張 宏,張 慧

(中國科學(xué)院 生物物理研究所，生物大分子國家重點實驗室，北京 100101)

1 自噬的研究歷史

自噬的發(fā)現(xiàn)最早可以追溯到19世紀(jì)50年代，比利時科學(xué)家汀·德·迪夫(Christian de Duve)通過電子顯微鏡觀察到肝臟細(xì)胞內(nèi)存在一類單層膜或者雙層膜的結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)內(nèi)常常包含有部分細(xì)胞質(zhì)成分以及各種細(xì)胞器[1].隨后托馬斯·阿什福德(Thomas Ashford)和基斯·波特(Keith Porter)注意到在胰高血糖激素(glucagon)的刺激下，在小鼠肝細(xì)胞(hepatocytes)中發(fā)現(xiàn)溶酶體包裹著處于不同降解階段的線粒體[2].這是人們首次發(fā)現(xiàn)溶酶體除了降解內(nèi)吞物外還可以降解胞內(nèi)物質(zhì).1963年，迪夫在溶酶體國際會議上提出了自噬(autophagy)的概念，即“自己吃自己”[3].其后科學(xué)家稱這種雙層膜結(jié)構(gòu)為自噬小體(autophagosome)，其膜結(jié)構(gòu)可能來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，簡稱ER)等細(xì)胞器，這一過程是溶酶體依賴的非選擇性降解細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的過程[4].

20世紀(jì)60年代到90年代初，對自噬的研究主要是借助電鏡在細(xì)胞系和各種組織切片中開展形態(tài)學(xué)上的觀察.這一時期的研究發(fā)現(xiàn)了自噬小體的初始結(jié)構(gòu)隔離膜(isolation membrane)，以及自噬小體與內(nèi)吞體(endosome)融合的中間結(jié)構(gòu)amphisome[5-6].經(jīng)過近30年的研究，自噬過程逐漸明朗，如圖1所示.自噬過程可以被分為一系列的步驟，包括誘導(dǎo)、隔離膜成核、擴(kuò)展和閉合、自噬小體與內(nèi)吞體及溶酶體融合、自噬溶酶體降解以及最后的大分子物質(zhì)的循環(huán)再利用.然而，對自噬的早期研究并沒有真正揭示自噬過程的分子機(jī)制，科研人員利用大量生化手段雖然尋找到了多個自噬活性的調(diào)控因子，但一直沒有鑒定出參與自噬過程的關(guān)鍵因子.

圖1 細(xì)胞自噬的過程

2 酵母模型的建立

自噬過程發(fā)現(xiàn)后的30年中，因缺乏合理的研究體系，人們對自噬分子機(jī)制的了解幾乎停滯.1992年，日本科學(xué)家大隅良典(Yoshinori Ohsumi)實驗室[7]在單細(xì)胞釀酒酵母中觀察到自噬的現(xiàn)象.酵母內(nèi)有一個巨大液泡，類似于動物細(xì)胞中的溶酶體.大隅良典通過光學(xué)顯微鏡觀察到在蛋白酶缺陷酵母中，在氮源缺失的情況下，液泡內(nèi)會積累大量的自噬小泡結(jié)構(gòu)(autophagic bodies).這些小泡是在胞質(zhì)中形成的雙層膜自噬小體與液泡融合后釋放在液泡里的自噬小體內(nèi)膜及包裹物.在正常酵母中，液泡里的蛋白酶能非?？斓亟到膺@一結(jié)構(gòu)，所以觀察不到自噬小泡這一中間結(jié)構(gòu).大隅良典的這一發(fā)現(xiàn)建立了酵母為研究細(xì)胞自噬的遺傳篩選模型.他們推測如果參與自噬小體形成的自噬基因缺失，自噬過程將會被阻止，饑餓誘導(dǎo)形成的自噬小體就可能被抑制，因此液泡中便不會有自噬小泡的累積.于是，他們饑餓(氮源缺失)處理蛋白酶缺失的酵母，誘導(dǎo)自噬發(fā)生，篩選那些在液泡中不累積自噬小泡的突變體.通過遺傳篩選，他們得到了第一個酵母自噬基因，命名為apg1(之后被命名為ATG1)[8].ATG1突變體在饑餓條件下存活率顯著降低，表明自噬對酵母存活是必需的.隨后他們首先篩選那些饑餓處理后存活率降低的突變體，然后再鑒定液泡內(nèi)無自噬小泡聚集的突變體.通過篩選他們鑒定出了包括ATG1在內(nèi)的15個ATG相關(guān)的基因[8].

