劉 婕 李曉健 肇 暉

(復旦大學基礎(chǔ)醫(yī)學院中西醫(yī)結(jié)合系 上海 200032)

酒精濫用是繼心腦血管疾病和癌癥之后第3大影響人類健康的公共衛(wèi)生問題。研究顯示,酒精濫用不僅破壞肝臟、胃腸道和胰腺等多種器官的功能,而且對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成極大損傷,影響睡眠,降低記憶力[1]。青春期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育尚未成熟,多種神經(jīng)遞質(zhì)及激素仍處于持續(xù)變化中,機體對酒精的藥理作用有獨特的敏感性[2],對酒精的厭惡反應(yīng)較弱[3]。如何有效地抑制青春期的飲酒行為已成為醫(yī)學界的熱門話題。

應(yīng)激是導致酒精濫用的危險性因素,如束縛應(yīng)激、強迫游泳、足底電擊等[4]。創(chuàng)傷是一種常見的應(yīng)激源,50%～70%的個體在一生中至少會經(jīng)歷1次創(chuàng)傷應(yīng)激[5]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷應(yīng)激會抑制機體的免疫系統(tǒng)[6],還有研究指出免疫炎癥可以引發(fā)酒精濫用行為[7-8]。那么,創(chuàng)傷應(yīng)激是否會誘導飲酒行為呢？

可卡因安非他明調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子(cocaine-and-amphetamine-regulated transcript,CART)于1995年由Douglass等[9]在急性注射可卡因和安非他明的大鼠紋狀體中首次發(fā)現(xiàn)。而后發(fā)現(xiàn)CART編碼的肽有129或116個氨基酸兩種形式,其中包括27個氨基酸的前導區(qū)序列(pro-peptide sequence),所以成熟的CART肽含有102個或89個氨基酸[9]。1999年,Kuhar等[10]確認并分離出兩種主要的活性肽片段:CART 55-102和CART 62-102。有研究指出CART 55-102可以參與調(diào)控飲食、能量代謝、穩(wěn)態(tài)調(diào)控、藥物成癮等多種生物學過程[11]。CART最初在管理可卡因和安非他明中被發(fā)現(xiàn),而后越來越多的報道證明其在其他精神興奮性藥物(如嗎啡、酒精)管理中的調(diào)節(jié)作用[12-14]。然而,對于CART 55-102在創(chuàng)傷模型中飲酒行為的研究卻十分有限。

應(yīng)激反應(yīng)往往伴隨著下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamus-pituitary-adrenal,HPA)軸的激活[15-16]。CART 55-102作為一種神經(jīng)遞質(zhì)類的活性肽,廣泛分布于HPA軸3個水平上[17]。下丘腦室旁核(hypothalamic paraventricular nucleus,PVN)作為HPA軸的起始位點,參與對多種應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控,如足底電擊[18]、束縛應(yīng)激[19]、慢性可變應(yīng)激[20]等。本研究旨在探討PVN中CART 55-102是否參與創(chuàng)傷應(yīng)激對飲酒行為的調(diào)控。

材 料 和 方 法

實驗動物青春期雄性SD大鼠(PND 33)購自上海斯萊克實驗動物中心。室溫(23±1)℃,濕度 50%±5%,光照強度(200±50)lx,每天12 h (7:00/19:00)明暗交替,自由攝食攝水。所有操作處理均符合復旦大學動物和國際實驗動物使用準則。

藥品與試劑兔抗-CART 55-102 多克隆抗體(德國菲尼克斯醫(yī)藥公司,批號H-003-62),CART 55-102 (美國R&D公司,批號3337)。

血藥濃度測試在飲酒行為測試結(jié)束后,動物立即被斷頭處死。收集血液并離心(4 ℃,931×g,30 min),得到的血清于-80 ℃下保存。按照EnzyChromTMEthanol Assay試劑盒(ECET-100,美國BioAssay 公司)的說明書進行測定。

免疫組化染色對照組麻醉及創(chuàng)傷組造模后,次日取腦,切片,厚度為30 μm。按照切片位置選取合適腦片,0.01 mol/L PBS浸洗10 min×3次,于3% H2O2中37 ℃孵育30 min,0.01 mol/L PBS浸洗10 min×3次,于封閉液中37 ℃封閉1 h,加入一抗兔抗CART 55-102,37 ℃孵育1 h,4 ℃過夜。次日用0.01 mol/L PBS浸洗10 min×3次,生物素二抗37 ℃孵育1 h,PBS浸洗,37 ℃ AB液中繼續(xù)孵育1 h,PBS浸洗。DAB顯色,PBS浸洗,貼片,脫水透明,封片,顯微鏡拍照。

