于 鑫 張永鎮(zhèn) 于恩達(dá) 王 娜 帥 群 閆飛虎 蔣露芳王和興 劉健翔 陳 躍 李兆申 蔡全才△ 姜慶五

(1復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室-教育部公共衛(wèi)生安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,5營養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室-教育部公共衛(wèi)生安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200032; 2海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院消化內(nèi)科,6普外科 上海 200433; 3中國人民解放軍92914部隊(duì)醫(yī)院消化內(nèi)科 臨高 571833;4渥太華大學(xué)醫(yī)學(xué)系流行病與公共衛(wèi)生學(xué)院 渥太華 K1G 5Z3)

結(jié)直腸癌是常見的消化道腫瘤之一,2013年中國結(jié)直腸癌發(fā)病人數(shù)居惡性腫瘤第4位,新發(fā)病例數(shù)約34.8萬人,死亡人數(shù)約16.5萬人[1]。隨著人口老齡化、社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展及生活方式改變等一系列原因,我國的結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢(shì)[2]。

結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)。85%～95%的病例以各種環(huán)境因素為病因,包括西方模式的飲食習(xí)慣、吸煙、飲酒、肥胖以及糖尿病等[3]。近年來,腸道菌群改變以及促腫瘤微環(huán)境的形成在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用日益受到關(guān)注[4-5]。

主流觀點(diǎn)認(rèn)為,大部分結(jié)直腸癌的發(fā)展經(jīng)歷了正常上皮細(xì)胞—腺瘤—進(jìn)展期腺瘤—腫瘤的一系列過程[4]。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明特定細(xì)菌(如具核梭桿菌)與結(jié)直腸腫瘤的形成密切相關(guān)[6],然而關(guān)于良性的增生性息肉與腺瘤和作為癌前病變的進(jìn)展期腺瘤的菌群變化特征研究較少,樣本量也較小。本研究基于單中心病例對(duì)照研究,分析結(jié)直腸癌早期病變(癌前病變與良性病變)患者的腸道菌群變化特征,探索在結(jié)直腸癌早期病變中可能發(fā)揮重要作用的細(xì)菌,為腸道菌群變化與結(jié)直腸癌早期階段的關(guān)系提供線索。

資 料 和 方 法

研究對(duì)象本研究為病例對(duì)照研究,研究對(duì)象來自2014—2015年海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院門診的腸鏡受檢者。共納入研究對(duì)象280例,包括88例進(jìn)展期腺瘤患者、32例單純腺瘤患者、30例增生性息肉患者以及130位無結(jié)直腸疾病的受檢者。將進(jìn)展期腺瘤患者納入癌前病變組;將單純腺瘤患者與增生性息肉患者納入良性病變組;將無結(jié)直腸疾病的受檢者納入對(duì)照組。

病例組研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn):(1)患者在長海醫(yī)院初次被診斷為相應(yīng)疾病;(2)年齡≥40歲;(3)漢族;(4)檢查前無腸道腫瘤、息肉、炎性腸病,無結(jié)直腸腫瘤家族史,無其他器官腫瘤病史和腸道相關(guān)手術(shù)史;(5)過去6個(gè)月未使用過抗生素;(6)能同時(shí)獲得治療前糞便標(biāo)本并填寫調(diào)查問卷表;(7)對(duì)參加本課題研究知情同意。對(duì)照組經(jīng)結(jié)腸鏡檢查無結(jié)直腸相關(guān)疾病,其余納入標(biāo)準(zhǔn)與病例組一致。本項(xiàng)研究通過海軍軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會(huì)審核(編號(hào):CHEC2015-082)。

樣本收集與處理所有研究對(duì)象均完成一份調(diào)查問卷,包括年齡、性別、體重指數(shù)(body mass index,BMI)、生活習(xí)慣(包括吸煙、飲酒)、疾病既往史等。BMI≥24 kg/m2為超重,BMI≥28 kg/m2為肥胖[7]。位于盲腸、升結(jié)腸、肝曲、橫結(jié)腸、脾曲的病變?yōu)榻瞬∽?而位于降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸與直腸為遠(yuǎn)端病變。進(jìn)展期腺瘤指直徑超過1cm的腺瘤、絨毛狀腺瘤或伴有重度不典型增生的管狀腺瘤。吸煙、飲酒情況按照從無或曾經(jīng)有過進(jìn)行分類。

