徐平麗，唐桂英，畢玉平，柳展基，單雷

?

花生基因抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因后代分析

徐平麗1,2，唐桂英1,2，畢玉平1,2，柳展基3，單雷1,2

1 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250100 2 山東省作物遺傳改良與生理生態(tài)重點實驗室，山東 濟(jì)南 250100 3 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 棉花研究中心，山東 濟(jì)南 250100

徐平麗, 唐桂英, 畢玉平, 等. 花生AhFAD2基因抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因后代分析.生物工程學(xué)報, 2018, 34(9): 1469–1477.Xu PL, Tang GY, Bi YP, et al. Analysis of the peanut transgenic offspring with depressing AhFAD2 gene. Chin J Biotech, 2018, 34(9): 1469–1477.

FAD2 (Δ12fatty acid desaturase，Δ12FAD或FAD2) 是催化油酸在脂肪酸碳鏈Δ12位脫氫生成亞油酸的關(guān)鍵酶。在花生中，F(xiàn)AD2酶活性下降或失活可提高籽粒中油酸的相對含量，改善花生籽粒及制品的品質(zhì)和氧化穩(wěn)定性。通過將種子特異性表達(dá)Lectin啟動子和CaMV35S啟動子驅(qū)動的倒位重復(fù)基因RNAi干擾結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)入花生，獲得了以豐花1號(FH1) 和花育23 (HY23) 為受體、攜帶上述2種轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定遺傳的花生轉(zhuǎn)基因純合體株系，轉(zhuǎn)基因花生主要農(nóng)藝性狀與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ栈疽恢?。實時熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，各轉(zhuǎn)基因株系發(fā)育種子中基因的轉(zhuǎn)錄水平普遍下調(diào)。氣相色譜法進(jìn)一步測定了部分轉(zhuǎn)基因后代株系種子的脂肪酸含量及組成，籽粒中油酸含量分別平均提高了15.09% (HY23為受體)、36.40% (FH1為受體)，相應(yīng)地，亞油酸含量平均下降了16.19%、29.81%，油亞比平均增加了38.02%、98.10%。各轉(zhuǎn)基因株系的油酸含量顯著提高；且在以FH1為受體的轉(zhuǎn)基因株系后代籽粒以及種子特異性啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)中，RNAi的抑制效果更明顯。通過RNAi技術(shù)抑制花生FAD2基因的表達(dá)，可以有效提高花生籽粒油酸含量。該技術(shù)體系可以為花生品質(zhì)育種提供借鑒。

花生，Δ12脂肪酸脫氫酶，RNA干擾，轉(zhuǎn)基因，油酸與亞油酸比值

花生是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物，花生籽粒含油量達(dá)50%左右，油酸、亞油酸分別占其總脂肪酸含量的36%–67%和15%–43%[1]。油酸為18碳單不飽和脂肪酸，化學(xué)性質(zhì)相比亞油酸、亞麻酸等多不飽和脂肪酸要穩(wěn)定得多。提高油酸含量可以改善花生及花生制品的口味和氧化穩(wěn)定性。Mozingo等報道稱，烘焙的高油酸花生比普通含量油酸花生貯存期延長8倍[2-4]。因此，提高花生籽粒中油酸的相對含量已成為目前花生品質(zhì)育種的重要目標(biāo)之一[5-7]。

微粒體Δ12脂肪酸脫氫酶 (Δ12fatty acid desaturase，Δ12FAD或FAD2)，是催化脂肪酸碳鏈上油酸在C12處脫氫生成亞油酸的關(guān)鍵酶，對于植物貯藏脂和膜脂中的不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例有著重要調(diào)控作用[8-9]?；ㄉ蚪M中存在兩對能編碼完整蛋白的基因 (和)。和基因編碼區(qū)序列變化所引起編碼蛋白活性的差異與花生籽粒油酸、亞油酸含量密切相關(guān)[10-11]。

