李 琴，何 敏，趙 飄，陳小梅，呂瑩瑩

(四川農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 成都 611130)

白介素21，即白細胞介素-21(interleukin-21，IL-21)，在2000年由Parrish-Novak等[1]發(fā)現(xiàn)，在激活與調(diào)節(jié)免疫細胞，介導T、B細胞活化、增殖與分化，信息傳遞及炎癥反應中起重要作用。IL-21由活化的濾泡輔助性T(Tfh)細胞、CD4+T細胞和自然殺傷(NK)細胞分泌。IL-21與IL-2、IL-4、IL-15具有高度同源的四螺旋簇細胞因子結(jié)構(gòu)域，是良好的免疫增強因子[1]。IL-21對不同階段的T、B細胞和NK細胞均有調(diào)節(jié)作用，能促進T、B細胞和NK細胞增殖與分化，還可以增強NK細胞的殺傷活性[2]，在細胞免疫和體液免疫中起重要的調(diào)節(jié)作用[3]。張峰等[4]發(fā)現(xiàn)IL-21在炎癥性腸病的慢性炎癥中起調(diào)節(jié)作用，王燕等[5]推測IL-21在絲蟲病、瘧疾和利什曼病中起重要作用，魏麗麗等[6]發(fā)現(xiàn)IL-21在機體抗過敏、抗腫瘤方面發(fā)揮重要作用，王世杰等[7]與陳晚華等[8]在小鼠試驗中發(fā)現(xiàn)了IL-21的抗腫瘤作用，劉艷等[9]發(fā)現(xiàn)IL-21對自身免疫病有效。目前， IL-21的研究主要集中在人類和哺乳動物上[4-10]。隨著養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展和禽類疾病的頻現(xiàn)，禽類免疫器官的研究顯得十分重要。關(guān)于雞和鴨免疫器官中IL-21的定位已有相關(guān)資料報道[10]，但在中國黃羽鵪鶉盲腸扁桃體中的定位還未見相關(guān)研究報道。

中國黃羽鵪鶉屬隱性黃羽類型，是由岳根華于1990年發(fā)現(xiàn)并培育成功的，其成活率高，生長快，生長周期短，是一種具有較高經(jīng)濟價值的禽類[11]。鵪鶉的飼養(yǎng)量日益增加，但對鵪鶉的研究遠沒有達到其他家禽的深度[12]。盲腸扁桃體是禽類最大的腸相關(guān)性淋巴組織，位于回盲交接處，肉眼可見該處略微膨大[13]。盲腸扁桃體的免疫作用與法氏囊的退化密切相關(guān)，腸道末端的抗原處理主要由法氏囊完成，隨著法氏囊退化，抗原處理轉(zhuǎn)而由盲腸扁桃體來完成[14]。盲腸扁桃體屬于外周淋巴組織，在外周淋巴組織中，生發(fā)中心是由抗原刺激產(chǎn)生的，盲腸扁桃體的生發(fā)中心主要由B淋巴細胞組成，上皮下固有層也存在大量B淋巴細胞[15]。T淋巴細胞在整個黏膜層分布，主要存在于黏膜固有層中下部，生發(fā)中心周圍的濾泡間區(qū)域分布許多CD4+T淋巴細胞，CD8+T淋巴細胞主要分布在上皮下固有層[16-17]。盲腸扁桃體中T、B淋巴細胞的分布與其功能具有密切關(guān)系，可以更有效地抵御病原體的入侵。禽類各種組織結(jié)構(gòu)基本達到成熟水平時，盲腸扁桃體的免疫功能基本成熟，可以提供足夠的免疫保護作用[18]。鵪鶉在42日齡基本成熟，實驗以此為切入點，運用免疫組織化學SABC法對42日齡中國黃羽鵪鶉盲腸扁桃體中IL-21的分布特點進行觀察，探討IL-21在盲腸扁桃體中的生理意義，為以后研究IL-21在鵪鶉體內(nèi)如何發(fā)揮免疫效應提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗選用的10只42日齡健康中國黃羽鵪鶉(雌雄不分)，購自成都市新津縣興義鎮(zhèn)廣灘村彭定春養(yǎng)殖場。

1.2 主要試劑

兔抗IL-21多克隆抗體(ELA0Ab248)購自上海卡邁舒；即用型SABC(鏈霉親和素-生物素復合物)試劑盒(SA1002-兔IgG)、DAB顯色試劑盒(AR1022)，購自武漢博士德生物工程有限公司。SABC試劑盒包括5%BSA(牛血清白蛋白)封閉液、二抗(生物素化山羊抗兔IgG)、SABC試劑。