所有研究對(duì)象的新鮮糞便樣本(≥1 g)于結(jié)直腸鏡檢腸道準(zhǔn)備之前取得。糞便樣本細(xì)菌的DNA使用OMEGA-soil DNA試劑盒(美國Omega Bio-Tek公司)按照說明書進(jìn)行提取。經(jīng)過PCR擴(kuò)增之后,對(duì)細(xì)菌的16S rDNA的V3～V4片段進(jìn)行測(cè)序,使用通用引物338F 5’-ACTCCTACGGGAGG-CAGCAG-3’與806R 5’-GGACTACHVGGGTW-TCTAAT-3’。測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司在Illumina MiSeq平臺(tái)完成。

生物信息學(xué)分析與統(tǒng)計(jì)分析采用 Trimmomatic軟件篩除序列尾部質(zhì)量值20以下的堿基,過濾50 bp窗口內(nèi)平均質(zhì)量低于20的窗口以及尾部,篩除單條序列,在此基礎(chǔ)上以97%相似度聚類得到操作分類單元(operational taxonomic units,OTU),挑選出每個(gè)OTU的代表序列并利用SINTAX算法[8]與RDP數(shù)據(jù)庫對(duì)比得到每個(gè)OTU的群落名稱。參數(shù)設(shè)置:對(duì)門、綱、目、科、屬級(jí)別的置信閾值為0.8,對(duì)種級(jí)別的置信閾值為0.5。

為比較不同組的研究對(duì)象腸道菌群物種多樣性,基于OTU表格計(jì)算α多樣性(ace,shannon,simpson,PD whole tree)與β多樣性(非加權(quán)和加權(quán)Unifrac距離),并對(duì)3組研究對(duì)象的α多樣性進(jìn)行方差分析。為衡量總體的菌群結(jié)構(gòu)差異,基于β多樣性進(jìn)行PERMANOVA分析,同時(shí)控制潛在的混雜因素,包括年齡、性別、BMI、吸煙及飲酒情況。

為比較3組研究對(duì)象在屬與種兩個(gè)分類級(jí)別上的差別,使用懷特非參數(shù)檢驗(yàn)[9](White’s non-parametrict-test)挑選出差異細(xì)菌并進(jìn)行可視化,多重比較校正采用Benjamini-Hochberg方法。生物信息分析利用QIIME 1.9.1平臺(tái)完成,統(tǒng)計(jì)分析使用R軟件v 3.3.2完成,不同組間細(xì)菌豐富度差異的檢驗(yàn)應(yīng)用STAMP v 2.1.3軟件。

結(jié) 果

研究對(duì)象的一般情況研究對(duì)象的年齡為40～84歲,癌前病變組、良性病變組和對(duì)照組在性別、年齡、BMI和病變位置方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,癌前病變組與良性病變組相比,病變部位更多位于遠(yuǎn)端(χ2=4.84,P=0.028)。

表1 結(jié)直腸腺瘤與息肉患者及對(duì)照組的一般情況Tab 1 Distribution of basic information among patients with and without colorectal adenoma and polyps

aPvalues were calculated byχ2test;bPvalue was calculated by ANOVA;A-CRA:Advanced colorectal adenoma;Polyps:Colorectal adenoma and hyperplastic polyps.

腸道菌群總體描述經(jīng)過質(zhì)量控制與清洗,最終在280個(gè)樣本中得到19 714 595條高質(zhì)量序列,1 512個(gè)OTU。根據(jù)物種分類可以分為12個(gè)門,19個(gè)綱,29個(gè)目,57個(gè)科,119個(gè)屬,238個(gè)種(納入條件:門平均相對(duì)豐富度> 0.01%;綱至種:相對(duì)豐富度>0.001%)。

三組樣本的α多樣性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(ace:F=2.293,P=0.103;shannon:F=0.079,P=0.924;simpson:F=0.181,P=0.835;PD whole tree:F=1.540,P=0.216;方差分析)。在控制了年齡、性別、BMI以及吸煙飲酒情況之后,基于β多樣性距離進(jìn)行PERMANOVA分析發(fā)現(xiàn),不同組的腸道菌群結(jié)構(gòu)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(非加權(quán)Unifrac 距離:F=1.834,P=0.005;加權(quán) Unifrac 距離:F=0.725,P=0.626)。

