秦潤(rùn)禾，陶 輝，倪世豪，代 晨，丁季飛，施 鵬，石開虎

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院心胸外科，安徽 合肥 230601；2. 安徽醫(yī)科大學(xué)心血管病研究中心，安徽 合肥 230601)

心肌纖維化是多種因素引起的心肌細(xì)胞間質(zhì)出現(xiàn)異常膠原纖維的沉積，是多種心臟疾病發(fā)生、發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素及病理基礎(chǔ)[1]。心肌成纖維細(xì)胞(cardiomyocyte fibroblasts，CFs) 是纖維化時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)重要的來源細(xì)胞，當(dāng)CFs被激活增殖，細(xì)胞外基質(zhì)合成分泌增加，進(jìn)一步促進(jìn)了纖維化。因此，抑制CFs活化增殖成為抑制心肌纖維化的關(guān)鍵點(diǎn)[2]。近年來的大量研究證實(shí)，miRNA廣泛參與各類心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展，如心室肥大、心肌纖維化、心肌梗死、心律不齊等[3]。miRNA是一類長(zhǎng)為22～23個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，通過與靶蛋白mRNA 3′端非編碼區(qū)的不完全互補(bǔ)結(jié)合，抑制mRNA轉(zhuǎn)錄后靶蛋白的表達(dá)[4]。DNA甲基化是指生物體在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下，將甲基轉(zhuǎn)移到特定堿基上的過程，由此可造成生物體發(fā)生胚胎分化、基因失活、器官衰老等現(xiàn)象。DNA甲基化會(huì)導(dǎo)致某些區(qū)域DNA構(gòu)象變化，從而影響了蛋白質(zhì)與DNA的相互作用。其中，DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3A(DNA methyltransferase 3A，DNMT3A)作為DNA甲基化酶之一，在本課題組前期研究中已顯示其參與心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展[5-6]。有研究指出，DNA甲基化與miRNA之間存在重要的調(diào)控聯(lián)系。另有研究顯示，miR-200b可靶向調(diào)控DNMT3A，影響非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展[7]。本研究擬通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)：一方面，構(gòu)建SD大鼠心肌纖維化模型，檢測(cè)miR-200b、DNMT3A，以及反映心肌纖維化的標(biāo)志性蛋白I型膠原前膠原(collagen type I alpha 1,Col1A1)和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白( α-smooth muscle actin,α-SMA)；另一方面，體外培養(yǎng)CFs，通過干擾miR-200b的表達(dá)，檢測(cè)CFs中DNMT3A的表達(dá)及反映心肌纖維化的標(biāo)志性蛋白Col1A1 和α-SMA的改變情況，旨在探討DNMT3A影響心肌纖維化的過程是否亦受到miR-200b的靶向調(diào)控，為探尋新型治療和干預(yù)心肌纖維化的有效途徑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠60只，♂，體質(zhì)量(140～160) g；SD♂乳鼠80只，出生6～7 d，體質(zhì)量(20～22) g，均購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(皖)2017-001。

1.1.2試劑 鹽酸異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)注射液(中國西南藥業(yè)股份有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國賽默飛公司)；胎牛血清(英國Gibco公司)；胰蛋白酶(美國WISENT公司)；LipofectamineTM2000、TRIzol(美國Invitrogen公司)；miR-200b促進(jìn)劑、抑制劑轉(zhuǎn)染試劑(上海吉瑪公司)；抗Col1A1、α-SMA、DNMT3A、β-actin抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；MTT相關(guān)試劑(上海劍鈍生物科技有限公司)。

1.1.3儀器 Multiskan FC酶標(biāo)儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱、PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；Western blot顯影及相關(guān)設(shè)備(美國Bio-Rad公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州泰安空氣技術(shù)公司)；HAD-K5600超微量分光光度計(jì)(北京恒奧德科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1SD大鼠心肌纖維化模型的建立 60只SD♂大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，開始實(shí)驗(yàn)。大鼠隨機(jī)分為2組：ISO組30只，取0.5% ISO，按每天6 mg·kg-1的劑量腹腔注射1周，構(gòu)建大鼠心肌纖維化模型；正常組(30只)腹腔注射同等劑量0.9%生理鹽水1周作為對(duì)照。于實(shí)驗(yàn)?zāi)? d開始禁食、禁水12 h后，大鼠稱重，處死大鼠，并取5 mm3心臟標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋，再將蠟塊連續(xù)切片10張，HE和Masson染色法檢測(cè)其病理學(xué)改變；qRT-PCR檢測(cè)各組miR-200b表達(dá)；Western blot法測(cè)定α-SMA、Col1A1、DNMT3A的表達(dá)量。

