黃 杰，龔永平，文繼峰，楊 銳，任 露，顏其貴，，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130)

豬瘟(classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類傳染病，我國(guó)列為一類傳染病，可造成養(yǎng)豬業(yè)的巨大損失[1-3]。CSFV是黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的成員，為有囊膜的單股正鏈RNA病毒[4]，該病毒的E2蛋白是一種囊膜糖蛋白，是CSFV誘導(dǎo)被感染動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生主要免疫保護(hù)性的抗原蛋白[5]，在病毒吸附和入侵宿主細(xì)胞中起主要作用，所以常用作疫苗研究和免疫診斷等方面的目標(biāo)蛋白[6]。

外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMVs)是革蘭氏陰性菌和部分革蘭氏陽(yáng)性菌以出芽方式分泌的一種球形、雙層膜狀結(jié)構(gòu)分泌小泡，與所分泌細(xì)菌的外膜成分相同，包括脂多糖、外膜蛋白、磷脂等，還包裹有部分周質(zhì)甚至DNA，形成直徑為20～250 nm的顆粒[7-8]。OMVs具備適于被免疫細(xì)胞識(shí)別的特征，可作為外源大分子抗原的遞呈載體[9]。由于OMVs不能復(fù)制且含有大量的細(xì)菌抗原，具有免疫佐劑效果，并能有效激活免疫系統(tǒng)，因而被認(rèn)為是極具潛力的候選疫苗或者疫苗載體。在歐洲，腦膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)B群OMVs疫苗已經(jīng)上市，該疫苗的使用大規(guī)模地降低了B群奈瑟腦膜炎發(fā)病率[10]。此外，OMVs也可作為其他傳染性疾病的預(yù)防用疫苗[11-12]。

細(xì)胞溶素A(cytolysin A，ClyA)是一種細(xì)菌外膜上的成孔蛋白，將目的蛋白的核酸序列融合在ClyA基因序列的C-端后，融合的外源蛋白被定位在菌體及其所分泌的OMVs的外膜上，且外源蛋白暴露于囊泡外部，同時(shí)起到富集外源蛋白的作用[13-15]。本研究利用基因重組技術(shù)，將切除跨膜區(qū)后的CSFVE2基因序列連接在ClyA的C-端，通過(guò)大腸埃希菌原核表達(dá)出含ClyA-E2融合蛋白的OMVs，成功地將E2蛋白融合呈現(xiàn)在OMVs表面，對(duì)ClyA-E2 OMVs進(jìn)行兔體免疫效果評(píng)價(jià)，為新型CSFV疫苗研究提供思路和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

pMD19-T Vector和E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自TaKaRa公司；表達(dá)質(zhì)粒pBAD18-Cm-ClyA由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)豬病研究中心曹三杰教授惠贈(zèng)；包含CSFVE2片段(含跨膜區(qū))的pUC57質(zhì)粒和CSFV E2蛋白由本實(shí)驗(yàn)室提供；Solution Ⅰ購(gòu)自TaKaRa公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒均購(gòu)自O(shè)MEGA公司；組氨酸標(biāo)簽單抗和山羊抗鼠HRP-IgG酶標(biāo)二抗及ECL顯色液購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；豬瘟兔化弱毒疫苗(C株)由四川華神獸用生物制品有限公司提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為平均體質(zhì)量約1 kg的清潔級(jí)新西蘭大白兔雌兔，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

以CSFVE2基因的pUC57質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物：上游5′-TCTAGAATGCGTCTGGCCTGT-3′(單下劃線部分為XbaⅠ酶切位點(diǎn))，下游5′-CTACTTCGAAGATTACCACTACCACTACTACAAA TTCTGCAAAATAATCGCT-3′(單下劃線部分為HindⅢ酶切位點(diǎn)，虛線為終止密碼子，雙下劃線部分為6個(gè)組氨酸的標(biāo)簽序列)，PCR擴(kuò)增出去除E2蛋白跨膜區(qū)后的序列及其C-端引入的6個(gè)組氨酸的標(biāo)簽序列基因片段，預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 056 bp。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 E2-His DNA片段的擴(kuò)增與克隆