近幾年，反義、共抑制或RNAi技術(shù)在改良脂肪酸組成方面的研究，已在油菜、大豆、棉花、亞麻等作物取得了突破[12-17]。Peng等構(gòu)建獨特內(nèi)含子間隔的脂肪酸延長酶1 (Fatty acid elongase1，) 基因融合片段的發(fā)卡RNA干擾載體，同時抑制基因的表達(dá)，使得轉(zhuǎn)基因油菜種子中的油酸含量從15%提高到85%；多不飽和脂肪酸含量下降到10%，其中芥酸含量為0[12]。Lee等通過反義RNA特異抑制種子基因，獲得了高油酸、低多不飽和脂肪酸的油菜[13]。Kinney等1996年通過正義-共抑制途徑，降低FAD2的酶活性，使得轉(zhuǎn)基因大豆的油酸含量從67%提高到超過80%[14]。Buhr等則利用RNAi同時抑制?；D(zhuǎn)移酶基因 () 和基因的表達(dá)，獲得了低棕櫚酸和高油酸的轉(zhuǎn)基因大豆[15]。Liu等通過構(gòu)建種子特異性啟動子驅(qū)動的hpRNA (Hairpin RNA) 載體，抑制基因的表達(dá)，使得棉籽油中油酸的含量從15%提高到77%，亞油酸含量從60%下降到4%[16]。Chen等通過RNAi干擾基因的表達(dá)，使得轉(zhuǎn)基因T3代亞麻中油酸含量達(dá)到77%[17]。

我們實驗室前期構(gòu)建了基因RNAi抑制表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，分別將花椰菜花葉病毒 (Cauliflower mosaic virus，CaMV) 35S啟動子和種子特異性表達(dá)的大豆凝集素 (Lectin) 啟動子驅(qū)動的倒位重復(fù)片段轉(zhuǎn)入花生，獲得了一批PCR檢測的陽性轉(zhuǎn)基因植株[18]。本研究在此基礎(chǔ)上，經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化、溫室種植、分子水平檢測篩選等，獲得10個穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系。利用qRT-PCR分析了基因在部分轉(zhuǎn)基因花生后代種子中的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況；調(diào)查了轉(zhuǎn)基因株系的主要農(nóng)藝性狀；利用氣相色譜測定了部分轉(zhuǎn)基因花生后代種子的脂肪酸含量和組成。

1 材料與方法

1.1 植物材料

花生L.品種：花育23號 (HY23，CK1即非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?)，由山東省花生研究所提供；豐花1號 (FH1，CK2即非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?)，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院萬勇善教授提供。

花生轉(zhuǎn)基因株系由本實驗室通過RNAi策略，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將基因倒位重復(fù)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)入受體花生FH1[18]和HY23獲得。文中分析的以HY23為受體的株系包括：201301021903、201301061108、201201030109 (帶有種子特異啟動子Lectin，下文分別簡寫為H1903、H1108、H0109) 和201302011308、201202100319、201202120104 (帶有組成型表達(dá)啟動子CaMV35S，下文分別簡寫為H1308、H0319、H0104)。FH1為受體的株系：201001010104、201001040101 (帶有種子特異啟動子Lectin，下文分別簡寫為F0104、F0101) 和 201002123501、201202060904 (帶有組成型表達(dá)啟動子CaMV35S，下文分別簡寫為F3501、F0904)?；ㄉD(zhuǎn)基因后代及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ站N植在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心飲馬泉實驗基地溫室。

1.2 試劑

DNA聚合酶、PrimeScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000購自大連TaKaRa生物工程有限公司。TransStart Green qPCR SuperMix UDG購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。新型植物RNA快速提取試劑盒購自北京華越洋生物科技有限公司。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。其余均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純試劑。

1.3 實時熒光定量PCR引物設(shè)計

遵循熒光定量引物設(shè)計原則，使用Primer5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計熒光定量PCR引物。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

qRT-PCR檢測花生內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄水平的引物序列，2F：5′-CGACCGCAACGAAGT GTT-3′；2-R：5′-CCCTCCCTGGTGGATTGT-3′；花生內(nèi)參Actin基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測引物序列，Actin-F：5′-ATGTATGTAGCCATCCAAG-3′；Actin-R：5′-ACCAGAGTCCAGAACAATA-3′。