1.2.2SD乳鼠原代CFs的分離與培養(yǎng) 取出生6～7 d的新生乳鼠，燒杯裝載入超凈臺(tái)，另備75%乙醇。先用高壓蒸汽滅菌的鑷子以頸部脫臼法處死乳鼠，后在乙醇中浸泡1 min左右。用碘伏消毒胸腹部，無菌眼科剪先橫后縱呈倒T字型剪開胸腔，取心尖部位，并快速置于含雙抗預(yù)冷的PBS溶液潤(rùn)洗3～5次。剔除周圍多余結(jié)締及脂肪組織，將心臟放置于無菌平皿上，剪成約1 mm3大小，向皿中加入少許胰酶，在37℃培養(yǎng)箱中消化，共消化6～8次，每次約5 min。每次消化后取上清液，并加入等量的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，緩緩混勻，以終止胰酶消化。用200目細(xì)胞篩過濾含細(xì)胞的混合液，最后將過濾后的細(xì)胞懸液150×g離心5 min。離心后收集沉淀，加入適量PBS再次重復(fù)離心3次。用上述CFs培養(yǎng)基將細(xì)胞沉淀重懸，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。培養(yǎng)約90 min后，將未貼壁的細(xì)胞懸液吸棄，此時(shí)已經(jīng)貼壁的是CFs，通過倒置顯微鏡觀察加以確認(rèn)。加5 mL培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合至80%～85%時(shí)傳代，連續(xù)傳至4代后的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-200b促進(jìn)劑、抑制劑 培養(yǎng)原代CFs至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入胰酶消化并吹勻細(xì)胞懸液。然后，按每孔2 mL把細(xì)胞接種至6孔板內(nèi)并分組。放入37.5℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%用于轉(zhuǎn)染。吸取10 μL的miR-200b促進(jìn)劑及抑制劑分別緩緩注入已加有10 μL LipofectamineTM2000的Opti-MEM(1 mL)中，用移液槍上下吹勻多次，室溫下靜置30 min，形成microRNA和Lipofectamine復(fù)合物。將6孔板取出，吸棄原培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞2次，再將復(fù)合物混合液注入事先已分組的6孔板中。然后把6孔板放進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)箱中，2 h后倒掉混合液，加入含雙抗的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24～96 h后，用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.4轉(zhuǎn)染細(xì)胞RNA的提取和qRT-PCR檢測(cè)CFs中miR-200b的表達(dá) 取出轉(zhuǎn)染48 h后含CFs的6孔板，按TRIzol法提取細(xì)胞RNA，紫外分光光度法檢測(cè)細(xì)胞RNA的濃度和純度，選用反映RNA純度的A260/A280數(shù)值為1.8～2.0的樣品用于實(shí)驗(yàn)。采用GenePharma HairpinitTMmicroRNA RT-PCR Quantitation Kit v1406試劑盒，并參考使用說明書檢測(cè)miR-200b。先將樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)條件如下：25℃、30 min,42℃、30 min，85℃、5 min。然后按試劑盒說明書加樣，通過qRT-PCR檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組中miR-200b表達(dá)。反應(yīng)條件：95℃、10 min為預(yù)變性階段；95℃、12 s，62℃、40 s，并循環(huán)40次為擴(kuò)增階段；95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s為熔解曲線階段。以U6作為內(nèi)參，2-ΔΔCT法計(jì)算miR-200b的相對(duì)表達(dá)量以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染是否成功。