以含CSFVE2基因的pUC57質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。1%瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并回收目的片段。

將回收的E2-His片段與pMD19-T Vector連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α。用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取pMD19-T-E2-His進(jìn)行單雙酶切鑒定，并送生工生物測(cè)序。

1.2.3 pBAD18-Cm-ClyA-E2-His原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

用限制性核酸內(nèi)切酶XbaⅠ和HindⅢ雙酶切pMD19-T-E2-His質(zhì)粒DNA，1%瓊脂糖凝膠回收目的片段，同法酶切pBAD18-Cm-ClyA質(zhì)粒DNA，回收大片段，將目的片段和大片段用SolutionⅠ進(jìn)行連接，置16 ℃連接10 h，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，用氯霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基篩選，獲得含pBAD18-Cm-ClyA-E2-His質(zhì)粒的重組菌。抽提質(zhì)粒進(jìn)行單雙酶切鑒定，并送生工生物測(cè)序。

1.2.4 重組OMVs的誘導(dǎo)表達(dá)、制備與定量

將含重組表達(dá)質(zhì)粒pBAD18-ClyA-E2-His的E.coliDH5α培養(yǎng)至D600為0.5～0.6時(shí)，加入終濃度為0.2%阿拉伯糖于30 ℃、160 r·min-1振蕩培養(yǎng)20 h進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；表達(dá)菌液于4 ℃、12 000g離心去除菌體，收集上清液；通過(guò)0.45 μL孔徑濾膜過(guò)濾、100 ku超濾濃縮和超高速離心(4 ℃，125 000g，4 h)處理后，取沉淀溶于200～300 μL PBS液中，即為重組OMVs。將重組OMVs送武漢谷歌生物科技有限公司進(jìn)行透射電鏡觀察重組OMVs囊泡。使用BCA蛋白定量試劑盒(BestBio)對(duì)重組OMVs進(jìn)行總蛋白質(zhì)定量，操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。經(jīng)定量的重組OMVs于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 重組OMVs的蛋白酶K與EDTA處理及Western blot分析

取3份重組OMVs，分別經(jīng)蛋白酶K(終濃度為0.1 mg·mL-1)、EDTA(終濃度為0.1 mol·mL-1)、蛋白酶K和EDTA(終濃度同前)37 ℃處理過(guò)夜。以含重組OMVs未經(jīng)蛋白酶K與EDTA處理的表達(dá)菌做對(duì)照，將經(jīng)過(guò)處理的重組OMVs樣品經(jīng)10% SDS-PAGE電泳；以25 V、25 min半干轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉封閉液封閉1.5 h；加入His標(biāo)簽單克隆抗體(1∶5 000)，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗膜3次，每次5 min，加入二抗HRP-IgG(1∶5 000)，常溫孵育1.5 h；TBST洗膜3次，每次5 min，加入ECL底物顯色液進(jìn)行顯色并曝光拍照。

1.2.6 重組OMVs兔體免疫試驗(yàn)

選取經(jīng)ELISA方法檢測(cè)為豬瘟抗體呈陰性的16只平均質(zhì)量為1 kg的健康新西蘭大白兔雌兔，將其隨機(jī)分為A、B、C、D 4個(gè)組，A、B、C組各4只，D組3只。隔離條件下飼養(yǎng)一周后，A組用重組OMV免疫(500 μg·只-1)，以PBS稀釋；B組用豬瘟兔化弱毒疫苗免疫對(duì)照(1 頭份·只-1)，以疫苗稀釋液稀釋；C組用E2蛋白免疫對(duì)照(500 μg·只-1)，以完全和不完全弗氏佐劑乳化；D組用PBS注射作為空白對(duì)照(2 mL·只-1)。免疫方式為皮下多點(diǎn)注射，每2周免疫一次，共免疫3次。