1.4 方法

1.4.1 穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系獲得

實驗室前期已獲得以FH1為受體的RNAi抑制基因表達(dá)的2種轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)的陽性轉(zhuǎn)基因花生植株[18]。在此基礎(chǔ)上，以HY23為受體進(jìn)行了同樣的轉(zhuǎn)化，最終，共獲得2個轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)的PCR檢測陽性的轉(zhuǎn)基因T0代植株20株，部分植株P(guān)CR產(chǎn)物經(jīng)測序驗證。來源于受體FH1和HY23的轉(zhuǎn)基因T0代植株經(jīng)3–4代溫室種植、田間取樣PCR檢測、DNA序列測定篩選等過程，最終獲得單拷貝插入穩(wěn)定遺傳的純合體株系10個，用于后續(xù)實驗。

1.4.2基因在轉(zhuǎn)基因后代的轉(zhuǎn)錄水平分析

按照北京華越洋生物科技有限公司新型植物RNA快速提取試劑盒提供的方法，分別提取轉(zhuǎn)基因株系及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ臻_花后30 d和60 d未成熟種子的總RNA。紫外分光光度計測定其純度、濃度，取0.2–0.5 μg 總RNA在1.2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測總RNA的完整性。取0.5 μg總RNA，在10 μL體系中參照TaKaRa PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit提供步驟和條件合成cDNA第一鏈，儲存于–20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

選擇受體為HY23的轉(zhuǎn)基因后代4個轉(zhuǎn)化事件 (包括Lectin啟動子的2個，CaMV35S啟動子的2個)，受體為FH1的轉(zhuǎn)基因后代4個轉(zhuǎn)化事件 (包括Lectin啟動子的2個，CaMV35S啟動子的2個)，以花生Actin基因作為參比，實時熒光定量法對轉(zhuǎn)基因種子中基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況進(jìn)行分析。每一株系的檢測均設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，相對表達(dá)量用2–ΔΔCT的表示。

熒光實時定量PCR反應(yīng)體系包括：10 μL 2×TransStart Green qPCR SuperMix UDG，10 μmol/LPCR正向引物和反向引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL (約50 ng)，Passive Reference Dye (50×) 0.4 μL，ddH2O補(bǔ)充體積至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；然后95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)由ABI公司的7500型熒光定量PCR儀完成。

1.4.3 轉(zhuǎn)基因花生株系主要農(nóng)藝性狀調(diào)查

主要通過觀察比較方法，對種植在溫室的轉(zhuǎn)基因花生及對照的株高、花期、生育期及感病情況等進(jìn)行調(diào)查。收獲后的花生，則待自然曬干，分別選取不同轉(zhuǎn)基因株系的10個單株，每單株隨機(jī)選10個飽果，計算百果重；之后，隨機(jī)選取100粒飽滿種子，計算百仁重；統(tǒng)計記錄單株飽果數(shù)。

1.4.4 氣相色譜法 (Gas chromatography，GC) 檢測轉(zhuǎn)基因花生籽粒脂肪酸組成及含量

近紅外反射光譜法首先從T2代開始，對轉(zhuǎn)基因后代成熟籽粒的油酸含量進(jìn)行初步篩選，選取油酸含量升高的后代株系進(jìn)行后續(xù)實驗。之后，綜合主要農(nóng)藝性狀調(diào)查和近紅外反射光譜測定結(jié)果，在每個表達(dá)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因株系中選取2–3個轉(zhuǎn)化事件，每個轉(zhuǎn)化事件選取3個所測結(jié)果接近平均值的單株籽粒為氣相色譜測定對象，每個樣品10 g。參考Sukhija等[19]改進(jìn)的一步法抽提脂肪酸并進(jìn)行甲酯化，利用配置色譜柱DB-23 (60.0 m×250 μm×0.25 μm)、檢測器FID 270 ℃的氣相色譜儀Agilent 6890，參考國標(biāo)GB/T 21514-2008[20]分析種子脂肪酸組成及其含量，測定由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)飼料分析測試中心完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 AhFAD2基因在轉(zhuǎn)基因花生種子中的轉(zhuǎn)錄水平分析