于PVN處微注射CART55-102SD大鼠體重約160 g時,進行埋管,PVN定位至坐標(前/后:-1.5 mm,內(nèi)/外:± 0.4 mm,背/腹:-8.0 mm),雙側(cè)固定于頭骨,并使用牙托粉和螺絲加以固定?；謴图s7天后,在出生后42天進行應(yīng)激模型構(gòu)建,次日雙側(cè)給予PVN生理鹽水和CART 55-102,每側(cè)0.5μL(含1.25μg CART 55-102),每組6只。預(yù)實驗中選擇0.025、0.625、1.25μg CART 55-102 和生理鹽水進行PVN注射,觀察飲酒行為。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與生理鹽水組比較,CART 55-102組抑制飲酒行為呈現(xiàn)劑量依賴性,且1.25μg CART 55-102組的差異有統(tǒng)計學意義。因此,選用1.25μg CART 55-102和生理鹽水進行PVN微注射,測試后續(xù)14天的飲酒行為及飲酒結(jié)束后的血藥濃度。另外,通過導管給予斷頭處死的大鼠雙側(cè)PVN各1.0μL墨水,制做切片,觀察墨水的位置,以驗證給藥導管位置的正確性。

結(jié) 果

創(chuàng)傷應(yīng)激可以誘導大鼠的飲酒行為與對照組相比,創(chuàng)傷組大鼠的飲酒量及酒精偏好均從第4天呈現(xiàn)大幅增加(P<0.01,t=3.219,df=10,圖1A;P<0.01,t=3.562,df=10,圖1C),且14天的平均飲酒量和酒精偏好差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,t=2.669,df=10,圖1B;P<0.05,t=2.552,df=10,圖1D),測試結(jié)束后血清中乙醇濃度明顯增多(P<0.05,t=2.527,df=10,圖1E)。說明創(chuàng)傷應(yīng)激可以誘導大鼠的飲酒行為,增加飲酒量和酒精偏好。

創(chuàng)傷應(yīng)激導致PVN中CART55-102免疫活性降低為了探究創(chuàng)傷應(yīng)激誘導大鼠飲酒行為的機制,我們觀察并統(tǒng)計了PVN中CART 55-102的免疫活性。與對照組相比,創(chuàng)傷組大鼠PVN中CART 55-102的免疫活性明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,t=2.23,df=10,圖2),提示創(chuàng)傷應(yīng)激后PVN中CART 55-102活性被抑制。

PVN中CART55-102可以抑制飲酒行為為了探索創(chuàng)傷應(yīng)激對CART 55-102的調(diào)控是否介導后續(xù)的飲酒行為,我們對創(chuàng)傷組大鼠PVN微注射生理鹽水和CART 55-102,觀察其對飲酒行為的影響。與生理鹽水組相比,CART 55-102注射組的飲酒量和酒精偏好分別從第3天和第1天開始減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,t=2.412,df=10,圖3A;P<0.001,t=8.48,df=10,圖3C),14天的平均飲酒量、酒精偏好及飲酒結(jié)束時的血藥濃度均明顯下降(P<0.001,t=4.86,df=10,圖3B;P<0.01,t=3.258,df=10,圖3D;P<0.05,t=2.543,df=10,圖3E)。為了驗證給藥導管位置是否正確,測試結(jié)束后,通過導管給予雙側(cè)PVN各1.0μL墨水,制做切片觀察墨水的位置(圖3F)。結(jié)果說明下丘腦PVN中CART 55-102可以抑制創(chuàng)傷應(yīng)激誘導的飲酒行為,提示創(chuàng)傷應(yīng)激可能通過調(diào)控PVN中CART 55-102的活性來增強飲酒行為。

圖1創(chuàng)傷應(yīng)激增強青春期大鼠的飲酒行為
Fig1Traumaticstressincreasesdrinkingbehaviorinadolescentrats

圖2創(chuàng)傷應(yīng)激降低大鼠PVN中CART55-102的免疫活性
Fig2TraumaticstressdecreasestheimmuneactivityofCART55-102inthePVNofrats

討 論

應(yīng)激是機體遭受內(nèi)外環(huán)境因素刺激時做出的非特異性的全身反應(yīng)。適度的應(yīng)激會促使機體做出代償性反應(yīng),調(diào)控機體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。而強烈或持久的應(yīng)激會破壞機體的神經(jīng)免疫內(nèi)分泌系統(tǒng)穩(wěn)態(tài),損害多項器官功能,導致機體功能紊亂和組織損傷,且常誘導異常的行為學反應(yīng),其中最為顯著的是酒精濫用行為[22-23]。研究指出多種應(yīng)激因素會參與酒精濫用的發(fā)生與發(fā)展,如束縛應(yīng)激、強迫游泳、足底電擊等[4]。 Koob等[24]認為酒精濫用是應(yīng)激通過某種適應(yīng)機制導致的病理現(xiàn)象。而創(chuàng)傷作為一種常見的應(yīng)激源,對其與飲酒行為的研究卻非常有限。本研究結(jié)果說明創(chuàng)傷應(yīng)激可以誘導青春期SD大鼠的飲酒行為,加強飲酒量、酒精偏好以及血清中乙醇濃度(圖1)。

圖3PVN中CART55-102可以抑制創(chuàng)傷應(yīng)激后的飲酒行為
Fig3CART55-102inthePVNcaninhibitthedrinkingbehavioraftertraumaticstress

