林宇寧，王聲善，呂貝貝，馬 靜，陳永欣，鐘 靜，劉雪梅，韋燕飛

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣西 南寧 530200)

白花丹醌(5-羥基-2-甲基-1,4-萘醌)是一種活性萘醌成分，存在于植物白花丹中，具有抗炎、神經(jīng)保護(hù)、抗癌、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗細(xì)菌、抗真菌等多種藥理學(xué)活性[1]。白花丹醌的抗腫瘤活性受到廣泛關(guān)注，目前大量研究表明，在多種不同腫瘤細(xì)胞和腫瘤動(dòng)物模型中，白花丹醌具有抗增殖、抑制侵襲與轉(zhuǎn)移、促凋亡、化療放療增敏活性。在肺癌研究中發(fā)現(xiàn)，白花丹醌通過下調(diào)MMP-2與u-PA基因的表達(dá)，抑制A549人肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[2]。在前列腺癌中，白花丹醌通過濃度和時(shí)間依賴性方式抑制PI3K/Akt/mTOR途徑，從而誘導(dǎo)PC-3和DU145細(xì)胞的凋亡和自噬[3]。此外，白花丹醌可升高Bax水平，并下調(diào)Bcl-2水平，從而抑制肝癌細(xì)胞Hep2的侵襲并誘導(dǎo)其凋亡[4]。本實(shí)驗(yàn)以人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721為研究對(duì)象，觀察白花丹醌對(duì)SMMC-7721細(xì)胞凋亡、自噬的影響及其相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料

1.1細(xì)胞株人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物所。

1.2藥物與試劑白花丹醌(plumbagin)購(gòu)自Sigma公司；高糖DMEM培養(yǎng)基為Hyclone公司產(chǎn)品；新生牛血清為四季青公司產(chǎn)品；TRIzol(Aidlab公司，批號(hào):252250AX)；RNase酶(TransGen公司，批號(hào)：I21222)；兔抗LC3B、兔抗Beclin1單克隆抗體，購(gòu)自Cell Signaling公司；凋亡抑制劑Z-VAD-FMK(貨號(hào)：S7023)、自噬抑制劑3-MA(貨號(hào)：S2767) ，均購(gòu)自Selleck公司。

1.3儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)；Sorvall ST 16R高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司)；7900/Viia7實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；BX53光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；muLISKANMK3酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)； HT7700型電子顯微鏡(日本Hitachi公司)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，放置在37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每2 d更換1次細(xì)胞培養(yǎng)液，長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后消化傳代，待傳至3代后，80%貼壁的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。作為對(duì)照的溶劑組為含1‰ DMSO和2% FBS的DMEM培養(yǎng)基。

2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率3×108·L-1生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于96孔板，每孔100 μL細(xì)胞懸液，37℃培養(yǎng)過夜，以不含F(xiàn)BS的DMEM同步化并干預(yù)細(xì)胞，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別加入濃度為0、0.5、3、6、10 μmol·L-1的白花丹醌，另設(shè)空白對(duì)照組，不接種細(xì)胞，只加入含有 2% FBS的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)6、12、24 h后，每孔加入MTT溶液10 μL，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，加入DMSO 150 μL，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定568 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(OD值)。按公式計(jì)算抑制率：抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值)×100%。

2.3透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡與自噬形態(tài)取2×106個(gè)SMMC-7721細(xì)胞種植于規(guī)格為35 mm的培養(yǎng)皿中，白花丹醌(3 μmol·L-1)作用24 h后，1 000 r·min-1離心5 min，收集細(xì)胞，4℃下，先用1%的鋨酸緩沖試劑和2.5%的戊二醛溶液將細(xì)胞固定2～4 h后，用丙酮和乙醇將細(xì)胞脫水，再將其用環(huán)氧樹脂包裹起來，定位染色后封片，透射電鏡觀察并照相。