qRT-PCR結(jié)果顯示 (圖1)，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，花生基因的相對表達(dá)量在各轉(zhuǎn)基因株系后代發(fā)育種子中均有不同程度的降低，但降低幅度在不同啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)、種子不同的發(fā)育時期及不同的轉(zhuǎn)基因株系間不同。以HY23為受體的4個轉(zhuǎn)基因株系，在種子發(fā)育早期 (花后30 d)，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，所測基因的相對表達(dá)量下降幅度為8.45%–51.30%，平均下降23.70%，種子特異性啟動子、CaMV35S啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)平均下降幅度分別為34.95%、12.46%；而在種子發(fā)育后期 (花后60 d)，基因表達(dá)受到更明顯抑制，基因相對表達(dá)量下降幅度為20.14%–88.98%，平均下降68.76%，種子特異性啟動子、CaMV35S啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)平均下降幅度分別為82.96%、54.56%。以FH1為受體的4個轉(zhuǎn)基因株系中，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，花?0 d發(fā)育種子中基因的相對表達(dá)量下降幅度為16.38%–80.47%，平均下降48.88%，種子特異性啟動子、CaMV35S啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)平均下降幅度分別為74.06%、23.70%；而花后60 d種子中，基因表達(dá)受到的抑制更明顯，相對表達(dá)量下降幅度為31.16%–94.4%，平均下降71.04%，種子特異性啟動子、CaMV35S啟動子驅(qū)動的平均下降幅度分別為86.00%、56.09%。因此，種子特異性啟動子驅(qū)動下，抑制基因表達(dá)的效果更明顯；在以FH1為受體的轉(zhuǎn)基因株系籽粒中，基因的相對表達(dá)量較低，RNAi的抑制效果更理想。

圖1 AhFAD2基因在不同轉(zhuǎn)基因株系發(fā)育種子中的轉(zhuǎn)錄水平

2.2 轉(zhuǎn)基因花生主要農(nóng)藝性狀調(diào)查

對2個轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因花生主要農(nóng)藝性狀分析表明，轉(zhuǎn)基因花生生育期分別為130 d和135 d左右 (以HY23、FH1為受體)，主莖平均高度分別為37.0 cm和45.0 cm，均屬連續(xù)開花型，整個生命周期無明顯感病癥狀，分別與非轉(zhuǎn)基因HY23、FH1的表現(xiàn)基本一致。收獲后，調(diào)查單株花生莢果及種子的部分性狀，轉(zhuǎn)基因花生果形、粒形、種皮顏色與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ栈疽恢?；百仁重、百果重等也無明顯變化 (圖2，表1)。調(diào)查結(jié)果可見，無論是組成型表達(dá)35S啟動子還是種子特異性Lectin啟動子驅(qū)動的基因抑制表達(dá)都沒有引起轉(zhuǎn)基因花生主要農(nóng)藝性狀的明顯改變。

2.3 氣相色譜法 (GC) 分析轉(zhuǎn)基因花生株系籽粒脂肪酸組成

綜合考慮近紅外反射光譜檢測情況 (數(shù)據(jù)未展示) 和農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果，我們共選取2個轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)的10個不同轉(zhuǎn)基因代表單株 (6個HY23為受體，4個FH1為受體)，利用氣相色譜法測定了籽粒中的主要脂肪酸含量及組成 (表2)。分析發(fā)現(xiàn)，花生轉(zhuǎn)基因株系種子中的8種主要脂肪酸含量發(fā)生了變化，包括棕櫚酸 (C16:0)、硬脂酸 (C18:0)、油酸 (C18:1n9c)、亞油酸 (C18:2n6c)、花生酸 (C20:0)、山崳酸 (C22:0)、木蠟酸 (C24:0) 等 (表3，含量低于2%的數(shù)據(jù)未展示)。以HY23為受體的轉(zhuǎn)基因株系種子中油酸含量從44.19%提高到48.15%–53.69%，平均提高了15.09%，最高可達(dá)21.5% (H1308)；亞油酸含量從34.48%下降到26.19%–31.04%，平均下降16.19%；油亞比從1.28提高到1.55–2.05，平均提高了38.02%。以FH1為受體的轉(zhuǎn)基因株系種子中油酸含量從37.20%提高到42.01%–55.22%，平均提高了36.40%，最高提高幅度為48.44% (F0104)；亞油酸含量從40.51%下降到24.87%–34.36%，平均下降29.81%；油亞比從0.92提高到1.22–2.22，平均提高了98.10%。轉(zhuǎn)基因株系種子中油酸含量、油亞比普遍提高，轉(zhuǎn)基因株系與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩g種子油酸、亞油酸含量差異顯著，說明倒位重復(fù)序列片段串聯(lián)組成的RNAi結(jié)構(gòu)，可以有效抑制基因的表達(dá)；不同的轉(zhuǎn)基因株系之間，油酸含量差異顯著，不同啟動子驅(qū)動下的油亞比提高率差異明顯，說明不同的啟動子驅(qū)動、不同的轉(zhuǎn)化受體、不同株系間基因表達(dá)的RNAi抑制效果明顯不同 (表2，圖3)。