在同一時期，美國科學(xué)家丹尼爾(Daniel Klionsky)教授研究發(fā)現(xiàn)酵母液泡蛋白酶Ape1的前體蛋白(proAPI)由胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到液泡的通路(cytoplasm to vacuole targeting, 簡稱Cvt)并不需要參與經(jīng)典的分泌途徑的基因，他們通過遺傳篩選鑒定了一系列Ape1前體運輸缺陷的突變體，命名為Cvt突變體[9].隨后，大隅良典教授發(fā)現(xiàn)酵母的Cvt通路與自噬過程基本一樣，Ape1的前體是通過一種類似自噬過程的雙層膜的轉(zhuǎn)運膜泡(cytoplasm to vacuole targeting vesicle, 簡稱Cvt vesicle)包裹由胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到液泡內(nèi)[10].不同之處是Cvt小泡比自噬小體要小，進(jìn)一步研究揭示這些CVT基因與大隅良典實驗室發(fā)現(xiàn)的自噬基因部分相同.2003年人們將參與自噬通路的基因統(tǒng)一命名為ATG基因(autophagy-related genes)[11].以往人們一直認(rèn)為自噬是隨機(jī)的包裹一些胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行降解，Cvt通路中水解酶前體運輸過程提示自噬也可選擇性地運送底物.后來發(fā)現(xiàn)自噬可以選擇性地包裹一些受損傷的細(xì)胞器或蛋白聚集體進(jìn)行降解.

通過上述兩個相互獨立的酵母遺傳篩選共發(fā)現(xiàn)了大約20個自噬相關(guān)基因，介導(dǎo)自噬小體形成的不同步驟，它們作用于自噬小體的起始、延伸、閉合，以及與液泡融合等不同階段，構(gòu)成了自噬通路的核心組分[5-6].Atg1-Atg13-Atg17復(fù)合體參與自噬小體形成的早期階段；磷脂酰肌醇3-激酶復(fù)合體(PI3K)結(jié)合調(diào)控自噬小體的形成；跨膜蛋白Atg9穿梭于自噬起始位點和自噬小體間為自噬小體的形成提供膜來源；Atg12-Atg5和Atg8-PE兩個類泛素的結(jié)合系統(tǒng)在自噬小體膜的延伸過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用.Atg8和Atg12是兩個類泛素蛋白，能夠被類泛素化的分子共軛系統(tǒng)分別與磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, 簡稱PE)和Atg5蛋白連接.Atg8的前體分子被半胱氨酸蛋白酶Atg4剪切后，被類泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme, 簡稱E1)Atg7激活，隨后被轉(zhuǎn)移到類泛素轉(zhuǎn)移酶(ubiquitin- conjugation protein, 簡稱E2)Atg3上，并最終被連接到PE上.Atg8-PE在自噬小體的外膜和內(nèi)膜上都有定位，因此Atg8-PE被廣泛用作自噬小體的標(biāo)記分子.在Atg12系統(tǒng)中，Atg12在類E1激活酶Atg7和E2轉(zhuǎn)移酶Atg10的作用下，與Atg5共價連接.Atg12-Atg5偶聯(lián)后與Atg16相互作用，在Atg16的聚合作用下，形成雙倍的Atg12-Atg5-Atg16復(fù)合體.該復(fù)合體在Atg8與PE的共軛連接中表現(xiàn)出泛素連接酶E3的活性.至此細(xì)胞自噬的核心機(jī)制逐步展現(xiàn)出來，鑒于大隅良典先生在細(xì)胞自噬分子機(jī)制方面做出的杰出貢獻(xiàn)，2016年被授予諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎.

