姜曉斐 羅心平 高秀芳 施海明

(復旦大學附屬華山醫(yī)院心內(nèi)科 上海 200040)

紅景天是景天科紅景天屬多年生草本或亞灌木植物,生長于高寒低氧地帶,藥理作用廣泛[1],其耐缺氧、抗心肌缺血作用的機制[2-3]一直受到關(guān)注。腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin,ADM)屬于降鈣素基因相關(guān)肽家族成員,具有促進血管擴張、內(nèi)皮細胞增殖、血管新生等多種生物學效應(yīng)[4-5],降鈣素受體樣受體(calcitonin receptor-like receptor,CRLR)是ADM的特異性受體,與之結(jié)合產(chǎn)生系列生物學效應(yīng)。我們之前的研究[6-8]證實紅景天具有促缺血心肌血管新生作用,這一作用主要存在于低氧狀態(tài)下,與紅景天上調(diào)ADM及CRLR的表達有關(guān),并且作用具有一定的靶向性。缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1 alpha,HIF-1α)[9-10]是體內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子,在維持體內(nèi)氧平衡中起著舉足輕重的地位,目前已知ADM基因有多處HIF-1結(jié)合位點,CRLR基因啟動子中亦含有HIF-1結(jié)合位點,HIF-1α是否是紅景天對ADM系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用的上游機制尚不清楚。因此我們通過低氧狀態(tài)下紅景天處理人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)觀察ADM、CRLR及HIF-1α基因的表達情況,并通過siRNA技術(shù)敲低HIF-1α基因探討紅景天作用中ADM及其受體CRLR與HIF-1α之間的關(guān)系。

材 料 和 方 法

細胞培養(yǎng)HUVECs由中科院細胞庫提供。細胞復蘇后貼壁培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中,置于5% CO2、飽和濕度的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代,取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

藥物與藥物配置大花紅景天塊莖購于上海雷允上大藥房。紅景天塊莖粉碎成粉狀,入中藥提取罐加水加熱,提取藥汁、篩網(wǎng)過濾、真空濃縮后入真空干燥箱干燥,干燥后粉碎機粉碎制成紅景天干粉(1 kg紅景天塊莖可制成紅景天干粉211.59 g),以紅景天苷單體為標準品采取高效液相色譜法測定紅景天干粉中紅景天苷單體的含量為0.83% (即每1 g紅景天干粉中含有8.3 mg紅景天苷單體);之后去離子水溶解無菌過濾制成100 μg/mL的紅景天培養(yǎng)母液,再用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液稀釋為紅景天培養(yǎng)液。

儀器與試劑CCK-8試劑盒(日本同仁公司);ADM抗體 、CRLR抗體、HIF-1α抗體和β-actin抗體(美國 R&D SYSTEMS公司);逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒FSQ-101、熒光定量PCR檢測試劑盒QPK-212 (日本TOYOBO公司);HIF-1αsi RNA、陽性對照si RNA、陰性對照si RNA及熒光標記siRNA(上海吉瑪公司)。CO2恒溫培養(yǎng)箱、無氧培養(yǎng)箱(美國THERMO公司)、酶標儀ELX-800(臺灣METERTECH公司)、PCR基因擴增儀5341ep(德國Eppendorf公司)、實時熒光定量PCR儀7500 (美國ABI公司)。

分組及干預(yù)將實驗細胞分為正常氧對照組(NOR)、低氧對照組(HYPO)和低氧紅景天組(HYPO+RHO) 3組。2個對照組使用的對照培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液,低氧紅景天組使用紅景天干粉配制的紅景天培養(yǎng)液;低氧條件為1% O2、5% CO2、94% N2的低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。每組又根據(jù)轉(zhuǎn)染條件不同分為空白對照CON(不加siRNA)組、陰性對照NEG(轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA)組、HIF-1α siRNA(轉(zhuǎn)染HIF-1α siRNA)組。所有細胞實驗均至少重復3次或3個復孔。

CCK8法觀察不同作用時間(24～72 h)和藥物濃度(1～100 μg/mL)下紅景天促細胞增殖情況。酶標儀檢測各孔吸光度(D)值,無紅景天干預(yù)孔為對照組,無細胞僅含檢測液孔為空白組,相對細胞增殖率=(實驗組D值-空白組D值)/(對照組D值-空白組D值)×100%。

