張 鴿 常美佳 黃嘉楠 周 建 宋元林 白春學(xué) 洪群英

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科 上海 200032)

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是呼吸系統(tǒng)的常見疾病,嚴(yán)重危害人類健康,以氣道不完全可逆性氣流受限為特征。COPD主要累及肺,也可以引起全身炎癥及免疫環(huán)境的紊亂,具體機(jī)制尚未闡明。COPD可能是一種由煙草煙霧誘發(fā)、T細(xì)胞參與的炎癥反應(yīng)及自身免疫疾病[1-2]。角質(zhì)細(xì)胞生長因子2 (keratinocyte growth factor-2,KGF-2)也被稱為FGF10,是含有208個(gè)氨基酸殘基的多肽,隸屬于FGF家族,結(jié)構(gòu)與KGF相似,能夠高親和力結(jié)合FGF-2受體。FGF-2受體廣泛分布于各種上皮細(xì)胞[4]。KGF-2可由間質(zhì)細(xì)胞分泌,能有效促進(jìn)各種上皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化,并直接作用于上皮細(xì)胞,促進(jìn)傷口邊緣細(xì)胞再生和修復(fù),或間接刺激其他細(xì)胞因子的分泌,促進(jìn)肉芽組織形成并減少瘢痕的產(chǎn)生,對脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)引起的急性肺損傷有較強(qiáng)的保護(hù)性作用[5]。本文擬通過建立COPD小鼠模型,觀察KGF-2對COPD小鼠肺部及全身炎癥和免疫環(huán)境的影響,以探討KGF-2對于COPD保護(hù)性作用的機(jī)制。

材 料 和 方 法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組15只雄性SPF級健康BALB/C小鼠,6～8周齡,體重20～25 g,購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室按標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng),自動(dòng)取食飲水。將15只小鼠隨機(jī)分為3組:正常對照組(對照組)、COPD模型組(COPD組)及KGF-2治療組(KGF-2 組),每組5只。

主要藥物和試劑KGF-2(上海新生源公司);市售大前門牌香煙:焦油量15 mg,氣煙堿量1.1 mg;BCA試劑盒(碧云天公司);小鼠IL-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α,TNF-α) ELISA試劑盒(美國eBioscience公司);戊巴比妥鈉(德國默克公司);CD3+、CD4+、CD8+、PD-1流式熒光抗體(美國BD公司)。

主要儀器煙霧發(fā)生器(美國Data Sciences International公司),低溫高速離心機(jī)(型號:5804R,德國Eppendorf公司),流式細(xì)胞檢測儀(美國BD公司),有機(jī)玻璃毒染箱(120 cm×80 cm×80 cm)由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科自制。

動(dòng)物模型復(fù)制利用煙熏加LPS氣道內(nèi)滴注的方法建立小鼠COPD模型。正常對照組自由飲水和攝食,不做任何處理;COPD組小鼠置于有機(jī)玻璃毒染箱(120 cm×80 cm×80 cm)內(nèi)進(jìn)行被動(dòng)吸煙,每天2次,每次10支,每次持續(xù)30 min,2次間隔至少4 h,連續(xù)30天,并在第1天和第14天氣管內(nèi)滴入50μL LPS (1 mL/kg),滴注LPS當(dāng)天暫停吸煙2次。

給藥方法在煙熏第1天及第14天,對照組氣管內(nèi)滴注生理鹽水50μL各1次。COPD組在煙熏第1天及第14天,氣管內(nèi)滴注LPS 25μg(50μL)/次。KGF-2組在煙熏第1天及第14天,氣管內(nèi)滴注LPS(1 mg/kg)及KGF-2 (5 mg/kg),共2次,50μL/次。

取材腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)進(jìn)行麻醉,眼球取血,于4 ℃下900×g離心5 min,分離血清于-80 ℃保存。取血后開胸,氣管插管并固定,使用1 mL注射器以無菌PBS行右肺肺泡灌洗,回收率>80%,肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)于4 ℃下900×g離心10 min,取上清于-80 ℃保存。留取左肺(未灌洗過的肺組織)放入中性4%甲醛溶液,固定48 h后常規(guī)石蠟包埋、切片,肺組織HE染色,用于顯微鏡下觀察肺內(nèi)支氣管損傷以及支氣管、肺組織炎癥細(xì)胞浸潤情況,其余肺組織于-80 ℃保存。留取脾臟,研磨過濾后得到單細(xì)胞懸液,于-80 ℃保存。