2.4免疫熒光檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞自噬標(biāo)記蛋白LC3的表達(dá)將已爬好細(xì)胞的玻片放置在培養(yǎng)板上，PBS溶液浸潤(rùn)，4%多聚甲醛溶液固定15 min。沖洗爬片3次后，用吸水紙吸取玻片上殘留的PBS溶液，將無外來感染物的山羊血清滴在爬片上，30 min后，滴入稀釋的一抗，4℃孵育過夜；次日，PBST溶液沖洗玻片，吸去殘留的PBST溶液后，將稀釋的熒光二抗添加到玻片，(20～37) ℃濕盒內(nèi)孵育1 h后，PBST溶液清洗玻片3次。在玻片上滴入DAPI溶液，避光孵育5 min，染核，PBST洗去殘留的DAPI溶液；使用抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察分析標(biāo)本。

2.5qPCR法檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞Beclin1、Atg7、Atg5mRNA的表達(dá)TRIzol法提取SMMC-7721細(xì)胞總RNA，通過Nano-100微量分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA含量。取RNA 4.284 μg，采用RNase H逆轉(zhuǎn)錄酶將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)Gene Bank查找基因序列并自行設(shè)計(jì)引物，Beclin1、Atg7、Atg5引物序列見Tab 1。以β-actin作為內(nèi)參，通過2-△△CT方法，計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

Tab 1 Primer sequences of Beclin1,Atg7 and Atg5

2.6免疫印跡法檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞LC3、Beclin1、Atg7、Atg5蛋白表達(dá)將細(xì)胞分為兩組，分組一為：對(duì)照組、Z-VAD-FMK組(20 μmol·L-1)、白花丹醌組(3 μmol·L-1)、白花丹醌(3 μmol·L-1)+Z-VAD-FMK(20 μmol·L-1)組。分組二為：對(duì)照組、3-MA組(20 μmol·L-1)、白花丹醌組(3 μmol·L-1)、白花丹醌(3 μmol·L-1)+3-MA(20 μmol·L-1)組。兩組細(xì)胞分別預(yù)孵育凋亡抑制劑 Z-VAD-FEK或自噬抑制劑 3-MA 1 h后，加入白花丹醌干預(yù)24 h。每孔細(xì)胞加含PMSF的裂解液，裂解完成后，移至離心管中離心5 min，取上清液，測(cè)定蛋白濃度。6% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，含5%脫脂奶粉封閉液TBST室溫封閉2 h。加入一抗4℃孵育過夜，HRP標(biāo)記二抗37℃搖床孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光法，X線底片曝光顯影，以β-actin為內(nèi)參，用BandScan分析膠片灰度值。

3 結(jié)果

3.1白花丹醌對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響MTT結(jié)果顯示(Tab 2)，0.5～10 μmol·L-1的白花丹醌能抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖，與對(duì)照組比較，差異具有顯著性(P<0.01)，白花丹醌處理細(xì)胞24 h后，其抑制細(xì)胞增殖作用明顯增強(qiáng)。此外，抑制作用隨白花丹醌作用濃度的增加與時(shí)間的延長(zhǎng)而加強(qiáng)，呈時(shí)間-劑量依賴關(guān)系。為避免高濃度白花丹醌未知細(xì)胞毒性的影響，后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度選擇3 μmol·L-1，處理時(shí)間為24 h。

3.2白花丹醌對(duì)SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)的影響透射電鏡結(jié)果顯示，對(duì)照組的SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)沒有明顯變化，凋亡形態(tài)不明顯，仍具有完整的細(xì)胞膜和核膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、中心體清晰可見，分布均勻的核染色質(zhì)，無凝集固縮的現(xiàn)象，胞質(zhì)中可見初級(jí)自噬小體形成(Fig 1A、1B)。白花丹醌組細(xì)胞則出現(xiàn)了一系列凋亡形態(tài)，核染色質(zhì)濃縮成幾個(gè)不同大小的塊,其中有一些是聚集，一些分布在細(xì)胞核的核膜皺褶,胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞器正常，分布相對(duì)集中，有時(shí)可見空泡在細(xì)胞質(zhì)中，胞質(zhì)中分布大量自噬小體(Fig 1C、1D)。

