齊寶坤，趙城彬，江連洲，徐 靚，李 紅，李 楊,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118）

表面疏水性是用來表征蛋白質(zhì)分子表面疏水基團與蛋白質(zhì)外部極性溶液環(huán)境結合數(shù)目的一個指標，也是衡量分子間相互作用強弱的重要參數(shù)，對于蛋白質(zhì)其他功能特性具有重要影響[1]。蛋白質(zhì)表面疏水性也會受到一些因素的影響，如蛋白質(zhì)自身的理化性質(zhì)、空間結構、蛋白質(zhì)生產(chǎn)加工條件等[2]。大豆11S球蛋白是一種具有不均勻性的寡聚蛋白，由酸性多肽鏈（A亞基，分子質(zhì)量350～370 kDa）和堿性多肽鏈（B亞基，分子質(zhì)量約20 kDa）構成[3]。由于11S球蛋白具有緊密的分子結構，多數(shù)活性基團被包裹在球狀結構的內(nèi)部，這是限制大豆蛋白在食品中應用的關鍵因素[4]。近年來，熱處理對大豆蛋白功能特性的影響一直是大豆蛋白研究領域的熱點之一。熱處理溫度和時間等因素對蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)及分子結構具有重要影響，可以通過調(diào)整熱處理條件控制蛋白質(zhì)的聚集程度，從而控制蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)[5]。拉曼光譜作為一種新技術，廣泛應用于蛋白質(zhì)空間結構的研究中，它可以通過鑒別蛋白質(zhì)結構特征峰的變化，得到蛋白質(zhì)分子多肽鏈骨架構型改變的信息和分子側鏈微環(huán)境變化的信息[6]。目前，已有不少研究以大豆11S球蛋白為對象，探討熱處理過程中蛋白質(zhì)的結構變化及聚集行為。Marcone等[7]利用傅里葉變換紅外光譜法研究熱處理對大豆11S球蛋白結構的影響，指出酰胺I帶1 635 cm-1處紅外光譜峰強度的增加，表明大豆11S球蛋白在熱聚集過程中分子間維持β-折疊的氫鍵加強。Mill等[8]利用核磁共振光譜研究熱處理過程中大豆11S球蛋白二級結構的變化，表明當加熱溫度升高至95 ℃時，大豆11S球蛋白富含谷氨酰胺和谷氨酸殘基的高可變區(qū)中具有氫鍵結構的α-螺旋結構消失。

本研究設計了3 個溫度梯度（80、90、100 ℃）對大豆11S球蛋白進行熱處理0～90 min，對大豆11S球蛋白表面疏水性進行測定，同時采用拉曼光譜分析蛋白質(zhì)的分子結構，探究熱處理對大豆11S球蛋白表面疏水性和分子結構的影響規(guī)律，為改善大豆11S球蛋白表面性質(zhì)及擴寬其應用范圍提供實驗支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆（東農(nóng)46） 東北農(nóng)業(yè)大學大豆研究所；Lowry法蛋白質(zhì)含量測定試劑盒 上海荔達生物科技有限公司；牛血清白蛋白、8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalene-sulfonate，ANS） 美國Sigma公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；低溫高速離心機 美國Beckman公司；FD 5-3型冷凍干燥機 美國SIM公司；AKTA-蛋白質(zhì)純化儀美國GE公司；F-4500熒光分光光度計 日本Hitachi公司；Raman Station 400拉曼光譜儀 美國PE公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆11S球蛋白的制備

大豆11S球蛋白的制備根據(jù)Nagano等[9]的方法。

大豆→脫皮→粉碎→過60 目篩→正己烷脫脂→脫脂大豆粉→與水混合（料液比1∶15（g/mL））→調(diào)節(jié)pH 7.5→提取2 h→離心分離（10 000×g，15 min）→取上清液→添加亞硫酸鈉（0.98 g/L）→提取1 h→調(diào)節(jié)pH 6.4→4 ℃過夜→離心分離（12 000×g，20 min）→沉淀→凍干→大豆11S球蛋白粗提物

應用AKTA-蛋白質(zhì)純化儀和HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade凝膠制備級預裝柱，對大豆11S球蛋白粗提物進行純化，并進一步采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析蛋白質(zhì)組成，通過光密度掃描測得大豆11S球蛋白純度約為92%。

1.3.2 大豆11S球蛋白的熱處理

將一定量的純化大豆11S球蛋白溶于50 mL、0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液中，配制成質(zhì)量分數(shù)為2%的蛋白溶液，蛋白質(zhì)濃度采用Lowry法測定，參比蛋白為牛血清白蛋白。將蛋白溶液分別密封于加熱套管中在溫控水浴鍋中分別進行80、90、100 ℃的熱處理，熱處理時間分別為10、20、30、45、60、90 min。

