李雙，陳超超，陳雪嵐

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基于萬(wàn)古霉素建立熒光酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)金黃色葡萄球菌

李雙，陳超超，陳雪嵐

江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330096

李雙, 陳超超, 陳雪嵐. 基于萬(wàn)古霉素建立熒光酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)金黃色葡萄球菌. 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(9): 1510–1517.Li S, Chen CC, Chen XL. Vancomycin-based fluorescent enzyme-linked immunoabsorbent assay for detection of Staphylococcus aureus. Chin J Biotech, 2018, 34(9): 1510–1517.

以豬IgG作為捕獲抗體固定金黃色葡萄球菌，修飾有萬(wàn)古霉素的量子點(diǎn)熒光微球作為“檢測(cè)抗體”，建立熒光酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)金黃色葡萄球菌。文中制備了平均粒徑為100 nm的量子點(diǎn)熒光微球并與萬(wàn)古霉素偶聯(lián)；摸索了反應(yīng)最佳鹽離子濃度為0.01 mol/L，反應(yīng)最佳pH為6.0。在該實(shí)驗(yàn)條件下，金黃色葡萄球菌的檢測(cè)靈敏度為104CFU/mL，與其他致病菌無(wú)交叉反應(yīng)。以上結(jié)果表明，該方法可用于快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌，為金黃色葡萄球菌的臨床監(jiān)控和食品檢測(cè)提供參考。

金黃色葡萄球菌，萬(wàn)古霉素，量子點(diǎn)熒光微球，熒光酶聯(lián)免疫吸附法，豬IgG

金黃色葡萄球菌是最常見的病原微生物之一，在水、空氣、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中均可找到，因而很容易造成食物的污染。.引起食物中毒是一個(gè)世界性衛(wèi)生問題，根據(jù)美國(guó)疾病控制中心報(bào)告，由.引起的食物中毒占第二位，僅次于大腸埃希氏菌[1-5]。在美國(guó)，每年約有24萬(wàn)例食物中毒事件是由.污染導(dǎo)致，直接引起醫(yī)療損失達(dá)15億美元[6]；2000年，在日本有1.3萬(wàn)人因食用被.污染的雪印乳品中毒[7]；在我國(guó)，由.引起的細(xì)菌性食物中毒病例也達(dá)20%–25%[8-9]。因此防止.污染食品進(jìn)入人類食物鏈?zhǔn)穷A(yù)防中毒的主要手段。

目前檢測(cè).的“金標(biāo)準(zhǔn)”仍是傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，此方法包括增菌、選擇性培養(yǎng)和后期鑒定3個(gè)環(huán)節(jié)[10]。該法雖然成本低，對(duì)設(shè)備要求不高，能給出定性和定量的結(jié)果，但是整個(gè)檢測(cè)周期耗時(shí)長(zhǎng) (5–7 d)，不能即時(shí)反饋檢測(cè)結(jié)果，無(wú)法滿足食品工業(yè)和疾控部門現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)食源性致病菌的要求。隨著科學(xué)理論和技術(shù)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的生物學(xué)技術(shù)被運(yùn)用到.的檢測(cè)中。如采用PCR技術(shù)對(duì).特有的DNA進(jìn)行擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)[11-12]；采用免疫學(xué)原理建立ELISA等方法進(jìn)行檢測(cè)[13-15]；但以上方法均存在檢測(cè)費(fèi)時(shí)、成本較高的缺陷。量子點(diǎn) (Quantum dots, QDs) 是近年來(lái)發(fā)展較快的一種新型熒光納米材料。相較于傳統(tǒng)的有機(jī)染料，量子點(diǎn)具有激發(fā)光譜寬且分布連續(xù)、發(fā)射光譜窄、耐光漂白以及熒光壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，且熒光強(qiáng)度較普通熒光染料高10–100。量子點(diǎn)熒光微球 (Quantum dot beads, QBs) 通過(guò)將量子點(diǎn)大量包裹于聚合物微球內(nèi)，使得其熒光強(qiáng)度進(jìn)一步提高。由于微球包有聚合物的外層，QBs在溶液中穩(wěn)定性亦得到了有效提高。本實(shí)驗(yàn)利用萬(wàn)古霉素能與革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁表面的D-丙氨酰-D-丙氨酸末端部分片段相互作用產(chǎn)生五氫鍵從而特異性地識(shí)別.及豬IgG的Fc片段可與.的表面蛋白A結(jié)合的特點(diǎn)[16-18]，選用量子點(diǎn)熒光微球作為新型標(biāo)記物，構(gòu)建“類夾心”熒光免疫吸附法檢測(cè).，其原理見圖1。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