圖2 收獲期轉(zhuǎn)基因花生和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏谋硇?/p>

表1 部分轉(zhuǎn)基因花生莢果產(chǎn)量性狀統(tǒng)計

表2 轉(zhuǎn)基因花生籽粒中主要脂肪酸組分含量

CK1 is untransformed control HY23; CK2 is untransformed control FH1; capital letter represents significant variation at the 0.01 probability level; lowercase letter represents significant difference at the 0.05 probability level.

圖3 花生不同轉(zhuǎn)基因株系籽粒的油亞比增加率

3 討論

3.1 RNAi有效抑制轉(zhuǎn)基因花生種子中FAD2基因的表達(dá)

花生中含有兩個基因 (、)，它們在ORF區(qū)具有99%的序列一致性，因此，我們選擇位于編碼區(qū)5′端9–235 bp的保守區(qū)域設(shè)計RNAi表達(dá)結(jié)構(gòu)可以同時抑制和的表達(dá)[18]。本研究獲得的轉(zhuǎn)基因株系種子中基因的表達(dá)受到不同程度抑制，但其他表型沒有發(fā)生明顯變化。一方面，干擾片段與其他基因的編碼序列或EST序列沒有同源性，不會意外沉默其他基因；另一方面，花生高油酸突變體的研究表明，正常生長條件下，這兩個基因在根、葉等營養(yǎng)體中的抑制表達(dá)或編碼酶活性降低，并不會造成明顯的表型變化。

Stoujesijk等在擬南芥中的研究表明，F(xiàn)AD2的RNA干擾效果在擬南芥子代穩(wěn)定遺傳[21]。我們的研究結(jié)果也基本印證了這一結(jié)論。本研究qRT-PCR分析的是T3或T4代純合株系種子中的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)轉(zhuǎn)基因株系中RNAi抑制基因表達(dá)的抑制效果明顯，說明倒位重復(fù)序列片段串聯(lián)組成的RNAi結(jié)構(gòu)，可以有效抑制基因的表達(dá)。

對基因在不同轉(zhuǎn)基因株系發(fā)育種子中的轉(zhuǎn)錄水平分析發(fā)現(xiàn)，種子特異性啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)，RNAi抑制基因表達(dá)的效果更為明顯。這或許是由于CaMV35S啟動子屬于組成型的表達(dá)啟動子，在整株水平上抑制基因的表達(dá)容易影響植株的膜脂結(jié)構(gòu)、植株的生長速率及組培再生苗的生根等[18]。Lectin啟動子為種子特異表達(dá)啟動子，僅在種子發(fā)育階段驅(qū)動RNAi抑制基因的表達(dá)，一般不會對植株整體造成影響。脂肪酸代謝是植株生命體的基本生命活動之一，基因是脂肪酸代謝途徑的關(guān)鍵酶，因此，從籽仁油酸含量改良角度出發(fā)，種子特異啟動子調(diào)控的RNAi轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)，在改善花生油品質(zhì)等方面會有更大的應(yīng)用空間。

3.2 轉(zhuǎn)基因花生籽粒的O/L比不同程度提高

FAD2是催化油酸在脂肪酸碳鏈C12位脫氫生成亞油酸的關(guān)鍵酶，與植物貯藏脂中油酸、亞油酸含量密切相關(guān)?；ㄉ泻蛢苫蚓幋a的酶均具有催化活性，但它們對油酸含量的貢獻(xiàn)不同，基因突變的貢獻(xiàn)性更大一些。編碼區(qū)448位一個點突變致使編碼的酶活性幾乎喪失，然而僅這一基因突變，花生籽粒只表現(xiàn)出普通油酸性狀；而突變導(dǎo)致的表達(dá)降低或酶活性喪失，則花生籽粒會表現(xiàn)出中等油酸性狀；兩基因同時突變，突變體籽粒表現(xiàn)高油酸性狀，油酸含量可達(dá)75%以上[10,22]。