3.3白花丹醌對(duì)SMMC-7721細(xì)胞自噬蛋白LC3表達(dá)的影響Fig 2的細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，相較于溶劑對(duì)照組，白花丹醌處理組SMMC-7721細(xì)胞LC3蛋白紅色熒光相對(duì)聚集，熒光斑點(diǎn)增多，表達(dá)水平有所增高，而溶劑對(duì)照組胞質(zhì)內(nèi)LC3紅色熒光較少，并呈現(xiàn)相對(duì)彌散的狀態(tài)。形態(tài)學(xué)結(jié)果提示，白花丹醌處理后細(xì)胞自噬小體增多，可促進(jìn)自噬。

Tab 2 Inhibitory effect of plumbagin on SMMC-7721 cells detected by MTT

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Fig 1 Morphological observation of SMMC-7721 cells

A:Control(scale bar=1 μm); B:Control(scale bar=500 μm); C:Plumbagin(scale bar=1 μm); D:Plumbagin(scale bar=500 μm).

Fig 2 Immunofluorescence detection of autophagy protein LC3(×400)

3.4白花丹醌對(duì)SMMC-7721細(xì)胞Beclin1、Atg7、Atg5mRNA表達(dá)的影響如Fig 3所示，白花丹醌組細(xì)胞Beclin1、Atg7、Atg5 mRNA的表達(dá)均明顯升高，與對(duì)照組相比，差異具有顯著性(P<0.01)。提示白花丹醌可能通過上調(diào)細(xì)胞自噬相關(guān)基因Beclin1、Atg7、Atg5 mRNA的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡與自噬。

3.5白花丹醌對(duì)SMMC-7721細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響如Fig 4所示，當(dāng)白花丹醌與凋亡抑制劑Z-VAD-FMK聯(lián)合使用時(shí)，白花丹醌能明顯提高自噬蛋白Atg5、Atg7、LC3-Ⅱ、Beclin1的表達(dá)水平。與溶劑對(duì)照組相比，單用白花丹醌組的蛋白表達(dá)增加，與單用白花丹醌組相比，Z-VAD-FMK+白花丹醌組的表達(dá)明顯增加，差異均具有顯著性(P<0.05)。如Fig 5所示，與溶劑對(duì)照組比較，白花丹醌處理組LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg7、Atg5的表達(dá)增高；與單用白花丹醌組相比，3-MA+白花丹醌處理組LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg7、Atg5的表達(dá)明顯降低(P<0.01)。結(jié)果提示，凋亡抑制劑Z-VAD-FMK增強(qiáng)了白花丹醌對(duì)人肝癌細(xì)胞的自噬誘導(dǎo)作用，抑制凋亡可增強(qiáng)白花丹醌誘導(dǎo)的SMMC-7721細(xì)胞自噬，而自噬抑制劑3-MA減弱了白花丹醌對(duì)人肝癌細(xì)胞的自噬誘導(dǎo)作用。

Fig 3 Effect of plumbagin on the autophagy related gene

**P<0.01vscontrol group

Fig 4 Effect of Z-VAD-FMK inhibitor pretreatment on autophagy proteins of SMMC-7721

1:Control; 2:Z-VAD-FMK; 3:Plumbagin;4:Plumbagin+Z-VAD-FMK.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsplumbagin.

Fig 5 Effect of 3-MA inhibitor pretreatment on autophagy proteins of SMMC-7721

1:Control;2:3-MA;3:Plumbagin;4:Plumbagin+3-MA.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsplumbagin.