1.3.3 表面疏水性的測定

采用ANS熒光探針法測定蛋白質(zhì)表面疏水性[10]。將大豆11S球蛋白樣品溶于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液中配成10 mg/mL的蛋白溶液，室溫條件攪拌1 h后10 000×g離心30 min，上清液用相同的磷酸鹽緩沖液稀釋至0.07～0.67 mg/mL（采用Lowry法測定蛋白濃度）。分別取不同濃度的樣品溶液4 mL，加入8 mmol/L的ANS溶液40 μL，充分振蕩混勻后靜置3 min，測定樣品的熒光強度。激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射波長為470 nm，夾縫寬均為5 nm。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標作圖，曲線初始斜率即為蛋白質(zhì)的表面疏水性（H0）。

1.3.4 拉曼光譜的測定

參考張萍等[11]的測定方法，將大豆11S球蛋白用緩沖溶液配制成質(zhì)量濃度為100 mg/mL的溶液進行測定。激發(fā)光波長設定為785 nm，激光功率為300 mW，掃描范圍400～2 000 cm-1，每次掃描時間60 s，積分10 次，4 次掃描進行累加。拉曼圖譜處理：譜圖基線校正、譜峰查找采用ACD Labs V12軟件，以苯丙氨酸（（1 003±1）cm-1）作為歸一化因子，以此作為各拉曼峰強度變化的依據(jù)，得到不同條件下大豆11S球蛋白的拉曼光譜，采用Raman Spectral Analysis Package Version 2.1軟件計算大豆11S球蛋白各結構的百分含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個樣品重復3 次實驗，ANOVA差異顯著性分析利用SPSS V17.0軟件完成，P＜0.05為顯著性差異，采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 熱處理對大豆11S球蛋白表面疏水性的影響

如圖1所示，與未經(jīng)熱處理的大豆11S球蛋白相比，不同條件熱處理后11S球蛋白的H0發(fā)生了明顯改變。在80 ℃熱處理條件下，隨著熱處理時間的延長，大豆11S球蛋白的H0逐漸增加；在90 ℃熱處理條件下，H0在0～30 min內(nèi)隨著處理時間的延長而增加，之后又逐漸降低；在100 ℃熱處理條件下，H0在20 min內(nèi)迅速增加，之后又出現(xiàn)降低。在90 ℃和100 ℃熱處理條件下，H0具有相似的變化趨勢。然而，100 ℃熱處理比90 ℃熱處理下H0變化的更快，且變化程度更大。這與Petruccelli等[12]的研究結果相似，證實熱處理溫度和時間均會影響蛋白質(zhì)的表面疏水性。

圖1 熱處理對大豆11S球蛋白表面疏水性（H0）的影響Fig. 1 Effect of heat treatment on surface hydrophobicity (H0) of 11S glycinin

大豆11S球蛋白H0的變化與蛋白質(zhì)變性和熱聚集體的形成有關，H0的變化可能是由于熱處理改變了蛋白質(zhì)的分子結構以及ANS熒光探針結合位點暴露導致的[13]。熱處理會改變大豆11S球蛋白分子的空間結構，誘導蛋白分子解折疊展開，使得包埋于球蛋白分子內(nèi)部的疏水基團外露，ANS熒光探針結合位點增加，從而導致蛋白質(zhì)H0增加。另外，熱變性過程中所發(fā)生的蛋白質(zhì)亞基解離及多肽鏈的裂解也是造成H0升高的可能因素[14]。當加熱溫度接近大豆11S球蛋白變性溫度和熱處理時間達到一定值時，蛋白分子已經(jīng)基本上達到最大化的伸展，H0達到最大值。當溫度繼續(xù)升高或處理時間繼續(xù)延長時，蛋白質(zhì)分子吸收熱能運動加劇，分子間的接觸和交聯(lián)機會增加，使伸展的亞基和肽鏈互相靠近，通過疏水相互作用結合成為可溶聚集體[15]，使疏水基團重新包裹在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，從而導致H0略有降低。綜上所述，熱處理過程中發(fā)生的蛋白質(zhì)分子展開、亞基解離是造成H0升高的可能因素，而亞基重新聚合形成不溶性或可溶性熱聚集體又會導致H0下降。

