均未降解，Western blot測得聯(lián)合方法提取樣本中前列腺素D合成酶含量更高。結(jié)論 玻璃勻漿器與研磨珠均質(zhì)儀的聯(lián)合提取臨床增生性瘢痕組織樣本中獲得蛋白質(zhì)較為高效，是一種臨床瘢痕組織蛋白樣本提取方法。

關(guān)鍵詞：增生性瘢痕；前列腺素；蛋白提?。谎心ブ榫|(zhì)儀

中圖分類號(hào)：R622+.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.15.017

文章編號(hào)：1006-1959（2018）15-0051-04

Method for Extracting Hyperplastic Scar Tissue Protein by Grinding Bead Homogenizer

DU Ya-jing1，WANG Yu-yi1，ZHANG Dan-ting1，GUO Li-wei1，F(xiàn)ANG Jie1，GAO Meng-wei1，HE Wen-juan2， ZHONG Xiao-chun1

（1.Hangzhou Normal University Medical College，Hangzhou 310036，Zhejiang，China；

2.Wuxi Health Vocational and Technical School，Wuxi 214028，Jiangsu，China）

Abstract：Objective To fully extract proteins from clinical hyperplastic scar tissue samples using a bead homogenizer.Methods The samples of hyperplastic scar tissue after burn were collected clinically，and the total protein of the sample was extracted by means of glass homogenizer and grinding bead homogenizer.The residue after extraction was compared.The total protein concentration was determined by BCA.Protein gel electrophoresis was performed by Coomassie blue staining.Band integrity，and prostaglandin D synthetase content（PTGDS）compared to western blot.Results The residue of the glass homogenizer and the grinding bead homogenizer was flocculated uniformly，and the protein content was the largest，which was statistically significant（P<0.05）.The protein gel electrophoresis Coomassie blue stained samples were not degraded，and Western blot was used.The combined method of extracting samples has higher levels of prostaglandin D synthetase.Conclusion The combination of glass homogenizer and grinding bead homogenizer to obtain protein in clinical hyperplastic scar tissue samples is more efficient，and it is a method for extracting clinical scar tissue protein samples.

Key words：Hyperplastic scar；Prostaglandin；Protein extraction；Grinding bead homogenizer

增生性瘢痕（hyperplastic scar，HS）是創(chuàng)傷愈合的異常結(jié)局，是皮膚損傷后成纖維細(xì)胞增殖，膠原蛋白、纖連蛋白、氨基多聚糖等細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積而致[1]。這種病理性的組織塊可有很高的硬度和韌性，在提取其內(nèi)部蛋白進(jìn)行臨床研究時(shí)，如何盡可能地完全破碎、溶解組織且不破壞目的蛋白性質(zhì)成為了研究中的一個(gè)難點(diǎn)。使用玻璃勻漿器研磨瘢痕組織塊提取目的蛋白是常用的實(shí)驗(yàn)方法，其原理是讓玻璃管與柱塞之間微小的縫隙和細(xì)微的凹凸咬合，在柱塞轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，產(chǎn)生碾切作用，使瘢痕組織被輕易的碾碎，但人工研磨效率低，無法研磨不能進(jìn)入微小縫隙的較大瘢痕組織塊，導(dǎo)致研磨不均勻、不完全，無法反映組織塊中蛋白的真實(shí)含量，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性。研磨珠均質(zhì)儀可以解決研磨不均勻、不完全的問題，其原理是將樣品與相應(yīng)尺寸和硬度的珠子放到研磨管中通過三維高速旋轉(zhuǎn)、振動(dòng)，靠研磨珠的高速敲打方式對(duì)樣品進(jìn)行破碎，可以破碎頑固組織，諸如毛發(fā)和皮膚，本文將探討研磨珠均質(zhì)儀提取臨床瘢痕組織中的蛋白質(zhì)方法，并以增生性瘢痕組織中的前列腺素D合成酶（PTGDS）為例進(jìn)行分析。

1材料與方法

1.1試劑及儀器 主要試劑為動(dòng)物組織全蛋白提取液、BCA蛋白定量試劑盒、PTGDS抗體、Western blot所需試劑。儀器為1 ml玻璃勻漿器、OMNI BEAD RUPTOR 24多樣品研磨珠均質(zhì)儀、1.4 mm陶瓷珠、1 ml研磨管、Bio-Rad電泳儀、Odyssey雙紅外激光成像系統(tǒng)、BioTek酶聯(lián)免疫分析儀。 動(dòng)物組織全蛋白提取液（武漢谷歌生物科技有限公司）、BCA蛋白定量試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）、PTGDS抗體（武漢三鷹）、OMNI BEAD RUPTOR 24多樣品研磨珠均質(zhì)儀（OMNI INTERNATIONAL，INC）、Bio-Rad電泳儀（Bio-Rad Laboratories Inc美國伯樂公司）、Odyssey雙紅外激光成像系統(tǒng)（Gene Company Limited、基因有限公司）、Bio-Rad 酶聯(lián)免疫分析儀（Bio-Rad Laboratories Inc，美國伯樂公司）。

