趙方允，王紫微，張春芳，張 悅，徐雙蘭，邢西遷，楊 姣

(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院 1. 藥學(xué)部、2. 呼吸內(nèi)一科，云南 昆明 650051；3. 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)一科，云南 昆明 650032)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是由于肺血管收縮反應(yīng)性增強(qiáng)及肺血管結(jié)構(gòu)重建，最終引起肺動(dòng)脈壓力升高為特征的一組病理生理綜合征[1-2]。其中，由肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs)增殖、遷移所引起的肺血管結(jié)構(gòu)重建，是PAH形成的中心環(huán)節(jié)[3-5]。重樓為百合科植物云南重樓或七葉一枝花的干燥根莖，主要成分重樓皂苷具有抗腫瘤、止血、抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抑制血管生成、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等功效[6-7]。其中，抗炎及抑制血管生成的作用可能會(huì)對(duì)PAH的防治起一定作用。該文主要研究重樓皂苷Ⅶ(polyphyllin Ⅶ, PPⅦ)對(duì)內(nèi)皮素-1(endothilin-1，ET-1)誘導(dǎo)的大鼠PASMCs增殖和遷移的作用。

1 材料

1.1試劑重樓皂苷Ⅶ，純度≥98%(索萊寶公司)；ET-1(Sigma公司)；DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清(BI公司)；CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(日本同仁)；Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BD公司)；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒( Beckman公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)，♂，Sprague-Dawley(SD)大鼠，6～8周齡，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滇)k2015-0002。

2 方法

2.1PASMCs的原代分離、培養(yǎng)與鑒定采用Ⅱ型膠原酶消化法分離大鼠PASMCs，抗α-actin和α-SMA免疫組化染色鑒定。

2.2實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分組：①對(duì)照組：正常培養(yǎng)細(xì)胞；②ET-1組：對(duì)照組中加入10-7mol·L-1ET-1；③給藥組：ET-1+PPⅦ (0.25、0.5、0.75 μmol·L-1)。分別于24、48、72 h收獲細(xì)胞，檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

2.3檢測(cè)指標(biāo)采用CCK-8法，篩選ET-1誘導(dǎo)大鼠PASMCs增殖的最佳濃度，同時(shí)按照“2.2”項(xiàng)分組，確定PPⅦ抑制PASMCs增殖的最佳濃度。使用Transwell遷移小室，檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。采用 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)PPⅦ處理大鼠PASMCs后凋亡情況。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。

3 結(jié)果

3.1PASMCs的鑒定結(jié)果倒置顯微鏡下，大鼠PASMCs呈“谷”、“峰”狀生長(zhǎng)，特異性兔抗鼠α-actin和α-SMA單克隆抗體免疫熒光鑒定可見(jiàn)排列的束狀肌絲被染色，證明培養(yǎng)細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞。

3.2PPⅦ抑制PASMCs增殖誘導(dǎo)大鼠PAMCs增殖的最佳ET-1濃度為10-7mol·L-1。Tab 1結(jié)果顯示，PPⅦ(0.25、0.50、0.75 μmol·L-1)濃度依賴(lài)性抑制ET-1誘導(dǎo)的PASMCs增殖(P<0.01)。

Tab 1 The proliferation inhibition rate of PASMCs treated with polyphyllin Ⅶ n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsET-1

3.3PPⅦ抑制PASMCs遷移Transwell結(jié)果顯示(Tab 2)，ET-1處理后，大鼠PASMCs遷移率明顯增加(P<0.01)。經(jīng)PPⅦ(0.25、0.50、0.75 μmol·L-1)處理后，與ET-1組相比，PASMCs遷移率明顯下降(P<0.01)，隨時(shí)間和PPⅦ濃度的增加，PPⅦ抑制PASMCs遷移率越明顯。

Tab 2 Cell migration with Transwell

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsET-1

3.4細(xì)胞周期分析ET-1處理大鼠PASMCs后，G0/G1期細(xì)胞比例較對(duì)照組明顯減少(P<0.01)，S期和G2/M細(xì)胞比例較對(duì)照組明顯增加(P<0.05)，G2/M期細(xì)胞比例較對(duì)照組差異無(wú)顯著性。ET-1誘導(dǎo)的大鼠PASMCs經(jīng)PPⅦ處理后，G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加(P<0.01)，與對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性；S期細(xì)胞較ET-1組降低(P<0.01)，與對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性；G2/M期細(xì)胞比例較對(duì)照組無(wú)明顯差異，較ET-1組降低(P<0.05)。PPⅦ對(duì)大鼠PASMCs細(xì)胞周期的影響結(jié)果顯示，用0.5 mol·L-1PPⅦ處理細(xì)胞48 h，抑制了ET-1誘導(dǎo)的PASMCs G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)化，抑制了S期向G2/M期的轉(zhuǎn)化。

3.5細(xì)胞凋亡分析Annexin V FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，ET-1處理大鼠PASMCs 48 h后，晚期凋亡細(xì)胞比例明顯降低(P<0.01)，死亡細(xì)胞比例降低(P<0.05)。經(jīng)PPⅦ 0.5 μmol·L-1處理48 h后，與ET-1組相比，PASMCs細(xì)胞總凋亡率明顯升高(P<0.01)，正常細(xì)胞比例明顯降低(P<0.01)。

4 討論

PAH是臨床眾多心、肺疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中重要的病理生理環(huán)節(jié)，研究表明PAH的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，PASMCs的異常增殖和遷移是PAH的主要發(fā)病機(jī)制。本文主要研究云南道地藥材滇重樓中主要成分PPⅦ對(duì)ET-1誘導(dǎo)的大鼠PASMCs增殖和遷移的影響。結(jié)果顯示，PPⅦ呈時(shí)間和濃度依賴(lài)性抑制ET-1誘導(dǎo)的大鼠PASMCs增殖和遷移。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PPⅦ處理后大鼠PASMCs細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期情況，發(fā)現(xiàn)PPⅦ處理后，PASMCs早期凋亡率和總凋亡率均明顯升高，表明PPⅦ可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制ET-1誘導(dǎo)的G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)化，抑制S期向G2/M期的轉(zhuǎn)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步深入研究PPⅦ在PAH防治中的作用及機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)是在昆明市延安醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成，感謝對(duì)實(shí)驗(yàn)給予幫助的老師和同學(xué)!)