方金勇，衣凱寧，宋早文，陳夢云，徐玲玲，趙鐵軍

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雷公藤紅素抑制成人T細胞白血病細胞增殖及機制

方金勇，衣凱寧，宋早文，陳夢云，徐玲玲，趙鐵軍

浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004

方金勇, 衣凱寧, 宋早文, 等. 雷公藤紅素抑制成人T細胞白血病細胞增殖及機制. 生物工程學報, 2018, 34(9): 1491–1499.Fang JY, Yi KN, Song ZW, et al. Inhibition of proliferation of adult T-cell leukemia cells by celastrol. Chin J Biotech, 2018, 34(9): 1491–1499.

本研究旨在分析雷公藤紅素對成人T細胞白血病細胞增殖、凋亡的影響，并探討其分子機制。使用不同濃度的雷公藤紅素溶液處理多種成人T細胞白血病細胞株，通過四唑鹽比色法 (MTT)、克隆形成實驗檢測細胞的增殖情況；Annexin V/PI雙染檢測細胞凋亡情況；最后通過Western blotting及雙熒光素酶報告基因技術(shù)探究雷公藤紅素抑制成人T細胞白血病細胞生長的調(diào)控機制。結(jié)果表明雷公藤紅素能顯著抑制成人T細胞白血病細胞增殖并誘導其凋亡，隨著雷公藤紅素濃度的增加Bax/Bcl-2蛋白比率明顯升高，凋亡途徑中Caspase-3/7蛋白也隨之被切割活化，同時病毒編碼的癌蛋白Tax的表達也明顯受到抑制。以上結(jié)果表明，雷公藤紅素通過調(diào)控Bcl-2家族蛋白，激活了Caspase途徑誘導細胞凋亡，并通過抑制病毒關(guān)鍵蛋白Tax的表達，從而有效抑制了成人T細胞白血病細胞的增殖。該研究為臨床應(yīng)用雷公藤紅素治療成人T細胞白血病提供了實驗依據(jù)。

雷公藤紅素，成人T細胞白血病，增殖，凋亡，Tax蛋白

成人T細胞白血病 (Adult T-cell leukemia, ATL) 是一種由人類T細胞白血病病毒1型 (Human T cell leukemia virus type-1, HTLV-1) 引起的惡性淋巴系增殖性腫瘤疾病[1-3]。在HTLV-1編碼的一系列病毒調(diào)控蛋白中，Tax蛋白在ATL的發(fā)病機制中起著重要作用[2,4]。由于ATL的潛伏期長，存在化療耐藥以及嚴重的免疫抑制，預(yù)后極差[5-8]，使得治愈成人T細胞白血病的情況不容樂觀。目前白血病治療方法主要是聯(lián)合化學療法、干細胞移植等[9]，但由于其療效的不確定，存在毒副作用和費用昂貴等不足嚴重限制了其應(yīng)用，故尋找一種更為廉價、高效的治療手段迫在眉睫。

目前將植物來源的天然產(chǎn)物作為抗腫瘤藥物是當今腫瘤治療的一大研究熱點。大量的研究表明這些天然產(chǎn)物在腫瘤治療中有著重要作用。雷公藤紅素 (Celastrol) 是從雷公藤屬 (Hook. f.) 植物的根皮中提取的一種五環(huán)三萜類化合物，其分子式為C29H38O4(圖1)，它具有較強的抗炎、抗氧化和抗腫瘤等藥理活性[10]。同時研究表明雷公藤紅素是一種天然的蛋白酶體抑制劑，能有效地抑制蛋白酶體活性進而誘發(fā)癌細胞凋亡[11]。近年來，大量研究表明雷公藤紅素能顯著抑制多種腫瘤細胞的惡性增殖，如乳腺癌[12]、非小細胞細胞肺癌[13]、胰腺癌[14]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[15]、白血病[16]和前列腺癌[17]。然而，其對成人T細胞白血病細胞增殖的抑制作用及分子機制研究未見報道。文中以成人T細胞白血病細胞為研究對象，采用MTT法、克隆形成和流式細胞術(shù)，檢測了雷公藤紅素對成人T細胞白血病細胞的增殖和凋亡的影響，并通過Western blotting和報告基因技術(shù)深入探究了雷公藤紅素抗腫瘤作用的分子機制。該研究成果為今后臨床應(yīng)用雷公藤紅素治療成人T細胞白血病提供了實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株