1.2樣本來源 瘢痕組織均取于患者需手術(shù)切除有瘙癢癥狀的增生性瘢痕，所有取材部位標(biāo)本經(jīng)無菌取材后，-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 組織樣本提取 將每例組織樣本置于冰盒上，用手術(shù)刀切細(xì)，取約0.05 g組織塊，一式三份，按組織樣本質(zhì)量和全蛋白提取液體積比為1 mg：7.5 ml的比例混合后（參照蛋白提取試劑盒），用以下三種方法處理混合物。方法A：在冰浴條件下用玻璃勻漿器研磨混合物10 min；方法B：將混合物置于研磨管，加入3顆研磨珠，用研磨珠均質(zhì)儀以8 m/s破碎40 s；方法C：在冰浴條件下用玻璃勻漿器研磨混合物10 min后，轉(zhuǎn)移組織勻漿至研磨管，加入3顆研磨珠，用研磨珠均質(zhì)儀，以8 m/s研磨40 s。將上述方法制備的最終組織勻漿，以12000 r/min離心5 min，取上清-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。離心沉淀物，用注射針頭挑出，置于黑色背景塑料紙上，盡量攤開樣本，然后攝像留存。

1.3.2 上清液中總蛋白濃度測定 取BCA試劑盒適量25 mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋至終濃度為0.5 mg/ml。按標(biāo)準(zhǔn)品的濃度梯度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測的蛋白樣品稀釋至合適濃度，加到96孔板中，按BCA試劑和硫酸銅溶液體積比為50：1的比例配制適量BCA工作液，充分混勻。每孔加入BCA工作液，充分混勻，37 ℃放置30 min后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線做參比，在562 nm波長下比色測定，記錄各孔吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)品蛋白含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)所測樣品的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相應(yīng)的蛋白含量，計(jì)算樣品實(shí)際濃度。

1.3.3 蛋白質(zhì)考馬斯亮蘭染色 蛋白上清液按體積比與上樣緩沖液（Loading Buffer）體積比為4：1混勻，沸水浴煮5 min后9000 r/min快速離心待用。制備12%SDS-聚丙烯酰胺膠，按總蛋白量相等加樣。以恒壓60 V進(jìn)行濃縮膠的電泳，以恒壓120 V進(jìn)行分離膠的電泳，至溴酚藍(lán)跑至底部終止。用考馬斯亮藍(lán)染色液染膠塊2 h，甲醇洗脫4 h，掃描儀攝圖。

1.3.4Western bolt檢測上清液中PTGDS的表達(dá) 按12%SDS-聚丙烯酰胺膠制膠，按總蛋白量相等加樣。電泳時(shí)恒壓60 V濃縮膠，恒壓120 V分離膠，電泳至溴酚藍(lán)跑至底部終止。把膜浸在20 ml的牛奶液中并放置搖床上1 h，封閉完后用TBST洗3次，每次5 min。然后放入β-actin抗體及前列腺素D合成酶（PTGDS）抗體中，放入4℃冰箱搖床中過夜。第2天取出膜孵二抗（辣根過氧化酶 HRP），室溫下置于搖床孵育90 min，用TBST洗3次，使用Odyssey熒光掃描儀，進(jìn)行成像保存，并用Odyssey工具軟件分析I.I.K counts值，計(jì)算PTGDS/β-actin的I.I.K counts值之比。

2結(jié)果

2.1 三種方法提取樣品后殘?jiān)容^ 三種方法粉碎增生性瘢痕組織樣本，12000 r/min離心5 min去上清，取出沉淀物觀察后，方法A、B所得殘?jiān)蕢K狀絲狀粘連，大小不一不規(guī)則的固體殘余，大塊固體可達(dá)5 mm×5 mm。方法C殘?jiān)示鶆蛐鯛?，見圖1。

2.2 BCA測定蛋白含量 三種方法粉碎增生性瘢痕組織樣本離心后的上清液，經(jīng)試劑盒BCA測定蛋白濃度，方法A、B、C之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），方法C的總蛋白濃度均數(shù)大于方法A、B（圖2）。

2.3蛋白電泳考馬斯亮藍(lán)染色 蛋白樣本經(jīng)凝膠電泳后染色，蛋白質(zhì)電泳條帶清晰，在45 KDa和25 KDa附近未見降解現(xiàn)象，β-actin分子量大小為43 KDa，PTGDS分子量大小為28 KDa，是本文實(shí)驗(yàn)中將要檢測的分子（圖3）。

2.4 Western blot結(jié)果 從圖（圖4）直接觀察，β-actin的表達(dá)在方法A、B、C中，最高的是A方法，PTGDS熒光亮度高也是如此，經(jīng)用Odyssey工具軟件分析β-actin與PTGDS灰度值，以β-actin校正，發(fā)現(xiàn)方法C的PTGDS灰度值之比大于方法A、B。

