馬曉婷，張石蕾，由淑萍，趙 軍，劉 濤

(新疆醫(yī)科大學(xué) 1. 公共衛(wèi)生學(xué)院、2. 護(hù)理學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；3. 新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是一種慢性的瘢痕形成與修復(fù)過程，是發(fā)病率和死亡率都很高的世界醫(yī)學(xué)難題。HF的特點(diǎn)是細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，晚期HF可診斷為肝硬化，并最終可能發(fā)展為肝衰竭，甚至肝細(xì)胞癌[1]。目前公認(rèn)肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化是HF進(jìn)展過程中的關(guān)鍵事件[2]。在HF進(jìn)程中，HSC激活成肌成纖維細(xì)胞是瘢痕形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3-4]。中醫(yī)具有治療復(fù)雜疾病及相關(guān)疾病的功效，肉蓯蓉(Cistanche)是著名的名貴補(bǔ)益類中藥，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用。課題組前期研究證實(shí)，肉蓯蓉苯乙醇苷類化合物具有良好的保肝護(hù)肝作用，且其能引起Fas誘導(dǎo)的HSC凋亡[5]。本研究旨在探討肉蓯蓉苯乙醇總苷(phenylethanol glycosides from cistanche tubuiosa，CPhGs)脂質(zhì)體對(duì)HSC凋亡的影響及其分子機(jī)制，通過靶向載藥系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)藥物，來克服一些藥物半衰期短、無法到達(dá)靶器官，或到達(dá)了但無法在其周圍形成有效藥物濃度等缺點(diǎn)，最大程度發(fā)揮藥物療效，達(dá)到長(zhǎng)效、靶向及減輕藥物副作用等目的，期望能尋求更多的可以應(yīng)用于臨床治療HF的靶向藥物治療途徑，為HF的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 大鼠HSC-T6細(xì)胞株，購自上海中喬新舟生物科技有限公司，貨號(hào)：ZQ0780。

1.1.2藥物與試劑 用薄膜分散二次包封法制備pPB修飾的肉蓯蓉總苷靶向脂質(zhì)體，其粒徑為212.7 nm，電位35～50 mV，包封率(38.46±7.85)%，由本實(shí)驗(yàn)室保存。胎牛血清(美國Gibco公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；MTT(美國Sigma公司)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國BD公司)；TRIzol Reagent(Life technologies)；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、RIPA裂解液(賽默飛公司)；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司)；蛋白定量試劑盒(Biomiga公司)；重組大鼠血小板衍生生長(zhǎng)因子BB(recombinant rat platelet-derived growth factor BB，rrPDGF-BB) (R&D公司)；抗β-actin、JNK、p-JNK多克隆抗體(北京博奧森生物科技有限公司)。

1.1.3儀器 超凈工作臺(tái)、全波長(zhǎng)自動(dòng)酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢驗(yàn)測(cè)試儀(美國Thermo Scientific公司)；CK-40型熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；低溫離心機(jī)(美國Sigma公司)； Western blot電泳裝置及轉(zhuǎn)膜裝置(美國Bio-Rad公司)；QuantStudio 6 Flex型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 HSC-T6在含有100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素和10%胎牛血清的高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞隔日換液，待生長(zhǎng)融合至80%～90%時(shí)，使用0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，按1 ∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)，所有實(shí)驗(yàn)采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.2.2細(xì)胞分組 實(shí)驗(yàn)分為Normal組、rrPDGF-BB組、rrPDGF-BB+CPhGs脂質(zhì)體(29.45、14.72、7.36 mg·L-1)組。各組細(xì)胞均培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 HSC-T6以5 000個(gè)/孔密度接種至96孔板，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行分組干預(yù)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h，向每孔加入10 μL MTT溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)4 h后，棄去MTT溶液，再向各孔加入100 μL DMSO，置于搖床室溫?fù)u動(dòng)10 min，待結(jié)晶充分溶解后，于酶標(biāo)儀492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后接種于6孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)，24 h后按相應(yīng)濃度加藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入500 μL胰酶消化細(xì)胞，加完全培養(yǎng)液終止消化，吹打混勻移至15 mL離心管，PBS沖洗細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min。棄上清，加PBS沖洗細(xì)胞2次，用AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑標(biāo)記后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)α-SMA、Collagen I、Collagen Ⅲ mRNA的表達(dá) TRIzol試劑盒提取HSC-T6總RNA，經(jīng)純度及完整性鑒定后反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA。按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明書建立PCR反應(yīng)體系，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。PCR熱循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果分析以β-actin為內(nèi)參基因，確定每個(gè)樣本、每個(gè)基因擴(kuò)增的循環(huán)閾值(CT)，按照2-△△CT計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，所用引物序列見Tab 1。