4 討論

白花丹醌的抗腫瘤活性是研究熱點(diǎn)之一。在非小細(xì)胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，白花丹醌阻滯細(xì)胞于G2/M期，并增加細(xì)胞系中活性氧的水平；通過減少Akt和mTOR的磷酸化，抑制PI3K/Akt/mTOR途徑，劑量依賴性地誘導(dǎo)自噬；同時(shí)，自噬的抑制或誘導(dǎo)增強(qiáng)白花丹醌誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[5]。另有研究顯示，白花丹醌對(duì)胃癌、乳腺癌有一定的抑制作用，它可以使細(xì)胞趨化因子受體CXCR4的表達(dá)下降，而此作用可抑制胃癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲[6]。此外，在口腔癌的研究中，我們發(fā)現(xiàn)白花丹醌通過PI3K/Akt/mTOR通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬，且p38 MAPK也參與白花丹醌在SCC25細(xì)胞中的凋亡和自噬誘導(dǎo)作用[7]。目前，靶向凋亡和自噬是癌癥治療中的潛在戰(zhàn)略[8]。細(xì)胞自噬是一種自噬廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的高度保守的降解程序，其通過吞噬和降解活細(xì)胞中故障的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和基因組完整性[9]。在自噬起始階段，自噬體的形成與胞質(zhì)可溶形式的 LC3-I向膜結(jié)合形式的LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)換有關(guān)[10]。Atg4蛋白酶將合成的LC3蛋白分離為L(zhǎng)C3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種，其分散于胞質(zhì)中并相互轉(zhuǎn)化，LC3-Ⅰ可以通過偶聯(lián)形式與磷脂酰乙醇胺結(jié)合，共同構(gòu)成LC3-Ⅱ,LC3-Ⅱ穩(wěn)定位于自噬體的內(nèi)外膜之間，被溶酶體溶解后消失，因此可作為自噬體的標(biāo)記蛋白。本實(shí)驗(yàn)免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，白花丹醌處理的細(xì)胞LC3蛋白紅色熒光相對(duì)聚集，熒光斑點(diǎn)增多，表達(dá)水平有所增高，DAPI染核后細(xì)胞核增大。從電鏡觀察的細(xì)胞形態(tài)變化分析，白花丹醌處理后細(xì)胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)，核染色質(zhì)固縮，聚集分布在細(xì)胞核的核膜皺褶,胞質(zhì)濃縮并分布大量自噬小體。提示在白花丹醌作用下，SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞核變大，染色質(zhì)固縮，使細(xì)胞吸收物質(zhì)能力加強(qiáng)。此外，細(xì)胞接受自噬誘導(dǎo)信號(hào)后，在胞質(zhì)中形成類似脂質(zhì)體的膜結(jié)構(gòu)，并不斷擴(kuò)張延伸，吞噬細(xì)胞器，形成自噬體。作為自噬體的標(biāo)記蛋白，LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平的明顯提高提示SMMC-7721細(xì)胞中自噬體的大量形成，電鏡形態(tài)學(xué)觀察證實(shí)了這一結(jié)論。表明白花丹醌具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡和促進(jìn)自噬的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，在受到不同環(huán)境的影響因素下，細(xì)胞凋亡和自噬行為可以發(fā)生互相促進(jìn)或者拮抗改變。在通常情況下，細(xì)胞蛋白上的Atg7、Beclin1基因被敲除，或者使用3-MA時(shí)，caspase的效力就會(huì)減弱，與此同時(shí)，細(xì)胞凋亡的發(fā)生率也會(huì)降低[11]。許多體內(nèi)外研究已初步證實(shí)，通過抑制自噬(HCQ、CQ、3-MA)或敲除Atg，均可增強(qiáng)多腫瘤的治療有效率[12-13]。部分自噬發(fā)生于凋亡前，并能進(jìn)一步上調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的活性[14]。MCF7細(xì)胞被喜樹堿作用時(shí)，細(xì)胞內(nèi)線粒體的位置形成一大片自噬泡樣結(jié)構(gòu)；當(dāng)使用自噬抑制劑時(shí)，細(xì)胞內(nèi)部的線粒體膜的去極化過程增強(qiáng)，caspase-9活性升高，并加快細(xì)胞凋亡進(jìn)程[15]。本研究免疫印跡結(jié)果顯示，凋亡抑制劑Z-VAD-FMK增強(qiáng)了白花丹醌對(duì)人肝癌細(xì)胞的自噬誘導(dǎo)作用。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，白花丹醌誘導(dǎo)人體肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬的作用可被自噬抑制劑3-MA削弱。因此，我們推測(cè)白花丹醌通過上調(diào)細(xì)胞自噬相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡與自噬。

綜上所述，白花丹醌可上調(diào)肝癌細(xì)胞中自噬基因與蛋白的表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬性死亡。此外，抑制凋亡能增強(qiáng)白花丹醌促進(jìn)細(xì)胞自噬，但白花丹醌誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡和自噬相互調(diào)節(jié)的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。本研究為白花丹醌臨床治療肝癌的應(yīng)用發(fā)展提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。