成人T細胞白血病細胞株：ATL-T、ATL-2、MT-4、TL-Om1均由日本京都大學松岡雅雄教授惠贈。

1.2 藥品與試劑

雷公藤紅素：CAS號為34157-83-0，購自MCE公司，產(chǎn)品貨號為HY-13067，HPLC純度為99.90%。細胞培養(yǎng)基RPMI-1640、胰蛋白酶購自Gibco公司；胎牛血清 (FBS) 購自法國Biowest公司；兔抗人Caspase3、Caspase7、Bax、Bcl-2多克隆抗體，鼠抗人Tax、GAPDH單克隆抗體，以及山羊抗兔Biotin (IgG H&L)、Streptavidin-HRP和山羊抗鼠IgG HRP多克隆抗體均購自Cell Signaling Technology (CST) 公司；AnnexinV/PI凋亡試劑盒購自北京聯(lián)科生物公司；Trizol Reagent試劑購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、雙熒光素酶報告基因試劑盒購自Promega公司。

圖1 雷公藤紅素化學結(jié)構(gòu)式

1.3 細胞培養(yǎng)

白血病細胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清和雙抗 (青、鏈霉素，100 IU/mL) 的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)及傳代，使用對數(shù)期細胞進行實驗。

1.4 MTT法檢測細胞存活率

先將5×103個/孔白血病細胞接種于96孔板，隨后加入不同濃度的雷公藤紅素溶液，同時以DMSO作為陰性對照 (DMSO的量與配置最高濃度雷公藤紅素溶液所需母液的量相等，下同)。藥物處理0、24、48、72 h后，每孔加入10 μL的MTT溶液 (5 mg/mL)，4 h后裂解細胞后，采用酶標儀 (美國Bio-Rad 公司) 測定595 nm波長處各孔的吸光值 (值)，計算細胞增殖率 (%)=實驗組值／對照組值×100。

1.5 克隆形成檢測細胞增殖能力

先將400個/孔ATL-T細胞接種于6孔板。待細胞貼壁后，換成含有不同濃度的雷公藤紅素溶液培養(yǎng)基。2–3周后，用甲醇固定，再用0.1%結(jié)晶紫染色，最后在顯微鏡下記錄含有50個以上細胞的克隆數(shù)，重復(fù)計數(shù)3次，計算出其平均克隆數(shù)。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡

分別用DMSO (陰性對照) 和不同濃度的雷公藤紅素溶液培養(yǎng)白血病細胞，24 h后收集細胞，先用PBS清洗，再用Annexin-FITC及PI染色，最后運用流式細胞儀 (德國Partec公司) 檢測細胞凋亡情況。

1.7 Western blotting定量分析凋亡相關(guān)蛋白表達水平

分別用DMSO和不同濃度的雷公藤紅素溶液培養(yǎng)ATL-T和TL-Oml細胞，48 h后用RIPA細胞裂解液提取總蛋白。變性后的總蛋白樣進行垂直凝膠電泳及蛋白印跡轉(zhuǎn)膜 (美國Bio-Rad公司)，奶粉封閉，抗體孵育，最后加入ECL (電化學發(fā)光試劑) 進行發(fā)光反應(yīng)，使用蛋白曝光儀 (上海天能) 拍照。

1.8 雙熒光素酶報告基因檢測相關(guān)基因的啟動子活性

將1×105個/孔白血病細胞接種于12孔板，12 h后轉(zhuǎn)染所需質(zhì)粒，再過12 h加入雷公藤紅素溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細胞，使用Promega公司雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.9 實時熒光定量PCR檢測基因轉(zhuǎn)錄水平

使用Trizol法提取總RNA，利用Promega公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，以SYBR Green為探針，使用實時熒光定量PCR儀 (德國耶拿公司) 檢測基因表達，反應(yīng)結(jié)束后，采用2–??CT法分析實驗數(shù)據(jù)。

1.10 統(tǒng)計方法

采用Excel、SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行顯著性檢驗，*<0.05，表示統(tǒng)計學上有顯著性差異；**<0.01表示統(tǒng)計學上有極顯著性差異；OriginProPorable8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 雷公藤紅素顯著抑制多種成人T細胞白血病細胞的惡性增殖