1.2.6Western blot法分析p-JNK蛋白表達(dá)水平 收集細(xì)胞，RIPA細(xì)胞裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，取相同質(zhì)量的蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，p-JNK、JNK一抗(1 ∶5 000稀釋)4℃搖床孵育過夜，TBST漂洗3次，二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h，TBST漂洗3次后，化學(xué)發(fā)光顯影試劑盒(ECL)曝光顯影。利用圖像分析軟件Image J對(duì)條帶進(jìn)行灰度值的測(cè)定，計(jì)算分析各組蛋白相對(duì)表達(dá)量，以p-JNK與JNK條帶信號(hào)強(qiáng)度的比值表示p-JNK蛋白表達(dá)水平。

Tab 1 Primer sequence of qRT-PCR

2 結(jié)果

2.1CPhGs脂質(zhì)體對(duì)rrPDGF-BB刺激的HSC-T6增殖的影響Fig 1的MTT結(jié)果顯示，在24 h時(shí)，與Normal組比較，rrPDGF-BB組OD值明顯增加(P<0.05)；與rrPDGF-BB組比較，除CPhGs脂質(zhì)體7.36 mg·L-1組外，其余CPhGs脂質(zhì)體不同濃度組OD值均明顯下降(P<0.05)；與CPhGs脂質(zhì)體7.36 mg·L-1組相比，CPhGs脂質(zhì)體29.45 mg·L-1組OD值明顯降低(P<0.05)。在48、72 h時(shí)，與Normal組比較，rrPDGF-BB組和CPhGs脂質(zhì)體不同濃度組OD值均明顯增加(P<0.05)；與rrPDGF-BB組比較，CPhGs脂質(zhì)體不同濃度組OD值明顯下降(P<0.05)；與CPhGs脂質(zhì)體7.36 mg·L-1組比較，CPhGs脂質(zhì)體(14.72、29.45 mg·L-1)組OD值明顯下降(P<0.05)；與CPhGs脂質(zhì)體14.72 mg·L-1組比較，CPhGs脂質(zhì)體29.45 mg·L-1組OD值明顯下降(P<0.05)。結(jié)果提示，隨著藥物濃度增大和干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，CPhGs脂質(zhì)體各劑量組抑制HSC-T6增殖的作用呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

Fig 1 Effect of CPhGs liposome with different doses on rrPDGF-BB induced HSC-T6 proliferation n=3)

*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsrrPDGF-BB group;△P<0.05vsrrPDGF-BB+CPhGs liposome 7.36 mg·L-1group;▲P<0.05vsrrPDGF-BB+CPhGs liposome 14.72 mg·L-1group

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2.2CPhGs脂質(zhì)體對(duì)rrPDGF-BB刺激的HSC-T6凋亡的影響如Fig 2所示，與Normal組相比，rrPDGF-BB組凋亡率下降(P<0.05)；與rrPDGF-BB組相比，CPhGs脂質(zhì)體不同濃度組凋亡率均明顯上升(P<0.05)；與CPhGs脂質(zhì)體7.36 mg·L-1組比較，CPhGs脂質(zhì)體(14.72、29.45 mg·L-1)組凋亡率明顯上升(P<0.05)；與CPhGs脂質(zhì)體14.72 mg·L-1組比較，CPhGs脂質(zhì)體29.45 mg·L-1組凋亡率明顯增高(P<0.05)。結(jié)果顯示，隨著CPhGs脂質(zhì)體藥物濃度的升高，HSC-T6凋亡率也逐漸增高，CPhGs脂質(zhì)體各劑量組間呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。

Fig 2 Detection of apoptotic rate by flow cytometry n=3)

1：Normal；2：rrPDGF-BB；3：rrPDGF-BB+CPhGs liposome 29.45 mg·L-1；4：rrPDGF-BB+CPhGs liposome 14.72 mg·L-1；5：rrPDGF-BB+CPhGs liposome 7.36 mg·L-1.*P<0.05vsnormal group; #P<0.05vsrrPDGF-BB group;△P<0.05vsrrPDGF-BB+CPhGs liposome 7.36 mg·L-1group;▲P<0.05vsrrPDGF-BB+CPhGs liposome 14.72 mg·L-1group