指標(biāo)檢測運(yùn)用BCA法測定BALF中蛋白質(zhì)濃度,全自動(dòng)酶標(biāo)儀在562 nm處檢測各孔的吸光度值(D)。運(yùn)用ELISA方法測定血清和BALF中IL-6和TNF-α的水平,嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作,全自動(dòng)酶標(biāo)儀在450 nm處檢測各孔的吸光度(D)值。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)測定脾臟中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及PD+T細(xì)胞的比例,運(yùn)用Flowjo V9軟件進(jìn)行分析。

結(jié) 果

小鼠肺組織HE染色對照組可見支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)清晰,黏膜無明顯破壞及炎癥細(xì)胞浸潤的表現(xiàn);COPD組小鼠肺結(jié)構(gòu)雜亂,破壞較明顯,肺泡壁斷裂,支氣管黏膜上皮細(xì)胞變形、壞死,纖毛不齊、變短、倒伏甚至脫落,管壁增厚,周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤,管腔狹窄或扭曲擴(kuò)張;與COPD組比較,KGF-2治療組肺泡結(jié)構(gòu)破壞減輕,炎癥細(xì)胞浸潤減少(圖1)。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色Fig 1 HE staining in lung tissues of different mice groups

小鼠BALF中蛋白質(zhì)濃度與對照組比較,COPD組和KGF-2組BALF中蛋白質(zhì)濃度明顯升高(P<0.05),但是KGF-2組與COPD組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2,表1)。

圖2 各組小鼠BALF中蛋白濃度的比較Fig 2 Protein concentration in BALF of different mice groups

小鼠BALF及血漿中IL-6和TNF-α水平與對照組比較,COPD組BALF和血漿中IL-6和TNF-α顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與COPD組比較,KGF-2組BALF和血漿中IL-6和TNF-α稍有下降,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3,表1)。

小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的比例與對照組比較,COPD組小鼠脾臟CD4+細(xì)胞比例明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與COPD組比較,KGF-2組小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞比例明顯上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較,COPD組小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞比例明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與COPD組比較,KGF-2組小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞比例稍有上升,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對照組比較,COPD組小鼠脾臟CD4+T/CD8+T明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與COPD組比較,KGF-2組CD4+T/CD8+T未見明顯改變(圖4)。

圖3 各組小鼠BALF和血漿中IL-6和TNF-α水平Fig 3 IL-6 and TNF-α levels in BALF and plasma of different mice groups

圖4 各組小鼠脾臟中T細(xì)胞的分布情況Fig 4 Distribution of T cells in spleen of different mice groups

小鼠脾臟細(xì)胞PD-1的表達(dá)與對照組比較,COPD組小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞中PD-1的表達(dá)比例明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與COPD組比較,KGF-2組小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞中PD-1的表達(dá)比例明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與COPD組比較,KGF-2組小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞中PD-1的表達(dá)比例明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖4)。

討 論

KGF-2對LPS引起的急性肺損傷有較強(qiáng)的保護(hù)性作用。在急性肺損傷模型中,我們分別驗(yàn)證了KGF-2在1、2、5及10 mg/kg時(shí)的保護(hù)性作用,結(jié)果顯示在5 mg/kg時(shí)保護(hù)性作用最強(qiáng)。基于之前的結(jié)果[4],本次實(shí)驗(yàn)采用5 mg/kg、氣管插管、共給藥2次(分別在第14天和第30天)的實(shí)驗(yàn)方法。

KGF-2可有效促進(jìn)各種上皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化,并直接作用于上皮細(xì)胞,促進(jìn)傷口邊緣細(xì)胞再生和修復(fù),或間接刺激其他細(xì)胞因子的分泌,促進(jìn)肉芽組織形成并減少瘢痕的產(chǎn)生[5]。此外,KGF-2可以通過減少炎癥因子的釋放,從而減少T細(xì)胞的過度增殖[6-7]。經(jīng)KGF-2治療的小鼠CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞的比例明顯高于COPD組小鼠,PD-1表達(dá)陽性的T細(xì)胞比例降低。此結(jié)果說明KGF-2可以減輕T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),提高免疫功能。