2.2 熱處理大豆11S球蛋白拉曼光譜分析

拉曼光譜中峰位置及強度的變化主要用于分析蛋白質(zhì)二級結構及疏水微環(huán)境?？梢愿鶕?jù)蛋白質(zhì)分子結構所指認特征吸收峰的相對強度，即指認吸收峰強度與苯丙氨酸吸收峰強度的比值表示蛋白分子結構變化的定量信息[16]。由圖2可以看出，大豆11S球蛋白經(jīng)熱處理后苯丙氨酸的吸收峰增強，且C—H鍵彎曲振動的吸收強度也增加。熱處理10 min時吸收峰最強，隨著熱處理時間的延長，這兩處的吸收峰稍有減弱，但是仍強于未經(jīng)熱處理的11S球蛋白。然而，熱處理使大豆11S球蛋白拉曼光譜變化最顯著的為酰胺I帶處吸收峰增強，這與蛋白質(zhì)主鏈構象變化有關。大豆11S球蛋白的主鏈構象主要由拉曼光譜酰胺I帶（1 630～1 690 cm-1）的特征峰確定，酰胺I帶主要為多肽鏈中C＝O的伸縮振動，但N—H振動、C—C—N振動和C—N伸縮振動也會引起酰胺I帶的微弱變化[17]。酰胺I帶拉曼特征峰的結構歸屬普遍認為：α-螺旋結構為1 645～1 658 cm-1；β-折疊結構為1 665～1 680 cm-1；β-轉角結構為1 640～1 644 cm-1和1 681～1 690 cm-1；無規(guī)卷曲結構為1 659～1 664 cm-1[18]。

圖2 不同熱處理條件下大豆11S球蛋白的拉曼光譜圖Fig. 2 Raman spectra of 11S glycinin under different heat treatment conditions

2.2.1 主鏈構象（二級結構）分析

圖3 熱處理對大豆11S球蛋白二級結構含量的影響Fig. 3 Effect of heat treatment on secondary structure contents of 11S glycinin

利用Raman Spectral Analysis Package Version 2.1軟件分析計算不同熱處理條件下大豆11S球蛋白各二級結構含量。由圖3A可以看出，在80 ℃熱處理下，大豆11S球蛋白分子中α-螺旋結構相對含量隨熱處理時間的延長逐漸降低，β-轉角和無規(guī)卷曲結構相對含量隨熱處理時間的延長逐漸升高，β-折疊結構相對含量沒有發(fā)生明顯改變，這表明大豆11S球蛋白二級結構中α-螺旋結構轉變?yōu)棣?轉角和無規(guī)卷曲結構。由圖3B和圖3C可以看出，在90 ℃和100 ℃熱處理下，隨著熱處理時間的延長，大豆11S球蛋白中α-螺旋和β-折疊結構相對含量呈下降趨勢，而β-轉角和無規(guī)卷曲結構相對含量逐漸升高，表明大豆11S球蛋白分子二級結構中α-螺旋和β-折疊結構轉變?yōu)棣?轉角和無規(guī)卷曲結構。這可能是由于熱處理使大豆11S球蛋白分子發(fā)生變性，變性的蛋白分子內(nèi)部氫鍵遭到破壞[19]。80 ℃熱處理只破壞了α-螺旋結構中的氫鍵，對β-折疊中的氫鍵影響較小。而90 ℃和100 ℃熱處理使蛋白質(zhì)完全變性，α-螺旋和β-折疊結構中的氫鍵均被破壞，導致α-螺旋和β-折疊結構相對含量降低，并轉變?yōu)棣?轉角和無規(guī)卷曲結構，這也說明β-轉角和無規(guī)卷曲結構在新形成的熱聚集體中具有重要作用[20]。本研究采用拉曼光譜分析得到了與Li Xianghong等[21]研究相同的結果，即熱處理對大豆蛋白的二級結構具有顯著影響，能夠使α-螺旋和β-折疊結構轉變?yōu)棣?轉角和無規(guī)卷曲結構。

2.2.2 氨基酸側鏈分析

表1 不同熱處理條件下酪氨酸（I850/I830）和色氨酸（I760）的包埋/暴露情況Table 1 Analysis of buried and exposed tyrosine (I850/I830) and tryptophan (I760) residues under different heat treatment conditions

蛋白質(zhì)拉曼光譜的850 cm-1和830 cm-1譜峰是酪氨酸殘基的對位取代苯的有關振動，兩峰的強度比（I850/I830）即費米共振線可用來表征酪氨酸殘基的包埋與暴露情況[22]。由表1可以看出，與未經(jīng)熱處理的11S球蛋白相比，80 ℃熱處理時酪氨酸費米共振線（I850/I830）變化較小，表明酪氨酸殘基微環(huán)境在80 ℃熱處理過程中得以保持。然而，在90 ℃和100 ℃熱處理條件下，隨著熱處理時間的延長，I850/I830比值增大，這表明熱處理破壞了維持蛋白質(zhì)三級結構的主要作用力，使包埋于大豆11S球蛋白分子內(nèi)部的酪氨酸殘基暴露于分子表面，并作為氫鍵的供體或受體與水相互作用[23]。酪氨酸疏水基團的暴露使蛋白質(zhì)H0增加，這與本實驗中熱處理對H0影響的結果相符（圖1）。