1.2.7 間接ELISA檢測(cè)血清抗體水平

在每次免疫一周后進(jìn)行耳靜脈采血，分離血清。通過(guò)間接ELISA方法測(cè)定血清抗體效價(jià)。以2 μg·mL-1的CSFV E2蛋白包被酶標(biāo)板，包被量為100 μL·孔-1，4 ℃包被12 h，然后用200 μL TBST緩沖液(含5% BSA)封閉1.5 h；加300 μL·孔-1緩沖液TBST洗滌，洗滌3次，每次5 min；加100 μL經(jīng)1∶200稀釋后的免疫血清，37 ℃孵育1.5 h；加300 μL·孔-1TBST緩沖液洗滌，洗滌3次，每次5 min；加入按1∶6 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(100 μL·孔-1)，37 ℃孵育1 h；加入ECL底物100 μL·孔-1，避光顯色10 min；加入2 mol·L-1硫酸溶液100 μL·孔-1，終止反應(yīng)并測(cè)定D450值。D450值≥0.328判為陽(yáng)性，D450值≤0.271判為陰性，二者之間為可疑值，需重新測(cè)定。

1.2.8 兔體攻毒保護(hù)試驗(yàn)

三免后2周進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，每只兔子耳緣靜脈注射50頭份的豬瘟兔化弱毒疫苗，攻毒后每6 h測(cè)一次體溫，共測(cè)96 h，并評(píng)定各免疫組在免疫保護(hù)方面的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 E2-His DNA片段的PCR擴(kuò)增及電泳鑒定

以含CSFVE2基因的pUC57質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢查，結(jié)果顯示在約1 056 bp處有一條帶，與預(yù)期大小符合，如圖1所示。

2.2 克隆質(zhì)粒pMD19-T-E2-His的鑒定

用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和HindⅢ對(duì)質(zhì)粒pMD19-T-E2-His進(jìn)行單酶切和雙酶切，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在相應(yīng)泳道上均出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的目的條帶，如圖2所示。序列測(cè)定分析顯示，重組片段無(wú)任何堿基突變，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 原核表達(dá)質(zhì)粒pBAD18-Cm-ClyA-E2-His的鑒定

用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和HindⅢ對(duì)質(zhì)粒pBAD18-Cm-ClyA-E2-His進(jìn)行單酶切和雙酶切，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在相應(yīng)泳道上均出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的目的條帶，如圖3所示。序列測(cè)定分析顯示，重組片段無(wú)任何堿基突變，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M，DL2000 DNA marker；1，E2-His DNA片段；2，陰性對(duì)照。M， DL2000 DNA marker; 1， E2-His DNA fragment; 2， Negative control.圖1 E2-His DNA片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 E2-His DNA fragment amplified by PCR

M，DL10 000 DNA marker；1，pMD19-T-E2-His質(zhì)粒的XbaⅠ單酶切；2，pMD19-T-E2-His質(zhì)粒的XbaⅠ和HindⅢ雙酶切。M， DL10 000 DNA marker; 1， Single digestion of pMD19-T-E2-His plasmid with XbaⅠ; 2， Double digestion of pMD19-T-E2-His plasmid with XbaⅠ and HindⅢ.圖2 克隆質(zhì)粒pMD19-T-E2-His的酶切結(jié)果Fig.2 Results of restriction enzyme of clone plasmid of pMD19-T-E2-His

M，DL10 000 DNA marker；1，pBAD18-ClyA-E2-His質(zhì)粒的XbaⅠ單酶切；2，pBAD18-ClyA-E2-His質(zhì)粒的XbaⅠ和HindⅢ雙酶切。M， DL10 000 DNA marker; 1， Single digestion of pBAD18-ClyA-E2-His plasmid with XbaⅠ; 2， Double digestion of pBAD18-ClyA-E2-His plasmid with XbaⅠ and HindⅢ.圖3 原核表達(dá)質(zhì)粒pBAD18-ClyA-E2-His的酶切結(jié)果Fig.3 Results of restriction enzyme of prokaryotic expression plasmid of pBAD18-ClyA-E2-His

2.4 重組蛋白在OMVs上的表達(dá)

經(jīng)SDS-PAGE顯示，含重組表達(dá)質(zhì)粒pBAD18-Cm-ClyA-E2-His的大腸埃希菌經(jīng)過(guò)0.2%阿拉伯糖誘導(dǎo)后與空載菌相比較，約在72 ku處出現(xiàn)了目的條帶。同樣地，含重組蛋白的OMVs與空OMVs相比較，約在72 ku處出現(xiàn)了一條目的條帶(圖4)。