3 多細(xì)胞生物的自噬過程

隨著人們在多種生物體，如擬南芥、果蠅、線蟲、小鼠及哺乳動物細(xì)胞系中對自噬的廣泛研究，發(fā)現(xiàn)自噬過程具有保守性.多細(xì)胞生物的自噬小體的形成與單細(xì)胞酵母的自噬過程相似，都起始于隔離膜的誘導(dǎo)、延伸、閉合，然后自噬小體與溶酶體融合降解底物，最后大分子物質(zhì)循環(huán)利用.酵母中的研究工作極大地推動了高等動物細(xì)胞中自噬作用的研究進(jìn)程.盡管如此，哺乳動物細(xì)胞中的自噬作用比酵母中的自噬作用要復(fù)雜得多.首先，在酵母中，所有的自噬小體起始于液泡附近的單一位點.這一位點被稱為前自噬小體結(jié)構(gòu)(pre-autophagosomal structure, 簡稱PAS).而在哺乳動物細(xì)胞中，隔離膜可以在胞質(zhì)內(nèi)的多個位點同時發(fā)生[12-13].研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物細(xì)胞中，自噬小體起源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上PI3P富集的區(qū)域，并形成形似希臘字母Ω的膜結(jié)構(gòu)，稱為歐米茄小體(omegasome)[14].歐米茄小體可以為Atg蛋白的招募、膜結(jié)構(gòu)的擴(kuò)張以及自噬小體的形成提供平臺.然后，隔離膜結(jié)構(gòu)不斷延伸，包裹著需要被降解的胞內(nèi)物質(zhì)，最終閉合形成一個雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體.多細(xì)胞生物與酵母的自噬過程另一個明顯區(qū)別是：在酵母細(xì)胞中，自噬小體直接與液泡融合降解底物；在高等生物細(xì)胞中，自噬小體在與溶酶體融合前，還需要經(jīng)歷一系列的成熟酸化過程.新產(chǎn)生的自噬小體會與一些內(nèi)吞途徑中的成分融合，例如早期內(nèi)吞體(endosomes)和多泡小體(multivesicular bodies, 簡稱MVBs)等，從而產(chǎn)生一個混合的結(jié)構(gòu).這種混合結(jié)構(gòu)被稱為中間囊泡(amphisome)，較自噬小體更偏酸性.中間囊泡再與溶酶體融合，從而產(chǎn)生具有降解能力的自噬溶酶體[15].

多細(xì)胞生物不僅自噬過程高度保守，自噬的分子機(jī)制在進(jìn)化上也高度保守.自1997年發(fā)現(xiàn)第一個自噬基因ATG1以來，共發(fā)現(xiàn)了大約18個保守的ATG基因構(gòu)成了細(xì)胞自噬的核心分子機(jī)制，對自噬小體的形成是必需的(表1).這些基因在擬南芥、果蠅、線蟲、小鼠及人中高度保守.多細(xì)胞生物自噬過程比酵母中的更復(fù)雜，且擁有不同細(xì)胞類型，除了擁有高度保守的Atg蛋白外，應(yīng)該有更多的因子參與或者有更為復(fù)雜的分子間互作.其中一種表現(xiàn)方式是同一個酵母Atg蛋白在多細(xì)胞生物中會進(jìn)化出多個同源物，這些同源物也會表現(xiàn)出功能上的冗余和分化.例如線蟲中有兩個ATG8的同源基因，lgg-1 和lgg-2，在不同的發(fā)育時期不同的自噬階段發(fā)揮不同的功能[16]；在哺乳動物細(xì)胞中至少存在著6個酵母ATG8蛋白的同源物，它們都屬于LC3 和 GABARAP/GATE-16家族蛋白[17].

由于多細(xì)胞生物的自噬過程比單細(xì)胞酵母復(fù)雜得多，人們有理由相信，多細(xì)胞生物自噬小體的形成與成熟過程中，以及不同的組織細(xì)胞中，還存在著眾多未知的重要參與基因.盡管已有廣泛的生物化學(xué)分析方法被應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)參與多細(xì)胞生物自噬作用的因子，但是這些生化方法鑒定出來的大多是一些自噬活性的調(diào)控因子，而非參與自噬過程所必需的新基因.科學(xué)家急需尋找到一個適用于遺傳篩選的多細(xì)胞生物模型來開展自噬新基因的篩選.