1.2.5qRT-PCR檢測(cè)Col1A1、α-SMA、DNMT3A 取出轉(zhuǎn)染48 h后含CFs的6孔板，按TRIzol法提取細(xì)胞RNA，方法同“1.2.4”。按TaKaRa試劑盒說明書，將樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再通過qRT-PCR檢測(cè)3種目的基因。反應(yīng)條件：50℃、2 min，95℃、10 min為預(yù)變性階段；95℃、20 s，60℃、30 s，72℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)為擴(kuò)增階段；95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s為熔解曲線階段。以β-actin作為內(nèi)參，2-ΔΔCT法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequence

1.2.6Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中目的蛋白表達(dá) 取出轉(zhuǎn)染48 h后含CFs的6孔板，用蛋白裂解液提取轉(zhuǎn)染后CFs的總蛋白，檢測(cè)蛋白濃度，分組標(biāo)記，加入樣品緩沖液99℃加熱2 min。凝膠上樣，每孔加入20～40 μg蛋白。電泳，轉(zhuǎn)膜，用5%牛奶封閉膜2 h，TBST洗滌6 min×4次，加入稀釋的Col1A1、α-SMA和 DNMT3A 一抗，4℃孵育過夜，TBST漂洗4次，加入相應(yīng)二抗37℃搖床孵育1～3 h，再用TBST漂洗4次，而后采用ECL法，以β-actin為內(nèi)參檢測(cè)目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7MTT比色法檢測(cè)CFs的增殖 取不同轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度至1×108·L-1，分別接種在96孔板中，每孔100 μL，設(shè)5個(gè)復(fù)孔。96孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72、96 h，不同時(shí)間點(diǎn)的96孔板分別取出，每孔加入10 μL 5 g·L-1的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h后終止。小心吸棄孔中培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶產(chǎn)物溶解充分后，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)490 nm處各孔的吸光度值。

2 結(jié)果

2.1ISO皮下注射導(dǎo)致SD大鼠心肌纖維化心臟樣本的病理學(xué)改變Fig 1心臟組織的HE和Masson染色結(jié)果顯示，與正常組比較，ISO組SD大鼠HE染色片中心肌細(xì)胞間質(zhì)增加，且排列紊亂，心肌細(xì)胞呈現(xiàn)肥大狀態(tài)，并能發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞有所增生，Masson染色可見心肌組織間膠原纖維增多。

Fig 1 HE and Masson staining

2.2SD大鼠心臟樣本中miR-200b表達(dá)的變化Fig 2的qRT-PCR結(jié)果顯示，相較于正常組，ISO組心臟標(biāo)本提取的總RNA中miRNA-200b表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 2 Level of miR-200b in SD rat myocardium by

*P<0.05vsNC group

2.3ISO組和對(duì)照組SD大鼠心臟樣本中α-SMA、Col1A1、DNMT3A表達(dá)變化Fig 3的Western blot結(jié)果顯示，ISO組中α-SMA、Col1A1、DNMT3A蛋白表達(dá)水平相較于正常組明顯升高(P<0.05)。

Fig 3 Expression of α-SMA, Col1A1 and DNMT3A in SD rat myocardium by Western blot n=6)

*P<0.05vsNC group

2.4瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-200b抑制劑和促進(jìn)劑對(duì)miR-200b表達(dá)的影響瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CFs miR-200b抑制劑、促進(jìn)劑及其空白對(duì)照組48 h后，F(xiàn)ig 4的qRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-200b促進(jìn)劑組中，CFs中miR-200b表達(dá)量明顯升高(P<0.01)，miR-200b抑制劑組中miR-200b表達(dá)量減少(P<0.01)，表明轉(zhuǎn)染成功。

Fig 4 Change of miR-200b in CFs 48 h

1: Negative group; 2: Blank group; 3: miR-200b mimics group; 4: miR-200b inhibitors group.**P<0.01vsblank group;##P<0.01vsnegative group.

2.5miR-200b對(duì)CFs中Col1A1、α-SMA、DNMT3AmRNA表達(dá)的影響瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后，F(xiàn)ig 5的qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-200b促進(jìn)劑實(shí)驗(yàn)組中Col1A1、α-SMA和 DNMT3A的表達(dá)下降(P<0.01)；而miR-200b抑制劑組中Col1A1、α-SMA和 DNMT3A的表達(dá)上升(P<0.01)。

Fig 5 Alteration of gene expression in CFs 48 h

1: Negative group; 2: Blank group; 3: miR-200b mimics group; 4: miR-200b inhibitors group.**P<0.01vsblank group;##P<0.01vsnegative group.