COPD的主要特征是肺部及全身的慢性炎癥及免疫失調(diào),巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞在肺部浸潤增加[8-11]?；罨难装Y細(xì)胞釋放各種炎癥介質(zhì),包括IL-6和TNF-α等[12]。IL-6作為一種多效應(yīng)的細(xì)胞因子可由多種細(xì)胞產(chǎn)生,它能抑制巨噬細(xì)胞釋放TNF-α,減輕炎癥反應(yīng)[13-14]。TNF-α是導(dǎo)致COPD慢性炎癥損傷和肺實(shí)質(zhì)毀損的重要細(xì)胞因子。吸煙可導(dǎo)致支氣管上皮細(xì)胞受損,組織或肺泡巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞分泌TNF-α,促進(jìn)炎癥因子的趨化和活化,導(dǎo)致氣道結(jié)構(gòu)破壞[15]。TNF-α還能誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞INF-γ受體表達(dá),后者能夠上調(diào)細(xì)胞PD-L1的表達(dá)[16]。TNF-α可誘導(dǎo)氣道黏液細(xì)胞化生和分泌增多,導(dǎo)致小鼠肺氣腫性損害和肺泡壁膠原沉積[17]。本研究發(fā)現(xiàn)在COPD模型小鼠的BALF和血漿中IL-6和TNF-α的含量明顯升高,經(jīng)KGF-2治療后的COPD小鼠IL-6和TNF-α水平較COPD組小鼠有所下降,由此說明KGF-2對COPD小鼠的肺部及全身炎癥有一定的改善作用。

近年來研究發(fā)現(xiàn),香煙等有害氣體刺激機(jī)體啟動(dòng)固有免疫,固有免疫破壞肺組織,裂解出來的彈力蛋白片段成為抗原,又啟動(dòng)了T細(xì)胞介導(dǎo)的獲得性免疫[18-19]。PD-1是表達(dá)在效應(yīng)T細(xì)胞表面的一個(gè)負(fù)向調(diào)控共刺激分子,在持續(xù)的炎癥性免疫應(yīng)答中表達(dá)會上調(diào),通過與配體PD-L1和PD-L2相互作用,抑制外周組織中持續(xù)免疫反應(yīng),并阻止自身組織受到免疫損傷[20]。吸煙的COPD患者肺內(nèi)存在寡克隆CD4+T細(xì)胞聚集,COPD可能是一種由煙草煙霧誘發(fā)、T細(xì)胞參與的炎癥反應(yīng)及自身免疫疾病。COPD患者常常存在氣道及全身炎癥及免疫失調(diào),導(dǎo)致容易發(fā)生感染及急性加重。T淋巴細(xì)胞亞群各細(xì)胞成分間比例的維系是正常免疫反應(yīng)的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ),T淋巴細(xì)胞在抗原的刺激下呈現(xiàn)亞群比例紊亂,導(dǎo)致免疫反應(yīng)不恰當(dāng)增強(qiáng)或減弱,造成組織損傷或炎癥的持久存在,這可能是COPD病情進(jìn)展的機(jī)制之一[20]。已有研究證實(shí),在COPD緩解期,外周血CD4+T細(xì)胞數(shù)目及CD4+/CD8+T細(xì)胞相對于對照組有所降低[16]。在我們的研究中,COPD小鼠CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞比例明顯低于對照組,PD-1表達(dá)陽性的T細(xì)胞比例升高,提示COPD小鼠免疫反應(yīng)減弱。經(jīng)KGF-2治療的小鼠CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞的比例明顯高于COPD組小鼠,PD-1表達(dá)陽性的T細(xì)胞比例降低,提示KGF-2可以提高小鼠脾臟中CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞數(shù)量,并部分恢復(fù)CD4+T細(xì)胞的免疫活性。

本研究結(jié)果說明KGF-2對于炎癥損傷的保護(hù)性作用有限,但是對于增強(qiáng)免疫功能有一定的作用,提高了CD4+T細(xì)胞的比例和活性及CD8+T細(xì)胞的數(shù)量。CD4+T細(xì)胞的分類及機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

綜上所述,KGF-2通過降低肺部及全身IL-6和TNF-α水平及提高CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞比例,降低T細(xì)胞PD-1的表達(dá)來改善COPD,提示KGF-2在一定程度上能改善COPD慢性炎癥反應(yīng)及增強(qiáng)免疫力。