實(shí)驗(yàn)用菌株.、單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌、綿羊李斯特菌及大腸桿菌O157∶H7均為實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

圖1 熒光酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)金黃色葡萄球菌原理圖

1.1.2 主要材料

油胺修飾的CdSe/ZnS量子點(diǎn)以及NH2-PEG2000- NH2由美國(guó)Ocean Nano Technology公司惠贈(zèng)；1-十八烯馬來(lái)酸酐的聚合物 (Poly (maleicanhydride- alt-1-octadecene)，PMAO)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC) 購(gòu)自Sigma公司；豬IgG購(gòu)自上海羽朵生物科技有限公司；萬(wàn)古霉素購(gòu)自中國(guó)阿拉丁公司；牛血清白蛋白 (BSA) 購(gòu)自中國(guó)Biosharp公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

ZWY-2012C恒溫培養(yǎng)振蕩器購(gòu)自上海智誠(chéng)公司；Bio-Tech熒光酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio公司；F-4500熒光分光光度計(jì)購(gòu)自日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 量子點(diǎn)熒光微球的制備及與萬(wàn)古霉素的偶聯(lián)

量子點(diǎn)熒光微球的制備：5 mg油胺修飾的CdSe/ZnS量子點(diǎn)以及10 mg PMAO溶解于100 μL三氯甲烷。將其進(jìn)一步與500 μL十二烷基磺酸鈉溶液(3 mg/mL) 混合。細(xì)胞破碎儀將以上油水混合液超聲細(xì)乳化(超聲功率72 W，超聲5 s，間隔10 s，如此程序連續(xù)超聲2 min)。細(xì)乳液置于60 ℃保溫4 h，除去溶液中的三氯甲烷， 15 000×離心15 min獲得量子點(diǎn)熒光微球。將量子點(diǎn)熒光微球溶解于pH 10.0的氫氧化鈉溶液，靜置處理24 h水解PMAO表面酸酐，獲得羧基修飾的量子點(diǎn)熒光微球。15 000×離心回收量子點(diǎn)熒光微球，超純水洗滌微球3次，將量子點(diǎn)熒光微球超純水溶解備用。透射以及掃描電鏡表征量子點(diǎn)熒光微球的光學(xué)粒徑以及形貌；動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)定量子點(diǎn)熒光微球的水化粒徑；熒光分光光度計(jì)分析量子點(diǎn)熒光微球的發(fā)光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)為450 nm，掃描波長(zhǎng)為550–650 nm，發(fā)射狹縫與激發(fā)狹縫為5 nm，掃描速度為240 nm/min)。

1) 量子點(diǎn)熒光微球與萬(wàn)古霉素的偶聯(lián)：量子點(diǎn)熒光微球的接臂。250 μg量子點(diǎn)熒光微球重懸于2 mL PB緩沖液 (0.01 mol/L，pH 6.0)，加入200 μg EDC和1% BSA制備偶聯(lián)BSA的量子點(diǎn)熒光微球，室溫反應(yīng)過(guò)夜后15 000×離心15 min獲得偶聯(lián)BSA的量子點(diǎn)熒光微球；0.01 mol/L PB (pH 7.4)重懸微球，進(jìn)一步加入100 μg EDC和 4.8 mg NH2-PEG2000-NH2(終濃度為1%)，每隔 30 min后補(bǔ)加100 μg EDC，室溫反應(yīng)90 min后15 000×離心15 min，獲得氨基PEG修飾的量子點(diǎn)熒光微球。2) 萬(wàn)古霉素的活化。以萬(wàn)古霉素∶EDC∶ NHSS=1∶4∶4的摩爾比，在pH 6.0的0.01 mol/L PB緩沖液中活化2 h。3) 接臂的熒光微球與萬(wàn)古霉素的偶聯(lián)。向上述接臂的量子點(diǎn)熒光微球溶液中加入1.85 mg活化好的萬(wàn)古霉素，調(diào)節(jié)pH至8.0左右；室溫反應(yīng)3 h后15 000×離心15 min，沉淀重懸于pH 6.0的0.01 mol/L PB緩沖液中；加入1% D-葡萄糖酸溶液(終濃度0.02%)，與100 μg EDC混合后，室溫封閉1 h； 13 500 r/min離心15 min，沉淀用0.01 mol/L PB緩沖液(pH 7.4) 重懸。偶聯(lián)產(chǎn)物通過(guò)紫外掃描及Zeta電位進(jìn)行表征。