本實驗采用4種成人T細胞白血病細胞株 (ATL-T，ATL-2，MT-4和TL-Om1) 研究雷公藤紅素對成人T細胞白血病細胞增殖的影響。用0、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L雷公藤紅素溶液分別處理各細胞株，在0、24、48、72 h后通過MTT檢測各細胞株的增殖情況。結(jié)果表明 (圖2)，雷公藤紅素對多種成人T細胞白血病株的增殖都存在顯著的抑制，且該抑制作用呈一定的劑量和時間依賴性。

為了再次確認雷公藤紅素對ATL細胞生長的抑制作用，我們采用了克隆形成實驗。結(jié)果顯示 (圖3)，與DMSO處理的對照組相比，雷公藤紅素處理的ATL-T細胞形成克隆的個數(shù)隨著濃度的增加而減少，并且該抑制作用呈現(xiàn)出一定濃度依賴性。

圖2 MTT檢測雷公藤紅素對四種成人T細胞白血病細胞生長的影響

圖3 克隆形成檢測雷公藤紅素對ATL-T生長的影響

2.2 雷公藤紅素可誘導白血病細胞凋亡

根據(jù)上述結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素對ATL-T、TL-Om1細胞增殖的抑制效果最明顯，因此選擇將ATL-T、TL-Om1作為主要的研究對象，進一步探索雷公藤紅素抑制成人T細胞白血病細胞增殖的分子機制。為了研究雷公藤紅素是否能促進成人T細胞白血病細胞的凋亡，選用0、0.5、2.5 μmol/L的雷公藤紅素溶液處理ATL-T、TL-Om1細胞，24 h后收集細胞，運用流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡情況。結(jié)果表明 (圖4)，DMSO處理組細胞的凋亡率分別為1.2%、1.9%，隨著雷公藤紅素濃度增加細胞的凋亡率也明顯增加，在雷公藤紅素濃度為0.5 μmol/L時，ATL-T、TL-Om1細胞凋亡率分別為6.7%和12.1%，而在2.5 μmol/L時ATL-T、TL-Om1細胞凋亡率分別達到了23.3%和68.7%。結(jié)果表明雷公藤紅素能顯著誘導成人T細胞白血病細胞凋亡，且該作用呈現(xiàn)出一定藥物濃度依賴性。

2.3 雷公藤紅素通過caspase途徑誘導成人T細胞白血病細胞凋亡

為了進一步揭示雷公藤紅素促進成人T細胞白血病細胞凋亡的分子機制，我們隨后檢測了經(jīng)典caspase凋亡途徑中的執(zhí)行者Caspase3/7蛋白的表達，并選取甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (Glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH) 作為內(nèi)參蛋白。選擇5、10 μmol/L的雷公藤紅素溶液處理ATL-T細胞，由于TL-Om1對雷公藤紅素更為敏感，故在處理TL-Om1細胞時選擇雷公藤紅素濃度為2、4 μmol/L。Western blotting檢測結(jié)果顯示 (圖5)，與對照組相比，雷公藤紅素處理兩種ATL細胞株后，Caspase3/7蛋白均出現(xiàn)了剪切條帶。該結(jié)果表明雷公藤紅素能激活caspase途徑，從而誘導成人T細胞白血病細胞凋亡。

2.4 雷公藤紅素參與調(diào)控Bax、Bcl-2蛋白表達

Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡起著“主開關(guān)”作用，我們運用Western blotting技術(shù)檢測了Bcl-2家族蛋白中的關(guān)鍵蛋白Bax、Bcl-2以及內(nèi)參蛋白GAPDH的表達。結(jié)果如圖6A所示，隨著雷公藤紅素濃度的增加，在ATL-T和TL-Om1細胞中的促凋亡蛋白Bax表達顯著上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達則明顯降低。為了進一步分析雷公藤紅素調(diào)控Bcl-2家族蛋白表達的分子機制，構(gòu)建了含有Bax啟動子區(qū)域的報告基因質(zhì)粒Bax-Luc，并運用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灧治隽死坠偌t素對Bax啟動子的影響。結(jié)果如圖6B所示，隨著雷公藤紅素濃度的增加，Bax-Luc的熒光強度也隨之增加，表明雷公藤紅素能增強Bax基因啟動子的活性。因此，我們推測雷公藤紅素通過增強Bax啟動子的活性從而促進了Bax蛋白的表達，最終誘導成人T細胞白血病細胞的凋亡。