1.3 制片

將42日齡的中國黃羽鵪鶉稱量后，剪舌下動脈處死，迅速取出盲腸扁桃體，放入Bouin’s固定液中24 h，固定好的材料流水沖洗24 h。常規(guī)脫水，透明，石蠟包埋。用LEICA RM 2135型石蠟切片機連續(xù)切片，片厚5～6 μm，貼片烘干。

1.4 染色方法

組織切片常規(guī)脫蠟復水，微波修復抗原，3%H2O2室溫下作用20 min，以消除內(nèi)源性過氧化氫酶活性。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育30 min，加一抗，陰性對照組用PBS(磷酸緩沖鹽溶液)代替一抗，4 ℃孵育17 h左右，依次加入二抗和SABC復合物，分別37 ℃孵育1 h、40 min，然后DAB顯色。以上各步驟間均用PBS沖洗。蘇木精染色，脫水，透明，封固。

1.5 結(jié)果分析

在普通光學顯微鏡下進行大體觀察，確定IL-21在盲腸扁桃體中的分布情況與分布位置。然后應用Olympus BH-2顯微鏡觀察，分別對每張切片在40倍、100倍物鏡下隨機攝取圖像，用形態(tài)學圖像分析軟件對400倍鏡下攝取的圖像陽性反應強度進行半定量分析，測量IL-21陽性反應的平均光密度值(mean optical density， MOD)、積分光密度值(integral optical density， IOD)，以及平均灰度值(mean gray value， MGV)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 20.0分析軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 IL-21免疫陽性反應細胞的組織學分布及形態(tài)特征

實驗采用免疫組織化學SABC法觀察，IL-21免疫陽性顯色結(jié)果為棕黃色或棕褐色顆粒，陰性對照切片無陽性產(chǎn)物出現(xiàn)。光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，中國黃羽鵪鶉盲腸扁桃體中陽性信號主要分布在固有層，黏膜上皮下固有層分布較多，棕黃色或棕褐色，圓形或近圓形，直徑差異較大(圖1-A～D)。陽性細胞在腸腺周圍少量存在，棕黃色，錐形(圖1-E)。生發(fā)中心周圍的濾泡間區(qū)域有少量陽性細胞分布，陽性細胞近似圓形，棕黃色或棕褐色，直徑較小(圖1-F)。IL-21陽性反應產(chǎn)物在陽性反應細胞內(nèi)清晰可見，極易辨別，陽性細胞核不是很明顯。

2.2 IL-21陽性反應強度

平均光密度表示在視野內(nèi)所有陽性細胞的平均反應強度，42日齡中國黃羽鵪鶉盲腸扁桃體中IL-21陽性細胞平均光密度為0.62±0.04，說明陽性細胞反應強度較大；積分光密度是表示整個視野內(nèi)所有選定對象的反應強度的總和，積分光密度值高，表示總的反應強度大，實驗測得IL-21陽性細胞積分光密度為9.90±2.34，說明鵪鶉盲腸扁桃體中IL-21陽性細胞總的反應強度大；陽性細胞平均灰度值越低，說明其免疫組化染色越深，本實驗中IL-21平均灰度值為61.38±4.83，說明陽性細胞染色較深。

A， B， C中箭頭示盲腸扁桃體黏膜上皮下固有層IL-21陽性反應；D中箭頭1示盲腸扁桃體黏膜上皮下固有層IL-21陽性反應；箭頭2示盲腸扁桃體腸腺周圍IL-21陽性反應；E中箭頭示盲腸扁桃體黏膜固有層中下部IL-21陽性反應；F中箭頭示盲腸扁桃體生發(fā)中心周圍IL-21陽性反應。400×。The arrow in A， B and C showed IL-21 positive reaction in the lamina propria of the underlying layer of the epithelium of cecal tonsil; the arrow 1 in D showed IL-21 positive reaction in the lamina propria of the underlying layer of the epithelium of cecal tonsil; the arrow 2 showed IL-21 positive reaction in intestinal gland of cecal tonsil; the arrow in E showed IL-21 positive reaction in the lower part of the lamina propria of cecal tonsil; the arrow in F showed IL-21 positive reaction in the germinal center of cecal tonsil. The magnification was 400×.圖1 42日齡中國黃羽鵪鶉盲腸扁桃體Fig.1 Cecal tonsil of 42 day old Chinese Yellow Feather quail