表1 酵母ATG蛋白在線蟲和哺乳動物細(xì)胞中的同源物

4 線蟲自噬模型的建立

自1965年Sydney Brenner開始利用線蟲進(jìn)行發(fā)育生物學(xué)的研究以來，秀麗線蟲憑借自身的許多特點，在眾多生物學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用.秀麗線蟲作為一個僅有959個體細(xì)胞的生物體，它的成蟲體長僅1 mm，身體為半透明，以大腸桿菌為食物，它的生殖周期短(僅3 d)，后代數(shù)量多(約300個)，易于在實驗室條件下培養(yǎng).此外，線蟲還便于進(jìn)行多種遺傳操作.線蟲有2個性別分為雌雄同體和雄性.雌雄同體既能夠進(jìn)行自體受精，也可以利用外源精子繁殖后代.這一特點為研究者對秀麗線蟲進(jìn)行經(jīng)典遺傳學(xué)分析提供了極大的便利.目前，科研工作者利用線蟲在多個領(lǐng)域取得了重大突破，如細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制、RNA干擾(RNA interference, 簡稱RNAi)現(xiàn)象的揭示、微RNA(microRNA, 簡稱miRNA)的發(fā)現(xiàn)、衰老等.

線蟲胚胎早期發(fā)育過程中，一系列不對稱分裂將生殖細(xì)胞與體細(xì)胞分離.比如受精卵第一次分裂成2個細(xì)胞AB及P1，AB只分裂形成體細(xì)胞，而P1是生殖母細(xì)胞(germ blastomere).P1進(jìn)行不對稱分裂形成體細(xì)胞EMS及P2生殖母細(xì)胞.隨后P2分裂成P3、P4生殖母細(xì)胞.P4進(jìn)行對稱分裂給出Z2、Z3兩個生殖前體細(xì)胞.Z2及Z3在胚胎期不再分裂，孵化后分裂形成上千個生殖細(xì)胞.20世紀(jì)80年代，科學(xué)家觀察到存在于卵細(xì)胞中叫作P顆粒的蛋白/RNA聚合體，在胚胎分裂中只在生殖細(xì)胞中，如P1到P4生殖母細(xì)胞和Z2、Z3生殖前體細(xì)胞中，而在體細(xì)胞中不存在.幼蟲期P顆粒在生殖細(xì)胞中合成，但不存在于精子中.胚胎發(fā)育中P顆粒的這種不對稱分布機(jī)制困擾了發(fā)育生物學(xué)家多年.張宏實驗室利用標(biāo)記了綠色熒光蛋白的P 顆粒組成性成分之一的PGL-1報告蛋白篩選到P顆粒在體細(xì)胞中異常存在的突變體，驚奇地發(fā)現(xiàn)自噬基因的突變會引起P顆粒的一些成分包括PGL-1和PGL-3在體細(xì)胞中累積，這些聚集體命名為PGL顆粒(圖2)[18].野生型線蟲胚胎細(xì)胞中PGL-1和PGL-3僅在生殖細(xì)胞中分布，而在自噬基因lgg-1突變體的胚胎細(xì)胞的體細(xì)胞中PGL顆粒大量累積[18].進(jìn)一步分析表明P顆粒隨著卵母細(xì)胞的分裂也被分配到體細(xì)胞中，但位于體細(xì)胞中的P顆粒成分PGL-1和PGL-3會被自噬通路降解.這一突破性結(jié)果不僅闡明了P顆粒在生殖細(xì)胞中特異分布的一種機(jī)制，而且揭示自噬可以選擇性降解發(fā)育過程中的蛋白聚集體[18].