癌前病變組、良性病變組與對(duì)照組在“屬”分類級(jí)別的比較通過對(duì)119個(gè)菌屬進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn),結(jié)果顯示共有7個(gè)菌屬在早期病變患者體內(nèi)有顯著變化。與對(duì)照組相比,癌前病變組患者體內(nèi)的卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)(P<0.001)與Alloprevotella(P<0.001)明顯上升,而雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)顯著下降(P=0.018);良性病變組患者Akkermansia(P=0.007)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)(P<0.001)和乳酸桿菌屬(Lactobacillus)(P<0.049)顯著增多,而克雷伯氏菌屬(Klebsiella)(P<0.001)和雙歧桿菌屬(P<0.001)顯著減少(圖1)。

(1)polypsvs.control,(2)A-CRAvs.control,P<0.05.

圖1結(jié)直腸腺瘤與息肉患者與對(duì)照組相比在“屬”級(jí)別細(xì)菌變化情況
Fig1Featuredmicrobesinthecomparisonbetweencontrolsandpatientswithcolorectaladenomaandpolypsatthegenuslevel

癌前病變組、良性病變組與對(duì)照組在“種”分類級(jí)別的比較對(duì)238個(gè)菌種進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,癌前病變組患者糞便中有11個(gè)菌種存在顯著差別(圖2),其中Clostridiumbolteae(P=0.014)、Alloprevotellarava(P<0.001)、Enterobactersoli(P<0.001)、牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)(P<0.001)共4種細(xì)菌顯著上升,而丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)(P=0.001)、Veillonelladispar(P<0.001)、Veillonellarogosae(P=0.005)、Fusobacteriummortiferum(P<0.001)、Bacteroidescoprophilus(P=0.026)、Clostridiumcolinum(P=0.030)與Streptococcusdentisani(P=0.028)共7種細(xì)菌中顯著下降。

與對(duì)照組相比,良性病變組患者糞便內(nèi)發(fā)現(xiàn)副流感嗜血桿菌(Haemophilusparainfluenzae)(P<0.001)、Prevotellastercorea(P=0.011)、Clostridiumbolteae(P=0.006)、Enterobactersoli(P<0.001)、Akkermansiamuciniphila(P=0.006)、Veillonellaatypica(P<0.001)、Veillonellaratti(P=0.007)共7種細(xì)菌顯著上升,而Veillonelladispar(P<0.001)、Megasphaeraindica(P=0.014)、Clostridiumcolinum(P=0.027)和Clostridiumbutyricum(P=0.007)共4種細(xì)菌顯著下降(圖2)。

討 論

本研究通過以醫(yī)院資料為基礎(chǔ)的病例對(duì)照研究,對(duì)首次診斷的進(jìn)展期腺瘤、單純腺瘤和增生性息肉患者腸道菌群構(gòu)成變化進(jìn)行了分析。

近年來,關(guān)于腸道菌群的變化與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系的重要研究不斷增多[4-5,10]。本研究比較進(jìn)展期腺瘤患者與對(duì)照組的糞便菌群發(fā)現(xiàn),卟啉單胞菌屬以及其菌種牙齦卟啉單胞菌、Alloprevotella以及其菌種Alloprevotellarava在進(jìn)展期腺瘤患者糞便中明顯上升。牙齦卟啉單胞菌是一種能引起牙周疾病的厭氧致病菌,與口腔癌的發(fā)生密切相關(guān)。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[11],牙周病以及牙齒牙列缺失可能增加結(jié)直腸癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。有研究指出[12],卟啉單胞菌屬、消化鏈球菌(Peptostreptococcus)等引起牙周疾病的致病菌在結(jié)直腸癌患者腸道菌群中有顯著上升,猜測(cè)牙周致病菌同時(shí)是結(jié)直腸癌潛在致病菌,牙齦卟啉單胞菌等致病菌對(duì)結(jié)直腸癌的致病模式可能與牙周病類似。提示牙周病致病菌對(duì)結(jié)直腸癌可能有重要作用。關(guān)于Alloprevotellarava的研究較少,有文獻(xiàn)指出其與白塞病可能有關(guān)[13]。

(1)Polypsvs. control,(2)A-CRAvs. control,P<0.05.