Westernblot法干預(yù)處理后的細胞提取總蛋白,樣品蛋白通過BCA法于分光光度計檢測其濃度。每樣品孔上樣50 μg總蛋白進行SDS-PAGE分析,半干法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5% BSA溶液中室溫封閉1 h,分別加入相關(guān)一級抗體4 ℃過夜,TBS/T洗膜3次,加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h,TBS/T洗膜3次,加入顯色液X線膠片曝光,圖片掃描保存為電腦文件,用Image J 分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值數(shù)字化,以β-actin為內(nèi)參,對各組ADM、CRLR、HIF-1α蛋白表達水平進行相關(guān)分析。

Real-timePCR法Trizol法提取總RNA,凝膠管電泳系統(tǒng)檢測RNA的完整性,28S∶18S約為2∶1,條帶明顯。分光光度計測量RNA純度,D260/D280為2.0～2.1。取0.9 μg總RNA在20 μL反應(yīng)體系中逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GeneBank提供的基因序列使用ABI Primer Express 2.0軟件設(shè)計PCR引物(由上海基星生物技術(shù)公司設(shè)計,上海生工生物工程有限公司合成)。引物序列詳見表1。取2.0 μL逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA在20 μL反應(yīng)體系中進行實時PCR擴增,反應(yīng)程序為:95 ℃ 60 s,1個循環(huán),然后95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 45 s。

表1 實時定量PCR引物序列Tab 1 Sequences of PCR primers at real-time quantification

小RNA干擾技術(shù)在NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心)里尋找HIF-1α的mRNA 序列全長,應(yīng)用Silencer TM軟件設(shè)計3對用于沉默HIF-1α基因的siRNA(上海吉瑪公司化學合成),使用熒光標記的siRNA(FAM-siRNA)檢測轉(zhuǎn)染效率、優(yōu)化細胞轉(zhuǎn)染條件,最后確定目標siRNA序列在siRNA、RNAi-Mate比例為3∶1,濃度為60 nmol/L時抑制作用最強,HIF-1αsiRNA目標序列及對照siRNA序列見表2。HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染細胞24 h后進行相關(guān)干預(yù),干預(yù)24 h后收集細胞進行蛋白和基因檢測。

表2 siRNA序列Tab 2 Sequences of siRNA

結(jié) 果

紅景天促進低氧狀態(tài)下HUVECs增殖我們之前的研究發(fā)現(xiàn)紅景天具有一定的促細胞增殖作用,這一作用主要在低氧狀態(tài)下存在,正常氧狀態(tài)實驗條件下未觀察到類似的增殖作用。為了進一步分析紅景天對低氧狀態(tài)下HUVECs增殖的影響,用不同濃度紅景天不同時間處理HUVECs后,CCK8法檢測細胞增殖情況。以各時段的無藥物干預(yù)組為對照組,所得相對細胞增殖率發(fā)現(xiàn),低氧狀態(tài)下一定劑量范圍內(nèi)紅景天有劑量依賴性促內(nèi)皮細胞增殖作用,這一作用在紅景天干預(yù)24 h、紅景天濃度10 μg/mL時最為顯著(表3),并作為最佳干預(yù)條件用于實驗研究。

紅景天促進低氧狀態(tài)下內(nèi)皮細胞ADM及其受體CRLR的表達為分析紅景天低氧狀態(tài)下促細胞增生作用中對內(nèi)皮細胞ADM途徑的影響情況,以10 μg/mL紅景天處理HUVECs 24 h后,實時定量PCR及Western blot分別測定ADM及其受體CRLR mRNA及蛋白表達的情況。低氧狀態(tài)下HUVECs經(jīng)紅景天處理24 h后,ADM及CRLR的mRNA水平明顯增加(圖1B);與低氧對照組相比,ADM及CRLR的蛋白水平也同樣上調(diào)(圖1A),提示紅景天可以上調(diào)低氧狀態(tài)下內(nèi)皮細胞ADM及CRLR的基因表達。