CART是在PVN中廣泛表達的一種神經(jīng)肽。除了飲食方面的功能研究指出PVN中CART 55-102可能通過神經(jīng)肽Y通路參與機體能量代謝及飲食調(diào)節(jié)[25],更多研究是關(guān)于CART 55-102與應(yīng)激反應(yīng)的聯(lián)系以及對精神興奮性藥物的管理。Sharma等[26]發(fā)現(xiàn)PVN中CART 55-102不僅可以調(diào)控能量代謝,而且介導了2,4,5-三甲基-3-噻唑啉(2,4,5-three methy-3-thiazoline,TMT)誘導的恐懼應(yīng)激的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng),且呈現(xiàn)核區(qū)特異性。在TMT暴露的大鼠中,中央杏仁核、腹側(cè)終紋床核及PVN中CART 55-102免疫活性增強,而在嗅球中無明顯差異。Balkan等[27]指出強迫游泳應(yīng)激可以調(diào)控CART 55-102的免疫活性,且有性別差異性,在雄性大鼠中強迫游泳增強下丘腦和杏仁核中CART 55-102的活性,而在雌性大鼠中強迫游泳降低杏仁核中CART 55-102的表達,下丘腦中CART 55-102沒有明顯變化。本研究發(fā)現(xiàn),創(chuàng)傷應(yīng)激可以減弱雄性大鼠PVN中CART 55-102的免疫活性(圖2)。因此,CART 55-102的表達不僅與應(yīng)激反應(yīng)的類型有關(guān),而且具有性別和核區(qū)特異性。

另有研究指出,在大鼠急性管理高劑量嗎啡以及嗎啡戒斷階段,腦脊液和血液中CART 55-102均大幅度上升[12]。Salinas等[28-29]認為CART 55-102 可以參與對飲酒行為的管理。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),PVN中微注射CART 55-102可以明顯減弱大鼠的飲酒行為(圖3),說明PVN中CART 55-102可以抑制創(chuàng)傷應(yīng)激所誘導的飲酒行為,從而對機體產(chǎn)生保護性作用。CART 55-102對飲酒行為的調(diào)控作用在其他文獻中已有報道。King等[30]指出大鼠側(cè)腦室給予CART 55-102會抑制環(huán)境所誘導的酒精找尋行為。伏隔核內(nèi)微注射CART 55-102會劑量依賴性地減弱動物飲酒行為,而CART 1-27則對飲酒行為沒有影響[14]。在中腦腹側(cè)被蓋區(qū)的管理會促使大鼠出現(xiàn)相似于CART誘導的條件位置偏好行為[31]。CART 55-102對精神興奮性藥物的管理機制非常復雜,且具有核區(qū)特異性及劑量依賴性。CART 55-102對攝取精神興奮性藥物的促進或抑制作用依賴于其所在核區(qū)及各核區(qū)之間的聯(lián)系,研究其對藥物管理的作用不應(yīng)只局限于對動物行為學的觀察,應(yīng)該加入更多對相關(guān)激素水平的研究。

應(yīng)激反應(yīng)往往伴隨HPA軸的激活,促使PVN分泌并釋放促腎上腺激素釋放激素(corticotropin releasing factor,CRF),從而刺激垂體中促腎上腺激素(adrenocorticotrophic hormone,ACTH)的分泌和腎上腺中糖皮質(zhì)激素[大鼠中為皮質(zhì)酮(corticosterone,CORT),人類中為皮質(zhì)醇]的釋放[15-16]。CART 55-102在HPA軸3個水平上的高表達提示CART 55-102可能與HPA軸活性存在某種調(diào)控關(guān)系[17],相關(guān)研究也指出PVN中CART 55-102可以刺激促腎上腺激素的分泌釋放,增強HPA軸的活性[32],而且CART 55-102也可以被HPA軸相關(guān)激素促腎上腺激素釋放激素和皮質(zhì)醇所調(diào)節(jié)[33],兩者呈相互促進的關(guān)系。另有研究指出,CORT可以通過與伏隔核中多巴胺系統(tǒng)發(fā)生作用,導致長時程的酒精管理行為加強[34-36],提示HPA軸可以調(diào)控長期的飲酒行為。本研究中發(fā)現(xiàn)單次給予創(chuàng)傷大鼠CART 55-102,可以長時間維持對飲酒行為的抑制,這可能是通過對HPA軸的介導而實現(xiàn)的。在創(chuàng)傷模型PVN中CART 55-102是否通過作用于HPA軸來抑制飲酒行為,還需要進一步的研究和探討。

Dandekar等[37]指出酒精戒斷后不同時間會影響PVN中CART 55-102的表達,戒斷24 h時免疫活性細胞和纖維大量表達,戒斷48 h時活性細胞大幅下降。也有研究指出PVN中相關(guān)肽會促進飲酒反應(yīng)耦聯(lián)的多種行為,從而增加酒精的攝入量[38]。這些研究結(jié)果都說明PVN在調(diào)控飲酒行為中起著重要的作用。本研究中,我們觀察到創(chuàng)傷應(yīng)激可以誘導青春期大鼠的飲酒行為,而PVN中CART 55-102參與并抑制創(chuàng)傷應(yīng)激誘導的飲酒行為,這也在臨床上為創(chuàng)傷后酒精濫用的患者提供了一個治療性靶點。