1.3.2 熒光酶聯(lián)免疫吸附法反應(yīng)條件的優(yōu)化

反應(yīng)pH的優(yōu)化：首先用pH 8.6 的PBS緩沖液稀釋豬IgG至10 μg/mL，每孔100 μL，4 ℃包被過(guò)夜；再用0.05% PBST洗滌3次，1×PBS洗滌1次，每孔加入300 μL 1% BSA溶液，37 ℃封閉 2 h；0.05% PBST洗滌3次，1×PBS洗滌1次；分別配制pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的PBS緩沖液稀釋.至濃度為106CFU/mL，37 ℃反應(yīng)1.5 h；0.05% PBST洗滌3次，1×PBS洗滌 1次；然后加入對(duì)應(yīng)不同pH的PBS緩沖液稀釋至濃度為25 μg/mL量子點(diǎn)熒光微球和萬(wàn)古霉素偶聯(lián)物，37 ℃反應(yīng)1.5 h；0.05% PBST洗滌3次，1×PBS洗滌1次；最后，用熒光酶標(biāo)儀讀取熒光以確定最佳反應(yīng)pH。

反應(yīng)鹽離子濃度的優(yōu)化：在最佳pH的條件下，摸索不同鹽離子濃度對(duì)反應(yīng)的影響。操作步驟同前文。只是分別用鹽離子濃度為0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mol/L的PBS緩沖液稀釋.至濃度為106CFU/mL。

1.3.3 熒光酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

選取最佳反應(yīng)pH和鹽離子濃度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，步驟同前文。參與反應(yīng)的.濃度依次為101、102、103、104、105、106、107、108及109CFU/mL。

1.3.4 熒光酶聯(lián)免疫吸附法的特異性評(píng)價(jià)

以上述同樣的步驟評(píng)估該方法的特異性。參與評(píng)估的菌株分別是..、.及O157:H7，其濃度均為 106CFU/mL。

1.3.5 牛奶樣品中檢測(cè)金黃色葡萄球菌

將不同濃度的.(1.45×104–1.45×106CFU/mL) 分別添加到10倍稀釋的全脂牛奶樣品中，混勻；以上述同樣的步驟評(píng)估該方法的回收率。不同濃度樣品重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 量子點(diǎn)熒光微球與萬(wàn)古霉素的偶聯(lián)與表征

2.1.1 量子點(diǎn)熒光微球的制備和表征

采用微乳液法制備量子點(diǎn)熒光微球。獲得的量子點(diǎn)熒光微球溶液在自然光下呈現(xiàn)淡淡的棕紅色，而在紫外燈激發(fā)下溶液發(fā)射出強(qiáng)烈的紅色熒光(圖2A中實(shí)物插圖a，b)；同時(shí)進(jìn)一步比較了量子點(diǎn)熒光微球與量子點(diǎn)的發(fā)光強(qiáng)度差異，結(jié)果如圖2A所示，量子點(diǎn)熒光微球最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)為615 nm，與油溶性量子點(diǎn)基本相似，表明本文中熒光微球制備方法不會(huì)改變量子點(diǎn)熒光特性。同時(shí)從圖中可知，在基本相同的熒光強(qiáng)度下，量子點(diǎn)熒光微球濃度僅是量子點(diǎn)的1/330，表明在相同摩爾量下，量子點(diǎn)熒光微球的熒光強(qiáng)度是量子點(diǎn)的330倍。透射電鏡(圖2C) 結(jié)果顯示合成獲得的量子點(diǎn)熒光微球內(nèi)部緊密聚集了大量的油溶性量子點(diǎn)，微球平均光學(xué)粒徑在100 nm左右；掃描電鏡圖(圖2D) 顯示量子點(diǎn)熒光微球呈球狀，大小相對(duì)均一，分散性較好；動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)定其平均水化粒徑為122 nm (圖2B)。