Concentration of Rhodiola rosea24 h48 h72 hNOR 0 μg/mL2.63±0.843.45±0.344.24±0.12HYPO 0 μg/mL1.54±0.272.17±0.332.53±0.05 1 μg/mL2.13±0.17(1)2.52±0.012.77±0.07 5 μg/mL2.53±0.11(1)2.90±0.15(3)2.98±0.15HYPO+RHO 10 μg/mL2.79±0.10(1) (2)2.92±0.75(3)3.35±0.28 50 μg/mL1.24±0.032.59±0.232.79±0.15 100 μg/mL0.77±0.31(1)2.05±0.212.22±0.11

(1)vs. hypoxia control group for 24 h,P<0.05;(2)vs.other RHO groups for 24 h,P<0.05;(3)vs.hypoxia control group for 48 h,P<0.05.

A:Protein expression of ADM&CRLR;B:Relative mRNA expression of ADM & CRLR.vs.hypoxia control group,(1)P<0.05,(2)P<0.01.

圖1紅景天對臍靜脈內(nèi)皮細胞ADM及CRLR基因表達的影響
Fig1TheinfluenceofRhodiolaroseaonADMandCRLRgeneexpressioninHUVECs

紅景天促進低氧狀態(tài)下內(nèi)皮細胞HIF-1α的表達為分析紅景天低氧狀態(tài)下促細胞增殖作用中對內(nèi)皮細胞HIF-1α表達的影響,同樣條件下紅景天干預(yù)后測定HIF-1α mRNA和蛋白質(zhì)水平表達的情況。與低氧對照組比較,紅景天干預(yù)后臍靜脈內(nèi)皮細胞HIF-1α mRNA(圖2B)和蛋白質(zhì)水平(圖2A)均明顯增加,證實紅景天可以上調(diào)低氧狀態(tài)下內(nèi)皮細胞HIF-1α基因的表達。

(1)vs.Hypoxia control group,P<0.05.

圖2紅景天對臍靜脈內(nèi)皮細胞HIF-1α基因表達的影響
Fig2TheinfluenceofRhodiolaroseaonHIF-1αgeneexpressioninHUVECs

HIF-1α介導紅景天的促ADM/CRLR表達作用以上實驗結(jié)果證明紅景天可以促進低氧狀態(tài)下HIF-1α以及ADM及其受體CRLR基因的表達,已知HIF-1α是體內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子,ADM及CRLR基因都含有HIF-1的結(jié)合位點。為驗證紅景天是否通過HIF-1α介導產(chǎn)生促ADM及CRLR表達的作用,我們用HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染HUVECs培養(yǎng)24 h后,實時定量PCR檢測HIF-1α的抑制效率為85%。在此基礎(chǔ)上,我們觀察紅景天干預(yù)后ADM及其受體CRLR基因表達的變化,結(jié)果提示,與空白對照組(CON)及陰性對照siRNA (NEG)對照組比較,轉(zhuǎn)染HIF-1αsiRNA各組內(nèi)皮細胞ADM及其受體CRLR mRNA(圖3)和蛋白(圖4)表達均受到明顯抑制,紅景天組與單純低氧組ADM及CRLR表達無明顯差異,HIF-1α siRNA顯著抑制了紅景天對ADM及CRLR表達的促進作用,提示紅景天的促ADM/CRLR表達作用確實由HIF-1α介導。

(1)vs.Hypoxia control group,P<0.05.

圖3HIF-1αsiRNA處理后各組細胞ADM、CRLR、HIF-1αmRNA的相對表達量
Fig3TheexpressionofADM,CRLRandHIF-1αmRNAinHUVECsafterHIF-1αknockdown

討 論

冠心病是嚴重影響人類健康的一類常見病和多發(fā)病,冠心病的治療手段雖然已經(jīng)有了長足的發(fā)展,但還有一部分患者藥物治療效果欠佳又不適宜進行介入治療或手術(shù)后發(fā)生再狹窄,治療性血管新生[11-12]可能能夠改善這部分患者的預(yù)后。