圖2 P顆粒組分PGL-1在線蟲胚胎中的分布圖

5 線蟲自噬的研究及自噬的生理意義

5.1 選擇性自噬

利用自噬降解PGL顆粒的現(xiàn)象，張宏實驗室創(chuàng)立了可用于遺傳篩選的多細(xì)胞生物自噬研究模型.通過大規(guī)模篩選，得到了多個多細(xì)胞生物特有的自噬基因，分別命名為epg-1-11(ectopic PGL granules, 簡稱epg)[19-25].這是繼20世紀(jì)90年代酵母遺傳篩選尋找自噬基因后首次發(fā)現(xiàn)的新的自噬基因，這些新基因的鑒定極大地豐富了人們對多細(xì)胞生物自噬過程的理解.自噬降解P顆粒成分證明了自噬可以選擇性地降解底物，但自噬如何選擇性包裹底物的機(jī)制仍不清楚.研究人員進(jìn)一步深入研究篩選到的自噬新基因，發(fā)現(xiàn)了多個epg基因在選擇性識別和降解蛋白聚集體中發(fā)揮重要功能.先前研究表明一類受體蛋白可以同時結(jié)合底物以及位于自噬小體內(nèi)膜的Atg8從而介導(dǎo)底物的識別[26].進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在選擇性自噬中還需要一類受體支架蛋白.比如EPG-7作為受體支架蛋白，特異性地介導(dǎo)了包括SQST-1(線蟲中自噬底物p62的同源蛋白)在內(nèi)的多種蛋白聚集體的降解.EPG-7可以同時結(jié)合降解的底物和多種介導(dǎo)自噬小體形成的ATG蛋白，從而促進(jìn)包裹底物的自噬小體的形成.支架受體蛋白EPG-7不僅賦予了底物降解的特異性，同時也將底物與自噬機(jī)器連接起來，提高了降解的效率[24].此外，工作人員還發(fā)現(xiàn)翻譯后修飾在蛋白聚集體的降解過程中發(fā)揮著重要的作用.比如線蟲精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶PRMT-1的同源基因epg-11功能缺失，導(dǎo)致體細(xì)胞中PGL顆粒降解缺陷[25].PGL顆粒降解需要與支架蛋白EPG-2直接結(jié)合.EPG-11可以對PGL-1和PGL-3的RGG結(jié)構(gòu)域的精氨酸進(jìn)行甲基化修飾，epg-11基因活性的缺失減弱了PGL顆粒與EPG-2的相互作用，進(jìn)而減弱了PGL顆粒與LGG-1/ATG8的結(jié)合，從而降低了PGL顆粒的降解效率[25].這些研究揭示了選擇性自噬的分子機(jī)制，并對闡明多種疾病中蛋白聚集體異常累積的機(jī)制有重要意義.

5.2 自噬小體形成與成熟

多細(xì)胞生物自噬小體的形成與成熟過程與內(nèi)膜系統(tǒng)緊密聯(lián)系.從自噬誘導(dǎo)之初的隔離膜形成到自噬小體延伸的膜來源，以及自噬小體閉合后與一系列內(nèi)吞體和溶酶體的膜融合過程都與內(nèi)膜系統(tǒng)息息相關(guān).內(nèi)膜系統(tǒng)尤其是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)如何參與到自噬過程的各個階段仍不清楚.電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)隔離膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)間存在著廣泛的相互作用，但是這種相互作用的形成、維持以及解離的分子機(jī)制尚不清楚.

研究發(fā)現(xiàn)線蟲中鑒定的多細(xì)胞生物特有自噬因子EPG-3(哺乳動物中同源蛋白為VMP1)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，參與調(diào)控隔離膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的相互作用[27].VMP1缺失會導(dǎo)致隔離膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)定結(jié)合，從而阻斷自噬小體的正常形成.除了調(diào)控隔離膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)互作外，VMP1還可以廣泛調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與其他細(xì)胞器，如脂滴、線粒體和胞內(nèi)吞體的相互作用[27].另外廣泛介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與其他細(xì)胞器互作的ER蛋白VAPA/B也參與隔離膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的互作[28].自噬被誘導(dǎo)后，VAPA/B通過與在自噬早期發(fā)揮功能的Atg1/ULK1蛋白復(fù)合體的成分FIP200結(jié)合被招募到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的自噬起始?xì)W米茄小體.VAPA/B能夠維持FIP200/ULK1復(fù)合體的穩(wěn)定性，也與WIPI2蛋白互作，促進(jìn)ER-IM 的相互作用.這些工作揭示了ER膜蛋白VMP1和VAPA/B調(diào)節(jié)自噬小體與ER互作的機(jī)制(圖3).