2.1.2 量子點(diǎn)熒光微球與萬(wàn)古霉素偶聯(lián)物的表征

量子點(diǎn)熒光微球、量子點(diǎn)熒光微球PEG偶聯(lián)物和量子點(diǎn)熒光微球萬(wàn)古霉素偶聯(lián)物的紫外掃描圖見圖3A (其中QBs、QB-PEG及QB-PEG-Van同濃度)，Zeta電位見圖3B。圖3A顯示，萬(wàn)古霉素在220 nm以及280 nm具有明顯的特征吸收峰；QBs由于包埋了大量的量子點(diǎn)，在紫外及可見光區(qū)域具有量子點(diǎn)的寬吸收特點(diǎn)；量子點(diǎn)熒光微球偶聯(lián)BSA以及NH2-PEG2000-NH2后，在220 nm的吸光值顯著增加 (蛋白質(zhì)肽鍵吸收峰)；當(dāng)QB-PEG偶聯(lián)萬(wàn)古霉素后，QB-PEG-Van在220 nm處的吸光值進(jìn)一步增加，表明萬(wàn)古霉素與QB-PEG成功偶聯(lián)。圖3B結(jié)果顯示，量子點(diǎn)熒光微球表面帶負(fù)電，Zeta電位值為–38.75；偶聯(lián)PEG后，熒光微球表面修飾有大量的氨基功能團(tuán)，Zeta電位值變?yōu)?38.3；由于萬(wàn)古霉素分子含有兩個(gè)氨基功能團(tuán)，QB-PEG偶聯(lián)萬(wàn)古霉素后，QB-PEG-Van的Zeta電位值上升為+47，進(jìn)一步表明量子點(diǎn)微球成功與萬(wàn)古霉素發(fā)生了偶聯(lián)。

2.2 熒光酶聯(lián)免疫吸附法反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.2.1 反應(yīng)pH的優(yōu)化

pH會(huì)影響萬(wàn)古霉素與細(xì)胞壁表面氫鍵的形成。本實(shí)驗(yàn)研究了不同pH對(duì)熒光強(qiáng)度的影響，確定最佳反應(yīng)pH。圖4顯示，當(dāng)pH為5.0–6.0時(shí)，熒光強(qiáng)度上升；當(dāng)pH為6.0–9.0時(shí)，熒光強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)。因此，本實(shí)驗(yàn)選用pH 6.0作為最佳反應(yīng)條件，該條件與Kell等[16]報(bào)道一致。

圖2 量子點(diǎn)熒光微球的表征(A為量子點(diǎn) (200 nmol/L) 及量子點(diǎn)熒光微球 (0.61 nmol/L) 的熒光光譜圖，插圖a：量子點(diǎn)熒光微球白光下實(shí)物圖，b：量子點(diǎn)熒光微球紫外燈光下實(shí)物圖；B為水化粒徑分布圖；C為透射電鏡圖，插圖為單個(gè)量子點(diǎn)熒光微球放大電鏡圖；D為掃描電鏡圖)

圖3 量子點(diǎn)熒光微球及其修飾PEG和萬(wàn)古霉素的紫外掃描圖(A) 及Zeta電位圖(B)

圖4 不同pH對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

2.2.2 鹽離子濃度的優(yōu)化

鹽離子在一定濃度下會(huì)破壞氫鍵的形成。本實(shí)驗(yàn)研究了不同鹽離子濃度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響，確定最佳反應(yīng)鹽離子濃度。如圖5所示，當(dāng)鹽離子濃度為0.01 mol/L的時(shí)候，熒光強(qiáng)度最高，隨著鹽離子濃度的升高，熒光強(qiáng)度逐漸降低。因此，本實(shí)驗(yàn)選用0.01 mol/L作為最佳鹽離子濃度。