2.5 重組蛋白Western blot分析

Western blot分析顯示，2%阿拉伯糖誘導(dǎo)的重組菌和含重組蛋白的OMVs在約72 ku處出現(xiàn)了特異性的目的條帶，而2%阿拉伯糖誘導(dǎo)的空載菌和空OMVs則沒(méi)有。同時(shí)，為了驗(yàn)證重組蛋白遞呈在OMVs的外表面，將重組OMVs分別或同時(shí)用蛋白酶K和EDTA處理。Western blot結(jié)果顯示，分別用蛋白酶K、蛋白酶K/EDTA處理后的重組OMVs沒(méi)有出現(xiàn)任何條帶，而EDTA處理后出現(xiàn)了目的條帶，如圖5所示。

M，預(yù)染蛋白質(zhì)marker；1，0.2%阿拉伯糖誘導(dǎo)后的重組菌；2，0.2%阿拉伯糖誘導(dǎo)后的空載菌；3，重組OMVs；4，空OMVs。M， Pre-stained protein marker; 1， Recombinant bacteria induced with 0.2% arabinose; 2， Empty bacteria induced with 0.2% arabinose; 3， Recombinant OMVs; 4， Empty OMVs.圖4 重組蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression of recombinant protein

2.6 呈遞E2蛋白的重組OMVs的透射電鏡觀察

呈遞E2蛋白的重組OMVs通過(guò)透射電鏡觀察可見(jiàn)大小20～250 nm的圓形膜狀結(jié)構(gòu)(圖6)。

2.7 間接ELISA檢測(cè)免疫家兔血清抗體水平

對(duì)每次免疫7 d后的家兔進(jìn)行耳緣靜脈采血，分離血清進(jìn)行間接ELISA方法檢測(cè)。結(jié)果顯示，重組OMVs組首免后7 d，抗體水平與豬瘟疫苗組和E2蛋白質(zhì)組差異都不明顯(P>0.05)；二免后7 d，三組抗體水平均迅速上升，重組OMVs組低于豬瘟疫苗組(P>0.05)，比E2蛋白質(zhì)組高，差異顯著(P<0.05)；三免后7 d，重組OMVs組抗體水平略低于豬瘟疫苗組(P>0.05)，高于E2蛋白質(zhì)組(P<0.05)。結(jié)果表明，OMVs-E2比豬瘟弱毒疫苗和E2蛋白質(zhì)更快速地刺激并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，比E2蛋白質(zhì)更能刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平的抗體(表1)。

M，預(yù)染蛋白質(zhì)marker；1，0.2%阿拉伯糖誘導(dǎo)后的重組菌；2，0.2%阿拉伯糖誘導(dǎo)后的空載菌；3，重組OMVs；4，空OMVs；5，蛋白酶K處理的重組OMVs；6，EDTA處理的重組OMVs；7，蛋白酶K和EDTA同時(shí)處理的重組OMVs。M， Pre-stained protein marker; 1， Recombinant bacteria induced with 0.2% arabinose; 2， Empty bacteria induced with 0.2% arabinose; 3， Recombinant OMVs; 4， Empty OMVs; 5， Recombinant OMVs dealt with proteinase K; 6， Recombinant OMVs dealt with EDTA; 7， Recombinant OMVs dealt with proteinase K and EDTA simultaneously.圖5 重組蛋白的Western blot分析結(jié)果Fig.5 Western blot analysis of recombinant protein

圖6 呈遞重組蛋白的重組OMVs的透射電鏡觀察Fig.6 Transmission electron microscopy of recombinant outer envelope vesicles presented of recombinant protein

2.8 兔體免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)

用兔化CSFV C株攻毒前一天，各組兔體的體溫均在正常范圍內(nèi)(39.0～39.5 ℃)。PBS組兩只實(shí)驗(yàn)兔在攻毒24 h后體溫開(kāi)始上升，均先后出現(xiàn)定型熱反應(yīng)，在48 h后體溫最高的達(dá)41 ℃，以后逐漸下降至72 h恢復(fù)到正常體溫。豬瘟兔化弱毒疫苗組、重組OMVs組和E2蛋白質(zhì)組在36 h后出現(xiàn)輕熱反應(yīng)，但很快恢復(fù)正常體溫(圖7)，說(shuō)明OMVs呈遞的E2蛋白能產(chǎn)生很好的保護(hù)效果。