圖3 ER膜蛋白VMP1和VAPs調(diào)節(jié)自噬小體與ER互作的模式圖

高等生物細(xì)胞自噬通路中，自噬小體的成熟過程包括與晚期內(nèi)吞體的融合.線蟲中鑒定的自噬基因EPG5參與調(diào)控自噬小體與晚期內(nèi)吞體/溶酶體之間的特異融合[29].EPG5可以與Rab7及晚期內(nèi)吞體/溶酶體上的R-SNARE蛋白VAMP7/8直接作用，同時也可以與預(yù)組裝的Qabc-SNARE復(fù)合物STX17-SNAP29結(jié)合.EPG5通過結(jié)合自噬蛋白LC3/LGG-1(人類和線蟲中Atg8的同源蛋白)來識別自噬小體，并促使SNARE復(fù)合物STX17-SNAP29-VAMP7/8的組裝，從而促進(jìn)自噬小體與晚期內(nèi)吞體/溶酶體的融合(圖4).EPG5缺失引起自噬小體與多種膜泡結(jié)構(gòu)的錯誤融合, 從而形成降解功能缺陷的自噬溶酶體.

圖4 EPG5調(diào)控自噬小體的成熟

5.3 自噬與神經(jīng)退行性疾病

細(xì)胞自噬的功能主要有兩個方面：一是在脅迫環(huán)境下，自噬可以將一部分胞質(zhì)降解成氨基酸等，為細(xì)胞存活提供能量和物質(zhì)，這是細(xì)胞的一種自我存活機(jī)制；另外一方面，自噬可以清除變性或錯誤折疊的蛋白質(zhì)、衰老或損傷的細(xì)胞器等，進(jìn)而維持細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài).迄今為止，人們對自噬過程的生理功能的了解還很有限.有研究發(fā)現(xiàn)，自噬異常與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[30].神經(jīng)退行性疾病主要是由神經(jīng)元喪失所導(dǎo)致的運動失調(diào)、學(xué)習(xí)認(rèn)識障礙等.由于神經(jīng)元是不可再生的，無法通過細(xì)胞分裂去除受損的細(xì)胞，所以通過自噬途徑及時清除胞內(nèi)有害物質(zhì)就顯得十分重要.在許多神經(jīng)退行性疾病的受損神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)了自噬小體/自噬溶酶體聚集，如阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease, 簡稱AD)、帕金森病(Parkinson’s disease, 簡稱PD)、亨廷頓舞蹈病(Huntington disease, 簡稱HD)、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis, 簡稱ALS)等病中都發(fā)現(xiàn)了自噬溶酶體聚集，但這些自噬溶酶體的降解功能是缺損的.對自噬的研究將對這些疾病的診斷和治療提供有利的幫助，參與調(diào)控自噬過程的蛋白將可能作為重要的藥物靶點.