2.6miR-200b對(duì)CFs中Col1A1、α-SMA和DNMT3A蛋白表達(dá)的影響Fig 6結(jié)果顯示，miR-200b抑制劑轉(zhuǎn)染之后，DNMT3A、α-SMA和Col1A1蛋白表達(dá)均較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組明顯升高(P<0.01)。而促進(jìn)劑組中DNMT3A、α-SMA和Col1A1蛋白表達(dá)量均較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組明顯降低(P<0.05)。

Fig 6 Levels of Col1A1, α-SMA and DNMT3A in transfected CFs by Western blot n=6)

**P<0.01vsblank group;##P<0.01vsnegative group

2.7miR-200b對(duì)CFs增殖的影響如Fig 7所示，在轉(zhuǎn)染CFs 24、48、72、96 h后，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較，miR-200b促進(jìn)劑組的CFs增殖水平明顯降低(P<0.01)，而miR-200b抑制劑組中CFs增殖水平明顯上升(P<0.01)。

Fig 7 Change of proliferation of CFs 24, 48, 72, 96 h after transfection in all groups n=6)

1: Negative group; 2: Blank group; 3: miR-200b mimics group; 4: miR-200b inhibitors group.**P<0.01vsblank group;##P<0.01vsnegative group.

3 討論

心肌纖維化是指正常的心臟心肌組織結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)了以CFs增殖、細(xì)胞外基質(zhì)沉積過量為主要病理表現(xiàn)的疾病。目前研究表明，心肌纖維化與心律失常(如房顫)、心功能不全、心肌肥厚等疾病有關(guān)[8-9]。近年有研究顯示，DNA片段的甲基化是可以促進(jìn)纖維細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞和膠原沉積[10-11]。而之前另有研究顯示，DNMT3A作為DNA片段的甲基化催化酶家族中的重要一員，其表達(dá)程度的激活與抑制，對(duì)心肌纖維化發(fā)揮著關(guān)鍵作用[5-6]。

近年來，大量研究報(bào)道m(xù)iR-200b參與多種疾病發(fā)生、發(fā)展過程[12-13]，但關(guān)于miR-200b在心肌纖維化中的研究卻并不多見。有研究表明，同樣作為miR-200家族中的一員miR-141可參與影響心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展[14]。因此，本課題進(jìn)一步研究 DNMT3A與miR-200b在心肌纖維化發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)分別通過建立心肌纖維化動(dòng)物模型，以及向CFS轉(zhuǎn)染miR-200b的促進(jìn)劑和抑制劑來證實(shí)之前提出的假設(shè)。在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，模型組HE和Masson染色心肌組織呈現(xiàn)明顯的膠原沉積; qRT-PCR顯示；模型組相對(duì)于對(duì)照組miR-200b表達(dá)水平降低，Western blot檢測(cè)表明，模型組α-SMA、Col1A1、DNMT3A的水平明顯高于對(duì)照組。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，促進(jìn)劑組DNMT3A、Col1A1、α-SMA mRNA表達(dá)下降，而在抑制劑組上升；Western blot結(jié)果顯示，促進(jìn)劑組中DNMT3A、Col1A1、α-SMA蛋白表達(dá)降低，而在抑制劑組表達(dá)上升；MTT結(jié)果表明，miR-200b可抑制CFs生長(zhǎng)。故本課題組推測(cè)心肌纖維化的產(chǎn)生可能與miR-200b對(duì) DNMT3A調(diào)控有關(guān)。

綜上所述，miR-200b可能是通過抑制DNMT3A，對(duì)CFs甲基化產(chǎn)生影響，控制CFS的活化，降低心肌纖維化水平。而DNMT3A可能是心肌纖維化的表觀遺傳學(xué)治療靶點(diǎn)之一，同時(shí)也為預(yù)防和研究心肌纖維化產(chǎn)生提供新的思路。