3討論

增生性瘢痕是創(chuàng)傷愈合過程的不完善的替代，是創(chuàng)傷愈合后常見并發(fā)癥，不僅影響患者的外觀，而且由于攣縮畸形導(dǎo)致的功能障礙，加之常常伴有的灼痛、瘙癢等癥狀，還為該類患者帶來沉重的經(jīng)濟(jì)與心理負(fù)擔(dān)[2]。因此，增生性瘢痕不僅是外科修復(fù)的難點(diǎn)，更是許多科研工作者的研究熱點(diǎn)。

在研究瘢痕組織時(shí)，我們常常需要進(jìn)行分子水平上的探索，如何盡可能最大程度的獲取所研究的目的蛋白是研究順利進(jìn)行的保障[3]。提取瘢痕組織蛋白常用到的方法有玻璃勻漿器提取法及液氮分解法，在使用以上方法提取瘢痕總蛋白時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)圖1瘢痕組織殘?jiān)^大、不均勻，難以確保所測目的蛋白含量的準(zhǔn)確性。且在玻璃勻漿器研磨的過程中，多次出現(xiàn)組織塊嵌塞在玻璃管和柱塞之間導(dǎo)致碾切時(shí)玻璃管爆裂的情況，故我們認(rèn)為單用玻璃勻漿器較難適用于某些堅(jiān)韌瘢痕組織的蛋白。因此，在玻璃勻漿器的基礎(chǔ)上，我們加入了研磨前的人工切碎步驟，并使用了更快速有效的研磨珠均質(zhì)儀。在單用研磨珠均質(zhì)儀時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)瘢痕組織殘?jiān)葐斡貌Ａ驖{器要小，但不均勻，所以又提出聯(lián)合兩種方法，進(jìn)行了三種方法的比較實(shí)驗(yàn)。從圖1物理粉碎效果看，方法A、B所得殘?jiān)蕢K狀絲狀粘連，方法C均勻絮狀，提示方法C物理破碎更均勻更細(xì)膩。從BCA結(jié)果上看，方法A、B的總蛋白濃度低，方法C高，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示方法A、B與C之間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），圖2與物理粉碎效果一致，提示三種方法中，方法C提取總蛋白濃度最好。從圖3考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果上看，三種方法沒有明顯差異，45 KDa與25 KDa條帶均未見蛋白質(zhì)降解現(xiàn)象。從圖4Western blot結(jié)果上看，β-actin校正后，方法C的PTGDS灰度值之比大，提取PTGDS的效果更好。由于實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)的限制，僅作初步分析未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

PTGDS亦為瘢痕組織中所含蛋白質(zhì)之一，主要催化PGH2生成PGD2[4]， PGD2 作為一種神經(jīng)調(diào)節(jié)分子， 可調(diào)節(jié)睡眠、體溫、嗅覺功能、激素釋放以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的疼痛反射， 還可以抑制血小板凝集、誘導(dǎo)血管舒張等，由肥大細(xì)胞釋放的 PGD2 也可以作為過敏反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)分子[5]，調(diào)節(jié)增生性瘢痕的形成，是臨床上研究增生性瘢痕的瘙癢因子之一。本次實(shí)驗(yàn)方法C相較其他兩種而言，提取PTGDS效果好。凡是涉及到了瘢痕組織塊中某物質(zhì)的含量的研究，都需要面臨瘢痕組織是否研磨均勻、充分的問題，而這一難點(diǎn)由瘢痕組織的堅(jiān)韌性所決定的。病理性瘢痕組織是人體中較為堅(jiān)韌的組織，目前未見有關(guān)這方面的研究文獻(xiàn)，本文可為病理性瘢痕組織的破碎、更充分地提取蛋白質(zhì)提供了一種有效的方法。

綜上所述，臨床增生性瘢痕組織提取采用玻璃勻漿器，研磨珠均質(zhì)儀聯(lián)合使用的方法提取蛋白濃度最高，較大程度地解決了玻璃勻漿器無法研磨完全及效率低的問題，比單用傳統(tǒng)的玻璃勻漿器更好，是三種方法中的優(yōu)者。但在操作過程中，我們發(fā)現(xiàn)其所耗費(fèi)的時(shí)間較長，步驟較復(fù)雜。方法C中使用3顆珠子，最大速度8 m/s，40 s的參數(shù)，或許還可以通過增加時(shí)間、增加珠子的顆數(shù)材質(zhì)直徑等來提高效率。因此下一步我們將研究這些方面，來探索用研磨珠提取瘢痕組織最佳參數(shù)。

致謝：在本文研究過程中，本校陳功星和馬子坤給予了指導(dǎo)和參與其它相關(guān)工作，在此表示感謝！

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收稿日期：2018-4-20；修回日期：2018-5-22

編輯/李樺