圖4 流式細胞檢測雷公藤紅素對ATL-T、TL-Om1凋亡的影響

圖5 雷公藤紅素對ATL-T、TL-Om1細胞Caspase家族蛋白表達的影響

2.5 雷公藤紅素能抑制病毒蛋白Tax的表達

研究表明雷公藤紅素不僅能抑制腫瘤細胞的生長，同時它還有一定的抗病毒活性[18]。ATL是由HTLV-1病毒感染所引起，尤其是病毒編碼的Tax蛋白在ATL發(fā)生過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。因此，我們探究了雷公藤紅素是否通過調(diào)控病毒關(guān)鍵蛋白Tax的表達，從而抑制了細胞的增殖。結(jié)果顯示 (圖7)，雷公藤紅素處理ATL-T細胞48 h后，通過實時定量PCR和Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)不同濃度的雷公藤紅素均能顯著降低病毒核心蛋白Tax的表達量。該結(jié)果表明雷公藤紅素能通過降低Tax蛋白的表達，從而抑制ATL的惡性增殖。

圖6 雷公藤紅素對ATL-T、TL-Om1細胞Bcl-2家族蛋白表達及對Bax啟動子活力的影響

圖7 雷公藤紅素對病毒蛋白Tax表達的影響

3 討論

近年來，有大量研究表明雷公藤紅素作為一種天然的蛋白酶體抑制劑能顯著抑制多種腫瘤細胞的惡性增殖[12-17]。本研究表明較低濃度的雷公藤紅素能顯著抑制成人T細胞白血病 (ATL) 細胞的增殖，且這種抑制呈現(xiàn)出時間及藥物濃度依賴。通過流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素能誘導ATL細胞發(fā)生凋亡，從而抑制了細胞的增殖。

半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶 (Caspase) 家族在細胞凋亡中起著關(guān)鍵的作用，Lakhani等[19]認為Caspase-3/7是細胞發(fā)生凋亡的執(zhí)行者，一旦被剪切激活就會引起級聯(lián)介導的凋亡途徑，從而引起細胞凋亡。而Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡起著“主開關(guān)”作用，能調(diào)控線粒體膜的膜電位和通透性，促使線粒體釋放促凋亡因子，從而激活了Caspase介導的凋亡途徑[20-21]。有文獻證實在非小細胞細胞肺癌A549[13]、乳腺癌[12]等細胞中雷公藤紅素能顯著促進細胞色素c、凋亡誘導因子釋放，上調(diào)Bax蛋白表達，下調(diào)Bcl-2蛋白表達，從而促進腫瘤凋亡。本研究使用不同濃度的雷公藤紅素處理ATL細胞，發(fā)現(xiàn)高濃度藥物下Caspase3/7出現(xiàn)了明顯的剪切帶，并且顯著降低了Bcl-2蛋白，上調(diào)了Bax蛋白，表明雷公藤紅素很可能通過調(diào)控凋亡蛋白的表達，促進線粒體釋放凋亡因子，從而調(diào)控細胞的凋亡。Del Poeta等[22]檢測了急性髓型白血病患者Bcl-2、Bax的表達水平，發(fā)現(xiàn)Bax/Bcl-2的比值與患者的完全緩解率呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，表明Bax和Bcl-2可作為白血病的重要治療靶標。本研究結(jié)果表明雷公藤紅素能明顯提高成人T細胞白血病細胞中Bax/Bcl-2的比值，這將為今后藥物治療成人T細胞白血病提供依據(jù)。