2.3 熒光酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線

將.稀釋至101–109CFU/mL，每個(gè)濃度測(cè)定3個(gè)平行樣，測(cè)熒光強(qiáng)度后取其平均值。設(shè)定目標(biāo)菌為0的熒光強(qiáng)度為F0，其他加了目標(biāo)菌的熒光強(qiáng)度為F，以F-F0為縱坐標(biāo)、.濃度為橫坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖6。圖6顯示，隨著.濃度的升高，熒光強(qiáng)度逐漸升高；當(dāng)菌濃度為104–107CFU/mL時(shí)，具有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線為=177.9–673.7，2=0.986 5；當(dāng)菌濃度高于107CFU/mL時(shí)，出現(xiàn)“HOOK”效應(yīng)[14]。

圖5 不同鹽離子濃度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響示意圖

2.4 熒光酶聯(lián)免疫吸附法的特異性評(píng)價(jià)

以1%接種量分別接種.、單增李斯特菌、綿羊李斯特菌、大腸桿菌O157∶H7于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，滅活后稀釋至106CFU/mL，進(jìn)行特異性評(píng)價(jià)。結(jié)果如圖7所示，該熒光酶聯(lián)免疫吸附法與其他菌均無(wú)交叉反應(yīng)。表明此法特異性強(qiáng)，可用于檢測(cè).。此結(jié)果與只有.表面有蛋白A、豬IgG只能識(shí)別.的特點(diǎn)是相符的。

2.5 熒光酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)牛奶中的金黃色葡萄球菌

采用本實(shí)驗(yàn)中獲得的最佳條件檢測(cè)牛奶樣本中的.，結(jié)果如表1所示，當(dāng)加標(biāo)濃度從1.45×104–1.45×106CFU/mL時(shí)，平均回收率在87.2%–109.7%之間。上述結(jié)果表明該方法可以檢測(cè)實(shí)際樣本中的.。

圖6 熒光酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 全脂牛奶中金黃色葡萄球菌檢測(cè)回收率

圖7 熒光酶聯(lián)免疫吸附法的特異性評(píng)價(jià)

3 小結(jié)

本文基于豬IgG的Fc片段只能與.的表面蛋白A結(jié)合，且萬(wàn)古霉素能特異性識(shí)別革蘭氏陽(yáng)性菌的特點(diǎn)，建立了以豬IgG作為捕獲抗體，修飾有萬(wàn)古霉素的量子點(diǎn)熒光微球作為“檢測(cè)抗體”的類夾心熒光酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè).。該方法在pH 6.0、鹽離子濃度為0.01 mol/L條件下，對(duì).的檢測(cè)范圍為104–107CFU/mL，最低檢測(cè)限為104CFU/mL，且與其他革蘭氏陽(yáng)性菌或陰性菌無(wú)交叉反應(yīng)，檢測(cè)樣品回收率在87.2%–109.7%之間。該方法為.的快速檢測(cè)提供了有效方法，為.的臨床監(jiān)控提供了基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Vancomycin-based fluorescent enzyme-linked immunoabsorbent assay for detection of

Shuang Li, Chaochao Chen, and Xuelan Chen

School of Life Sciences, Jiangxi Normal University, Nanchang 330096, Jiangxi, China

In the study, fluorescent enzyme-linked immnoabsorbent assay for detection ofwas established with IgG from pig as capture antibody and quantum dot nanobeads (QBs) labeled vancomycin (QB-Vans) as testing antibody. Quantum dot of about 100 nm partical size nanobeads were prepared and linked with vancomycin. The optimum concentrations of salt ions were 0.01 mol/L, and the optimum pH was 6.0. Under the optimum conditions, the detection sensitivity for.was 104CFU/mL, and there was no cross-reaction with other pathogenic bacteria. Thus, the method could be used for rapid screening of., for the clinical monitoring and foodborne pathogens detection.

, vancomycin, quantum dot nanobeads, fluorescent enmyze-linked immunosorbent assay, pig IgG

December 8, 2017;

May 2, 2018

"5511" Advantageous Science and Technology Innovation Team Project of Jiangxi Province (No. 20165BCB19004), National Natural Science Foundation of China (No. 31660019), Natural Science Foundation of Jiangxi Province (No. 2016BAB204173).

Xuelan Chen. Tel: +86-791-88120391; Fax: +86-791-88120390; E-mail: xuelanchen162@163.com

江西省“5511”優(yōu)勢(shì)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目 (No. 20165BCB19004)，國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31660019)，江西省自然科學(xué)基金(No. 2016BAB204173) 資助。

2018-05-17

10.13345/j.cjb.170488

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180509.1543.001.html