3 討論

3.1 中國黃羽鵪鶉盲腸扁桃體中IL-21分布

盲腸扁桃體的結(jié)構(gòu)與派氏結(jié)相似，由密集型淋巴組織和彌散型淋巴組織組成[19]。盲腸扁桃體作為胃腸免疫系統(tǒng)的一部分，對腸道內(nèi)細菌和其他抗原物質(zhì)起著局部免疫的作用[20]。

光學顯微鏡下觀察，中國黃羽鵪鶉盲腸扁桃體固有層均分布有IL-21陽性細胞，主要位于黏膜上皮下固有層，與董紅艷等[14]及楊樹寶等[15]認為盲腸扁桃體上皮下區(qū)域是B淋巴細胞依賴區(qū)域，進入盲腸的細菌及抗原經(jīng)抗原呈遞細胞轉(zhuǎn)運到上皮下固有層中誘導B淋巴細胞形成特異性漿細胞，以及胡春蓉等[21]的IL-21可有效促進B淋巴細胞分化，形成漿細胞，分泌大量抗體的觀點相符。Gómez等[16]與欒維民等[17]報道，生發(fā)中心主要由B淋巴細胞組成，其周圍分布著許多CD4+T淋巴細胞。石榮亞[22]報道IL-21主要由活化的CD4+T細胞分泌，并且能夠維持生發(fā)中心的形成。本研究觀察到IL-21陽性細胞在生發(fā)中心周圍少量存在，與以上觀點相符。IL-21在盲腸扁桃體中分布與免疫細胞的分布及功能密切相關(guān)，與Glick等[19]發(fā)現(xiàn)CD4+T細胞主要聚集在黏膜層中下部生發(fā)中心的濾泡間區(qū)域、少量存在于生發(fā)中心，胡春蓉等[21]報道IL-21由活化的CD4+T細胞分泌，同時也可作為自分泌生長因子促進CD4+T細胞的增殖相符。Habib等[23]認為，IL-21在盲腸扁桃體中通過自分泌及旁分泌的方式調(diào)節(jié)T、B淋巴細胞增殖分化。

42日齡中國黃羽鵪鶉盲腸扁桃體中IL-21陽性細胞反應強度與逯志強[24]報道的鴕鳥胸腺、脾臟和腔上囊中IL-21陽性細胞反應強度差異較大，可能是動物種類、定位器官、操作方法等不同造成的。

3.2 中國黃羽鵪鶉盲腸扁桃體中IL-21功能

IL-21主要由CD4+T細胞、NK細胞、Tfh細胞及Tfh17細胞分泌，調(diào)節(jié)CD4+T細胞、B細胞的活化及增殖[9]。IL-21與IL-6在CD4+T細胞分化為Th17細胞過程中具有至關(guān)重要的作用。在體外，IL-21抑制FOXP3表達細胞的擴增，能促進初始CD4+T細胞向Th17細胞分化，從而促進CTL的擴增和活化，增強CTL的細胞殺傷活性[5]。易本誼等[25]發(fā)現(xiàn)，IL-21在免疫應答早期參與B細胞的活化，同時又誘導活化的B細胞凋亡，阻止過度的免疫反應發(fā)生，維持自穩(wěn)平衡。劉志偉[26]認為，在機體的生理功能正常情況下，IL-21的表達量很少，而在活化的T淋巴細胞誘導下，IL-21的表達水平相對較高。魏麗麗等[6]報道IL-21介導先天性免疫向獲得性免疫轉(zhuǎn)換，從而在機體抗腫瘤方面發(fā)揮重要作用。吳申等[27]認為，IL-21可能通過刺激不同時期的NK細胞及T細胞增殖，促進IFN-γ的釋放發(fā)揮抗腫瘤作用。IL-21在自身免疫疾病、腫瘤、寄生蟲及腸炎等疾病中都發(fā)揮著重要作用[4-9]。IL-21在疾病治療中的具體作用機制尚不清楚，還有待進一步研究。

IL-21在中國黃羽鵪鶉盲腸扁桃體中廣泛存在，主要分布在黏膜上皮下固有層，陽性細胞的分布與免疫細胞的功能及分布密切相關(guān)。IL-21陽性反應強度可能受動物種類、定位器官和操作方法等因素影響。IL-21對免疫細胞具有調(diào)節(jié)作用，具體調(diào)節(jié)機制依賴于IL-21和其他信號的共同作用，在疾病的治療中具有重要意義。