2.3CPhGs脂質(zhì)體對(duì)rrPDGF-BB刺激的HSC-T6α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢmRNA表達(dá)的影響如Fig 3所示，與Normal組比較，α-SMA、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ mRNA在rrPDGF-BB組表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與rrPDGF-BB組比較，α-SMA、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ mRNA在CPhGs脂質(zhì)體不同濃度組表達(dá)均下降(P<0.05)；CPhGs脂質(zhì)體各劑量組間比較，可見隨CPhGs脂質(zhì)體濃度增大，α-SMA、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ mRNA表達(dá)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中以CPhGs脂質(zhì)體29.45 mg·L-1組抑制效果最明顯。

Fig 3 Effect of CPhGs liposome with different doses on rrPDGF-BB induced HSC-T6 mRNA expression of α-SMA, Collagen I and Collagen Ⅲ n=3)

*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsrrPDGF-BB group;△P<0.05vsrrPDGF-BB+CPhGs liposome 7.36 mg·L-1group;▲P<0.05vsrrPDGF-BB+CPhGs liposome 14.72 mg·L-1group

2.4CPhGs脂質(zhì)體對(duì)rrPDGF-BB刺激的HSC-T6p-JNK蛋白表達(dá)的影響如Fig 4所示，與Normal組比較，p-JNK蛋白在rrPDGF-BB和CPhGs脂質(zhì)體不同濃度組表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與rrPDGF-BB組比較，p-JNK蛋白在CPhGs脂質(zhì)體不同濃度組表達(dá)下降(P<0.05)；CPhGs脂質(zhì)體各劑量組間比較，p-JNK蛋白隨CPhGs脂質(zhì)體干預(yù)劑量增加表達(dá)明顯下降，呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)，其中以29.45 mg·L-1組效果最明顯。

3 討論

在慢性肝病中，HSC的反復(fù)激活導(dǎo)致HF，其特征是廣泛的瘢痕形成和干擾肝臟正常結(jié)構(gòu)與功能[6]。目前，抗HF的主要策略是抑制HSC活化、增殖、收縮，誘導(dǎo)HSC凋亡。HSC的活化是HF的主要過程[7]，HF主要是由于細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積所致，而活化的肝HSC是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源。

Fig 4 Effect of CPhGs liposome with different doses on rrPDGF-BB induced HSC-T6 protein

1：Normal；2：rrPDGF-BB；3：rrPDGF-BB+CPhGs liposome 29.45 mg·L-1；4：rrPDGF-BB+CPhGs liposome 14.72 mg·L-1；5：rrPDGF-BB+CPhGs liposome 7.36 mg·L-1.*P<0.05vsnormal group; #P<0.05vsrrPDGF-BB group;△P<0.05vsrrPDGF-BB+CPhGs liposome 7.36 mg·L-1group;▲P<0.05vsrrPDGF-BB+CPhGs liposome 14.72 mg·L-1group

肝損傷后，HSC經(jīng)歷一個(gè)復(fù)雜的從靜止?fàn)顟B(tài)向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)換或激活過程，α-SMA是HSC活化的標(biāo)志物，α-SMA在肌成纖維細(xì)胞分化中起作用。α-SMA降低了收縮力和Collagen I合成，并抑制傷口收縮。Collagen I和α-SMA被認(rèn)為是HF中誘導(dǎo)HSC活化的標(biāo)志物，可以減少α-SMA的含量，促進(jìn)HSC凋亡，逆轉(zhuǎn)HF進(jìn)程。宋陽等[8]的研究結(jié)果證實(shí)，其研究的藥物可明顯抑制HSC的增殖，促進(jìn)其凋亡，并使α-SMA蛋白表達(dá)明顯降低，以此降低細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，從而起到逆轉(zhuǎn)HF的作用。由淑萍等[9]研究表明，肉蓯蓉苯乙醇總苷可以抑制rrPDGF-BB誘導(dǎo)的HSC增殖。上述研究結(jié)果提示，抑制HSC的激活和增殖，促進(jìn)HSC凋亡已成為阻止HF發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵事件。最近的臨床實(shí)驗(yàn)證據(jù)也提示，HF具有可逆性的[10]。HF的逆轉(zhuǎn)與HSC的凋亡有著密切關(guān)聯(lián)。HF逆轉(zhuǎn)期，活化的 HSC數(shù)量減少主要依靠細(xì)胞凋亡，而不是活化狀態(tài)細(xì)胞向靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)化。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的主動(dòng)“自殺”過程，與壞死不同，細(xì)胞凋亡發(fā)生于HF的產(chǎn)生和發(fā)展過程中。HSC凋亡在HF發(fā)展過程中不僅起著主動(dòng)作用，而且貫穿整個(gè)纖維化形成的過程。本研究用不同濃度的CPhGs脂質(zhì)體藥物作用于HSC-T6 48 h后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，與Normal組相比，rrPDGF-BB組凋亡率下降，CPhGs脂質(zhì)體(29.45、14.72 mg·L-1)組凋亡率上升，與rrPDGF-BB組相比，CPhGs脂質(zhì)體不同濃度組凋亡率均明顯上升，且CPhGs脂質(zhì)體不同濃度組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CPhGs脂質(zhì)體可誘導(dǎo)HSC-T6的凋亡，且凋亡程度與CPhGs脂質(zhì)體濃度存在聯(lián)系，CPhGs脂質(zhì)體各劑量組間表現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