拉曼光譜中760 cm-1附近的譜帶歸屬為色氨酸側鏈，吸收峰強度可以反映色氨酸微環(huán)境極性的變化。Li-Chan[24]研究表明760 cm-1附近區(qū)域的拉曼峰強度高低與色氨酸殘基的“包埋”和“暴露”有關，熱變性造成蛋白質(zhì)結構的破壞，色氨酸殘基由埋藏在分子內(nèi)部向分子外表面暴露，在拉曼譜圖中表現(xiàn)為色氨酸譜帶強度（I760）降低。由表1可知，與未經(jīng)熱處理的11S球蛋白相比，80 ℃熱處理引起760 cm-1附近區(qū)域的拉曼峰強度降低，表明色氨酸殘基趨向于“暴露”態(tài)。而90 ℃和100 ℃熱處理引起760 cm-1附近區(qū)域的拉曼峰強度先降低后稍有升高，表明色氨酸殘基先趨向于“暴露”態(tài)，而后又趨向于“包埋”態(tài)。色氨酸殘基的暴露是由于蛋白質(zhì)發(fā)生變性，分子結構展開導致的；而色氨酸殘基的包埋可能與熱聚集體的形成有關[25]。整體來看，色氨酸殘基趨向于“暴露”態(tài)，色氨酸的暴露也可能是導致蛋白質(zhì)H0增加的一個原因。

2.2.3 二硫鍵分析

二硫鍵是維持蛋白質(zhì)三級結構的主要作用力，在熱聚集體形成的過程中可能會發(fā)生二硫鍵的斷裂與形成[26]。蛋白質(zhì)拉曼光譜500～550 cm-1是二硫鍵伸縮振動的特征頻率，一般情況下將500～510 cm-1附近譜峰歸屬為g-g-g構型，515～525 cm-1附近譜峰歸屬為g-g-t構型，535～545 cm-1附近譜峰歸屬為t-g-t構型[27]。采用Peak Analyzer軟件進行多峰值Guassina擬合，得到不同熱處理條件下大豆11S球蛋白二硫鍵構型相對含量的變化，結果如圖4所示。

圖4 不同熱處理條件下大豆11S球蛋白二硫鍵構型相對含量的變化Fig. 4 Conformational change of disulfide bond of 11S glycinin under different heat treatment conditions

由圖4可以看出，未經(jīng)熱處理的大豆11S球蛋白中二硫鍵主要以g-g-g構型為主，這與Przulj等[28]發(fā)現(xiàn)的天然大豆分離蛋白中g-g-g構型二硫鍵所占比例最大的結果一致。隨著熱處理時間的延長，80～100 ℃熱處理均會使大豆11S球蛋白二硫鍵中g-g-g構型的相對含量減少，t-g-t構型的相對含量增加。80 ℃熱處理不會改變g-g-t構型的相對含量（圖4A），90 ℃熱處理使g-g-t構型的相對含量降低（圖4B），100 ℃熱處理使g-g-t構型的相對含量增加（圖4C）。熱處理后t-g-t構型成為大豆11S球蛋白二硫鍵的主要構型。這一發(fā)現(xiàn)與Ellepola等[29]對大米球蛋白二硫鍵構型的研究結果相似，其研究表明熱處理能夠促進蛋白分子間二硫鍵的形成，導致二硫鍵由g-g-g構型向t-g-t構型轉變。結合H0分析可知，二硫鍵中g-g-g構型可能會阻礙疏水基團的暴露，而H0的升高可能與t-g-t構型相對含量的增加有關。

3 結 論

隨著熱處理時間的延長，80 ℃熱處理下大豆11S球蛋白的H0逐漸增加，90 ℃和100 ℃熱處理下H0呈先增加后稍有降低的趨勢，且100 ℃熱處理比90 ℃熱處理下H0變化的更快，且變化程度更大。拉曼光譜分析表明，在80 ℃熱處理下，大豆11S球蛋白二級結構中α-螺旋結構轉變?yōu)棣?轉角和無規(guī)卷曲結構。在90 ℃和100 ℃熱處理下，α-螺旋和β-折疊結構轉變?yōu)棣?轉角和無規(guī)卷曲結構。此外，熱處理過程中蛋白分子中的酪氨酸和色氨酸殘基趨于“暴露”態(tài)，這可能會導致大豆11S球蛋白H0的升高。熱處理能夠改變11S球蛋白分子間二硫鍵的振動模式，使二硫鍵由g-g-g構型向t-g-t構型轉變，H0的升高可能與t-g-t構型相對含量的增加有關。