紅景天是主要生長于高寒低氧地區(qū)的一種藥用植物,具有抗疲勞、抗缺氧、抗輻射、心血管保護等多種藥理作用,我們一直在研究其促血管生長、促內(nèi)皮細胞增殖、抗心肌缺血作用的機制[6-8,13-14]。我們前期的研究觀察到與同等條件低氧狀態(tài)下比較,正常氧狀態(tài)下紅景天無明顯的促細胞增殖作用,以往的研究[15]甚至發(fā)現(xiàn)正常氧狀態(tài)下紅景天具有抑制HUVECs生長的作用。本次研究驗證了一定范圍內(nèi)低氧狀態(tài)下紅景天有劑量依賴性促細胞增殖作用,這些研究結(jié)果提示紅景天的促細胞增殖作用具有一定的低氧特異性,這一過程是否與低氧狀態(tài)下低氧相關(guān)的細胞因子(HIF1α)對促細胞增殖相關(guān)因子(ADM/CRLR)的調(diào)節(jié)有關(guān)？我們針對這一問題進行了進一步研究。

(1)vs.Hypoxia control group,P<0.05.

圖4HIF-1αsiRNA處理后各組細胞ADM、CRLR、HIF-1α的蛋白質(zhì)表達
Fig4TheexpressionofADM,CRLRandHIF-1αproteinsinHUVECsafterHIF-1αknockdown

ADM是1993年由Kitamura等[4,16]從人類嗜鉻細胞瘤組織中提取的一種生物活性肽,屬于降鈣素基因相關(guān)肽家族成員,ADM通過與CRLR聯(lián)合作用發(fā)揮其多種生理效應(yīng),在缺血性心臟病、缺血再灌注損傷等方面進行的多項科學研究顯示,通過ADM治療誘導血管新生可獲益。我們的研究發(fā)現(xiàn)紅景天可以明顯上調(diào)缺血心肌ADM及其受體CRLR的表達,并且這一作用具有靶向性。ADM在體內(nèi)分布廣泛,其中循環(huán)的ADM主要來源于血管內(nèi)皮細胞,我們用紅景天處理低氧狀態(tài)下的HUVECs,發(fā)現(xiàn)ADM及其受體CRLR的mRNA和蛋白表達都明顯升高,說明紅景天可以上調(diào)ADM和CRLR基因的表達,這一作用是否有其共同上游作用機制,其機制是否與低氧誘導因子相關(guān),我們就此進行了進一步研究。

HIF-1是調(diào)節(jié)體內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)的主要轉(zhuǎn)錄因子,其中HIF-1α尤為重要,多種HIF-1的目的基因所編碼的蛋白被確認在血管新生的過程中起到關(guān)鍵的作用。目前的研究表明ADM及其受體CRLR基因啟動子中都含有HIF-1結(jié)合位點(hypoxia response element,HRE),ADM的促血管新生作用可能主要在HIF-1的作用下通過多種信號轉(zhuǎn)導通路實現(xiàn),為了驗證紅景天在低氧狀態(tài)下促ADM/CRLR分泌作用也是HIF-1α介導的,我們用siRNA技術(shù)敲除HIF-1α基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅景天上調(diào)低氧狀態(tài)下內(nèi)皮細胞ADM及CRLR表達的作用被明顯抑制,證實低氧狀態(tài)下紅景天對腎上腺髓質(zhì)素系統(tǒng)的上調(diào)作用是HIF-1α依賴的。這一結(jié)果提示HIF-1可能是紅景天抗缺血缺氧促血管新生作用的核心靶點,其作用表現(xiàn)為上調(diào)HIF-1α基因的表達,進而與包括ADM、CRLR、VEGF等多種促血管新生因子/受體基因啟動子的HRE結(jié)合,上調(diào)ADM、CRLR、VEGF等基因的表達,最終產(chǎn)生抗缺氧促血管新生的作用。

我們的研究證實低氧狀態(tài)下紅景天通過上調(diào)HIF-1α促進HUVECs ADM及其受體CRLR的表達,提示HIF-1可能是紅景天抗缺血缺氧促血管新生作用的核心靶點。HIF是否是低氧狀態(tài)下紅景天作用的唯一靶點,阻斷HIF-1α是否紅景天的促細胞增殖作用完全消失,正常氧狀態(tài)下紅景天無明顯促細胞增殖作用,正常氧狀態(tài)下紅景天對HIF-1α、ADM、CRLR等細胞因子是否不產(chǎn)生影響,這些問題需在進一步的實驗研究中發(fā)現(xiàn)與證實。