科學(xué)家構(gòu)建了自噬基因敲除小鼠來研究自噬在神經(jīng)細(xì)胞中的功能.參與自噬小體形成早期的基因Atg5和Atg7敲除小鼠呈現(xiàn)出廣泛神經(jīng)退行性病變，大量神經(jīng)細(xì)胞無選擇性地死亡，但未表現(xiàn)出人類神經(jīng)退行性疾病的選擇性神經(jīng)元丟失這一特征[31-32].近年來，張宏實驗室構(gòu)建了Epg5及Wdr45/Wipi4(epg-6在哺乳動物中的同源基因)缺失的小鼠來研究自噬與神經(jīng)退行性疾病的關(guān)系.Epg5敲除小鼠呈現(xiàn)出進(jìn)行性神經(jīng)功能缺陷的表型，隨著小鼠年齡的增加，雙后肢肌肉萎縮無力，到后期發(fā)展成雙后肢完全癱瘓[33].Epg5敲除小鼠大腦皮層第五層的和脊髓前角的大椎體細(xì)胞選擇性地缺失.Epg5基因敲除小鼠由于自噬異常，自噬底物p62在大腦和脊髓中的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)異常聚集.中樞神經(jīng)系統(tǒng)中累積了大量異常的自噬體結(jié)構(gòu).Epg5基因敲除小鼠表現(xiàn)出選擇性運動神經(jīng)元丟失，進(jìn)行性肌無力和肌肉萎縮，呈現(xiàn)出肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)的主要特征.人類遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)人類EPG5基因的隱性突變會引起一種叫Vici syndrome的多系統(tǒng)紊亂綜合癥[34]，Epg5基因敲除小鼠表現(xiàn)出了Vici綜合癥癥狀的一些表型，Epg5在自噬通路中分子機(jī)制的研究對闡明Vici綜合癥的發(fā)病過程有重要作用.

近期人類遺傳學(xué)表明WDR45/EPG6突變會導(dǎo)致大腦認(rèn)知功能的缺陷，引發(fā)兒童期靜態(tài)性腦病伴成年期神經(jīng)退行性疾病(static encephalopathy of childhood with neurodegeneration in adulthood, 簡稱SENDA)[35].SENDA是伴隨鐵聚積的神經(jīng)退行性疾病(neurodegeneration with brain iron accumulation, 簡稱NBIA)的一種亞型.SENDA的臨床特征為患者幼年時期出現(xiàn)靜態(tài)性腦病，成年后突發(fā)肌張力障礙-帕金森氏癥及癡呆.SENDA患者樣品檢測顯示自噬活性明顯降低，早期異常自噬結(jié)構(gòu)累積，提示W(wǎng)DR45通過影響細(xì)胞自噬調(diào)控神經(jīng)穩(wěn)態(tài)[35].神經(jīng)系統(tǒng)特異性Wdr45敲除小鼠(Nes-Wdr45fl/Y)會出現(xiàn)運動協(xié)調(diào)性降低，并且學(xué)習(xí)記憶功能嚴(yán)重受損[36].組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Wdr45敲除小鼠腦內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重軸突水腫，并伴有大量嗜酸性小體累積.Wdr45敲除小鼠中自噬通路受到抑制，在神經(jīng)元和腫脹的軸突中自噬底物p62明顯累積.因此Wdr45敲除小鼠出現(xiàn)與SENDA患者類似的表型，包括認(rèn)知障礙和軸突穩(wěn)態(tài)失衡.這一結(jié)果有助于人們進(jìn)一步了解SENDA的發(fā)病機(jī)制，并為深入研究自噬在維持軸突穩(wěn)態(tài)中的作用提供了線索.綜上，小鼠疾病模型的建立有助于人們了解相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制，對理解疾病的發(fā)病過程以及開展藥物篩選有重要的意義.

6 結(jié)束語

細(xì)胞自噬是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)平衡的重要機(jī)制.經(jīng)過對細(xì)胞自噬半個世紀(jì)之久的研究，人們對單細(xì)胞酵母的自噬機(jī)制有了較為深入的了解，但是對更加復(fù)雜的高等生物的自噬過程卻知之甚少，尤其是自噬與人類相關(guān)疾病的研究更是鮮有突破.在自噬分子機(jī)制和調(diào)控機(jī)理的研究中仍然有很多問題和挑戰(zhàn)，例如:自噬小體起始成核及自噬小體膜擴(kuò)張過程的膜來源于何處；高等動物中不同種類的細(xì)胞、組織和器官中自噬過程有何異同；生物體的發(fā)育過程中如何感知不同的內(nèi)外部信號來調(diào)控自噬的活性.科學(xué)家們正在努力開展這些領(lǐng)域的研究，揭示高等生物自噬過程的分子機(jī)制，闡明細(xì)胞自噬的生理功能以及其在疾病中的作用機(jī)制.這些研究將為人類相關(guān)疾病的診療提供理論依據(jù).