成人T細胞白血病ATL是一種由人類T細胞白血病病毒1型 (HTLV-1) 引起的侵襲性腫瘤。HTLV-1能編碼一系列調(diào)節(jié)基因、、、和等[23]。有研究表明Tax蛋白參與調(diào)控細胞內(nèi)多條腫瘤相關(guān)信號通路，促進白血病細胞惡性增殖，從而誘導白血病的發(fā)生[2,4]。故我們推測雷公藤紅素可能影響病毒蛋白Tax的表達，從而抑制細胞生長。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素能降低Tax蛋白水平，且在轉(zhuǎn)錄水平也存在明顯的抑制。而Narayan等[18]發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素能顯著抑制艾滋病病毒 (HIV) 前病毒基因Tat蛋白的活性，其機制是雷公藤紅素通過共價修飾改變Tat蛋白的二級結(jié)構(gòu)，抑制其轉(zhuǎn)錄激活功能，從而抑制HIV前病毒基因組的轉(zhuǎn)錄延伸。HTLV-1中的Tax功能與HIV中Tat的結(jié)構(gòu)和功能較為相似，Tax也能促進HTLV-1病毒的5′LTR 的活性，從而促進病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄，故推測雷公藤紅素可能通過抑制Tax的活性，抑制了HTLV-1病毒的5′LTR的活性，從而抑制了Tax自身的轉(zhuǎn)錄。后續(xù)研究將進一步探究其具體的分子作用機制，為今后運用雷公藤紅素實現(xiàn)抗病毒治療提供線索。

綜上所述，雷公藤紅素能顯著抑制成人T細胞白血病細胞的增殖，并促進其凋亡，其機制可能是雷公藤紅素通過調(diào)控Bcl-2家族蛋白，改變了粒體膜的膜電位和通透性，促使線粒體釋放促凋亡因子，激活了Caspase介導的凋亡途徑，從而促進細胞凋亡。本研究還發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素能抑制HTLV-1病毒蛋白Tax的表達，推測雷公藤紅素可能是通過下調(diào)Tax的表達，抑制Tax對細胞內(nèi)各信號通路的調(diào)控作用，從而抑制ATL的惡性增殖。本研究將為今后進一步開展動物實驗，以及最終應(yīng)用于臨床提供了實驗依據(jù)。

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(本文責編 郝麗芳)

Inhibition of proliferation of adult T-cell leukemia cells by celastrol

Jinyong Fang, Kaining Yi, Zaowen Song, Mengyun Chen, Lingling Xu, and Tiejun Zhao

College of Chemistry and Life Sciences, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, Zhejiang, China

We studied the effect of celastrol on the proliferation and apoptosis of adult T-cell leukemia (ATL) cells. After treating adult T-cell leukemia cell lines with different concentrations of celastrol, we analyzed the cell proliferation by MTT and colony formation assays. Flow cytometry was conducted to detect cell apoptosis by Annexin V-FITC/PI staining. Western blotting and dual-luciferase reporter assay were done to study the mechanism how celastrol suppressed the growth of adult T-cell leukemia cells. Celastrol could significantly inhibit the proliferation of adult T-cell leukemia cells, and induce apoptosis of ATL cells. With the increase of the concentration of celastrol, the ratio of Bax/Bcl-2 protein was up-regulated. The Caspase-3/7 protein was cleaved and activated after treatment with celastrol. Moreover, the expression of HTLV-1-encoded viral protein Tax was significantly inhibited in the celastrol treated cells. Taken together, these results indicated that celastrol effectively inhibited the proliferation of adult T-cell leukemia cells by regulating the expression of Bcl-2 family protein, and induced cell apoptosis by activating Caspase dependent pathway. In addition, celastrol could inhibit the expression of viral protein Tax. This study will provide an experimental basis for the clinical application of celastrol in the treatment of adult T-cell leukemia.

celastrol, adult T-cell leukemia, proliferation, apoptosis, Tax protein

November 30, 2017;

April 23, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 31470262), Public Welfare Technology Application Research Project of Zhejiang (No. 2015C33149), Foundation of Zhejiang Educational Committee in 2017 (No. Y201738673), the 2014 Annual Open Fund of “Biology” in the “Top Key” Discipline of Zhejiang Province (No. KFJJ2014003).

Tiejun Zhao. E-mail: tjzhao@zjnu.cn Lingling Xu. E-mail: xll0518@zjnu.cn

國家自然科學基金(No. 31470262)，浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計劃項目(No. 2015C33149)，2017年度浙江省教育廳項目 (No. Y201738673)，浙江省“重中之重”學科“生物學”2014年度開放基金(No. KFJJ2014003)資助。

2018-06-21

10.13345/j.cjb.170474

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180620.1530.001.html