表1重組OMVs免疫家兔不同時(shí)間后血清中特異性抗體水平

Table1Specific antibody level in rabbit serum detected by recombinant OMVs

組別Group免疫后不同時(shí)間兔體血清抗體水平Antibody level at different time after immunization in rabbit serum一免前7天7 days before thefirst immunization一免后第7天7 days after thefirst immunization二免后第7天7 days after thesecond immunization三免后第7天7 days after thethird immunization重組OMVs組Recombinant OMVs group0.139±0.0680.454±0.0630.949±0.1021.140±0.132豬瘟疫苗組Classical swine fever vaccine group0.157±0.0780.336±0.0081.042±0.0681.239±0.098E2蛋白質(zhì)組E2 protein group0.162±0.0620.384±0.0360.767±0.0901.068±0.047PBS組PBS group0.175±0.0400.154±0.0090.192±0.0430.190±0.033

圖7 兔體溫變化曲線Fig.7 Rabbit body temperature curve

3 討論

CSFV E2蛋白屬于真核表達(dá)蛋白，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的E2蛋白多為包涵體且表達(dá)量較少。本實(shí)驗(yàn)以包含按照大腸埃希菌密碼子偏嗜性進(jìn)行密碼子優(yōu)化后的E2基因的pUC57質(zhì)粒為模板(本實(shí)驗(yàn)室保存)，設(shè)計(jì)引物，利用PCR成功擴(kuò)增了去除E2蛋白跨膜區(qū)后的DNA片段，并在其C-端引入了編碼6個(gè)His的堿基序列(TACCACTACCACTACTAC)。通過(guò)構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒獲得了含去除跨膜區(qū)后的E2蛋白的重組OMVs。Western blot結(jié)果證明，重組蛋白和重組OMVs能特異地與His標(biāo)簽單抗結(jié)合，而經(jīng)過(guò)蛋白酶K處理后的重組OMVs不能與His標(biāo)簽單抗結(jié)合，鑒于蛋白酶K只能破壞OMVs外表面的蛋白，而EDTA只能破壞OMVs的膜結(jié)構(gòu)，說(shuō)明重組E2蛋白遞呈在OMVs的外表面[16]。同時(shí)，重組OMVs免疫印跡和SDS-PAGE條帶較細(xì)，說(shuō)明OMVs上遞呈的E2蛋白量較全菌表達(dá)的量少。

兔體免疫試驗(yàn)表明，一免后重組OMVs比E2蛋白組和豬瘟疫苗能更快更強(qiáng)地刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體；二免后重組OMVs組上升較豬瘟疫苗組慢，比E2蛋白組快；但在三免后重組OMVs組和豬瘟疫苗組抗體上升較E2蛋白組慢，可能因?yàn)橥皿w內(nèi)高水平的抗體干擾所導(dǎo)致。為了分析其免疫保護(hù)效果，在兔體上進(jìn)行了免疫攻毒試驗(yàn)。CSFV弱毒C株是在家兔上反復(fù)傳代致弱而得到的，對(duì)豬只有良好的安全性和免疫效力，但對(duì)家兔有一定的致病性，可以使其產(chǎn)生定型熱反應(yīng)[17]。本實(shí)驗(yàn)用家兔作為動(dòng)物模型評(píng)價(jià)重組OMVs的免疫效果[18-19]，發(fā)現(xiàn)兔體注射高劑量CSFV弱毒株C株后，PBS組的兔子出現(xiàn)明顯的定型熱反應(yīng)，而重組OMVs組的兔體溫只在攻毒后24 h出現(xiàn)輕微的熱反應(yīng)，但在12 h后恢復(fù)正常。綜上，大腸埃希菌OMVs具有很好的免疫佐劑效應(yīng)，為研究大腸埃希菌分泌的OMVs作為病毒性蛋白遞呈載體提供了一定的理論依據(jù)，這將為CSF新型亞單位疫苗的研究提供新的思路和方向。