HF是指結(jié)締組織過度增殖和異常沉積，特別是膠原蛋白、非膠原蛋白和肝小葉門管區(qū)的蛋白多糖等。因此，細(xì)胞外基質(zhì)降解和生成之間的不平衡是HF發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵因素。因此，保護(hù)肝細(xì)胞，促進(jìn)肝再生，保持膠原蛋白的正常代謝也成為預(yù)防和治療HF的重要措施。人類有19種膠原蛋白，在肝臟中存在的有5種類型，在HF的總蛋白中膠原蛋白約占50%，主要涉及Collagen I和Collagen Ⅲ。在肝臟中，Collagen I占60%～70%，Collagen Ⅲ占20%～30%，是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。因此，Collagen I和Collagen Ⅲ被認(rèn)為是反映膠原蛋白在肝臟中進(jìn)行新陳代謝的重要參數(shù)。李偉偉等[11]的研究結(jié)果顯示所研究藥物可通過抑制CollagenⅢ沉積而起到抗HF作用。張揚(yáng)武等[12]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了可通過抑制HSC的活化，降低Collagen I的表達(dá),達(dá)到逆轉(zhuǎn)HF的作用。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)α-SMA、Collagen I 和 Collagen Ⅲ基因表達(dá)，研究結(jié)果顯示，與Normal組相比，rrPDGF-BB組α-SMA、Collagen I、Collagen Ⅲ mRNA表達(dá)明顯增高，與rrPDGF-BB組相比，不同濃度的CPhGs脂質(zhì)體組均可不同程度下調(diào)α-SMA、Collagen I 和 Collagen Ⅲ的mRNA表達(dá)，其中29.45 mg·L-1CPhGs脂質(zhì)體組下調(diào)作用最明顯，且隨著藥物濃度的升高，其下調(diào)程度越明顯。我們認(rèn)為產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因在于濃度越高，其對(duì)rrPDGF-BB引起的HSC增殖的抑制效果越明顯，越趨近于正常。因此，我們認(rèn)為其能抑制HSC增殖，促進(jìn)其凋亡，以此來阻止HF的形成。

JNK已顯示對(duì)不同細(xì)胞類型的細(xì)胞增殖有積極的調(diào)節(jié)作用，JNK通過負(fù)性調(diào)節(jié)作用來抑制靜止HSC的活化，從而阻止HSC的增殖，刺激MAPK信號(hào)通路，從而使其下游通路阻斷，起到預(yù)防HF的作用。本研究結(jié)果顯示，與Normal組比較，rrPDGF-BB組p-JNK的蛋白表達(dá)量明顯增高，表明rrPDGF-BB可通過影響MAPK信號(hào)，使HSC活化增殖。不同濃度的CPhGs脂質(zhì)體組，p-JNK的蛋白表達(dá)量隨著藥物濃度的升高逐漸降低，且不同濃度的CPhGs脂質(zhì)體組p-JNK的蛋白表達(dá)量與rrPDGF-BB組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可見，CPhGs脂質(zhì)體可在一定程度上抑制rrPDGF-BB誘導(dǎo)的HSC增殖與活化，促進(jìn)HSC凋亡，從而抑制HF的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果為后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究CPhGs脂質(zhì)體抗HF作用機(jī)制提供了扎實(shí)的理論基礎(chǔ)。期望能夠?qū)で蟾嗫笻F的靶向給藥途徑，給HF患者帶來福音。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)主要在新疆醫(yī)科大學(xué)2011協(xié)同中心完成，在此特別感謝姜平、盛磊老師提供的支持與幫助，對(duì)王志強(qiáng)師兄和張石蕾師姐提供的幫助及指導(dǎo)表示衷心感謝！)