圖2結(jié)直腸腺瘤與息肉患者與對(duì)照組相比在“種”級(jí)別細(xì)菌變化情況
Fig2Featuredmicrobesinthecomparisonbetweencontrolsandpatientswithcolorectaladenomaandpolypsatthespecieslevel

雙歧桿菌屬是人體腸道內(nèi)重要的常見共生細(xì)菌。該菌屬下的一些菌種被認(rèn)為是能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生有利影響的益生菌[14]。既往研究中指出,在結(jié)直腸癌患者糞便中以及腸道黏膜附著的雙歧桿菌屬豐富度明顯下降,提示其可能在結(jié)直腸癌進(jìn)展過程中發(fā)揮預(yù)防與保護(hù)的作用[15-16]。雙歧桿菌能發(fā)揮抗過敏效應(yīng)、減少有害細(xì)菌等多種生理作用[17]。在本研究中,進(jìn)展期腺瘤患者體內(nèi)雙歧桿菌屬較對(duì)照組顯著降低,與既往研究結(jié)論一致。

丁酸梭菌以及Streptococcusdentisani的變化同樣值得關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn),這兩種細(xì)菌在結(jié)直腸癌早期病變患者體內(nèi)顯著下降,且隨著病情發(fā)展細(xì)菌豐富度降低。丁酸梭菌是一種常見于人體腸道的嚴(yán)格厭氧菌細(xì)菌。有研究報(bào)道,小鼠口服丁酸梭菌能夠調(diào)節(jié)消化道菌群,提升益生菌豐富度,并能通過引導(dǎo)F4/80+CD11b+腸道巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-10從而抑制小鼠急性結(jié)腸炎[18-19]。實(shí)驗(yàn)研究顯示,丁酸梭菌能起到減少腸道腫瘤發(fā)生的作用[20]。Strepto-coccusdentisani是一種存在于健康人牙菌斑內(nèi)的正常細(xì)菌,研究顯示其不產(chǎn)生毒素并且能夠通過產(chǎn)生細(xì)菌素抑制主要口腔致病菌的生成以及緩沖過酸性pH條件,被認(rèn)為是一種益生菌[21]。除此之外,屬于人體腸道常見共生菌的韋榮球菌屬[22]的菌種(如Veillonelladispar)也被發(fā)現(xiàn)在進(jìn)展期腺瘤患者糞便中減少。

本研究觀察到進(jìn)展期腺瘤和良性病變患者的α多樣性與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且加權(quán)Unifrac距離并未顯示菌群存在結(jié)構(gòu)變化。造成該結(jié)果的原因可能是,糞便菌群與病變黏膜細(xì)菌相比,受到更多因素的影響[10]。

本研究結(jié)果顯示,大部分在患者體內(nèi)有顯著差異的細(xì)菌并非隨疾病惡性程度豐富度增加或減少。在良性病變患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)克雷伯氏菌屬、乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、Akkermansia等細(xì)菌顯著升高的現(xiàn)象,猜測(cè)可能是由于良性病變導(dǎo)致了某些益生菌代償性地增加。由于目前對(duì)良性病變患者腸道細(xì)菌變化規(guī)律和特定細(xì)菌生理特性的研究較少,尚無法判斷出現(xiàn)此情況的具體原因。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)進(jìn)展期腺瘤、良性病變(單純性腺瘤與增生性息肉)患者體內(nèi)腸道菌群與對(duì)照組相比在整體結(jié)構(gòu)和多種細(xì)菌上有顯著的變化,進(jìn)展期腺瘤患者體內(nèi)牙周病致病菌豐富度上升、益生菌豐富度下降,良性病變患者體內(nèi)多種益生菌豐富度發(fā)生變化。上述變化可能與結(jié)直腸癌早期病變的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究對(duì)結(jié)直腸癌早期病變的腸道菌群變化規(guī)律做了初步探索,為結(jié)直腸癌病變的早期階段與腸道菌群變化的關(guān)系提供了線索。