本研究以HY23為受體的轉(zhuǎn)基因株系種子中油亞比從1.28提高到1.55–2.05，平均提高了38.02%；而FH1為受體的轉(zhuǎn)化事件種子中油亞比從0.92提高到1.22–2.22，平均提高了98.10%。不同受體花生獲得的轉(zhuǎn)基因材料種子油亞比提高幅度明顯不同。以往的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化受體HY23基因發(fā)生突變，編碼的酶本身已不具備催化功能，因此其籽粒的O/L與其他珍珠豆型品種相比有所提高；而受體FH1攜帶的是野生型和基因，籽粒O/L處于較低水平[10]。按設(shè)計我們轉(zhuǎn)入的干擾片段應(yīng)對兩基因具有同等的抑制效果，本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄水平上，開花60 d的HY23和FH1轉(zhuǎn)基因株系間的抑制效果確實沒有明顯差別，但由于HY23受體突變的AhFAD2A本身的酶活性幾近喪失，因此轉(zhuǎn)基因種子中基因的抑制效果僅為基因抑制表達(dá)的結(jié)果，O/L提高幅度就相對偏低。FH1為受體的轉(zhuǎn)基因株系和兩基因表達(dá)均受到抑制，盡管它們的油酸含量和O/L總體上與HY23為受體的轉(zhuǎn)基因株系持平，但油酸含量和O/L的提高幅度相對更大。

以往在油菜、棉花、大豆等作物高油酸轉(zhuǎn)基因研究中發(fā)現(xiàn)，介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默策略比反義RNA、RNA共抑制等技術(shù)更為有效[12-17]。以油菜基因的3′UTR (Untranslated region，UTR) 219 bp片段為干擾片段的結(jié)構(gòu)，使得轉(zhuǎn)基因油菜油酸含量從67%提高到85%[13]。油菜、兩個基因的融合片段形成的結(jié)構(gòu)，可同時抑制轉(zhuǎn)基因油菜種子中與兩個基因的表達(dá)，使油酸含量高達(dá)85%且不含芥子酸[12]。Liu等在棉花中抑制ghFAD2-1基因表達(dá)，也使轉(zhuǎn)基因棉花籽粒中油酸從15%提高到了77%[16]。然而，本研究兩種受體材料獲得的轉(zhuǎn)基因株系中油酸含量最高的分別為53.69%、55.22%，O/L分別為1.55–2.05、1.22–2.22。此結(jié)果與黃冰艷等獲得的RNAi轉(zhuǎn)基因花生T1代籽粒O/L接近[23]。黃冰艷[23]等在研究中采用的也是具有內(nèi)含子間隔的具發(fā)卡環(huán)的RNAi結(jié)構(gòu)，但文中沒有介紹所選基因干擾片段的位置。同一轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的不同轉(zhuǎn)基因株系目標(biāo)性狀之間存在差異，這在其他植物轉(zhuǎn)基因研究中也常發(fā)生，推測是由于外源片段插入受體基因組的不同位置所造成[17,21]。但是，同樣運(yùn)用hpRNA介導(dǎo)的策略抑制基因的表達(dá)，我們和黃冰艷等[23]在花生中的研究結(jié)果與他人在油菜、棉花等作物中的結(jié)果相比差距很大，可能是由于所選靶基因片段的位置不同造成了不同的抑制效果。

[1] Moore KM, Knauft DA. The inheritance of high oleic acid in peanut. J Hered, 1989, 80(3): 252–253.

[2] Braddock JC, Sims CA, O′Keefe SF. Flavor and oxidative stability of roasted high oleic acid peanut. J Food Sci, 1995, 60(3): 489–493.

[3] Mugendi JB, Sims CA, Gorbet DW, et al. Flavor stability of high-oleic peanuts stored at low humidity. J Am Oil Chem Soc, 1998, 75(1): 21–25.

[4] Mozingo RW, O’Keefe SF, Sanders TH, et al. Improving shelf life of roasted and salted inshell peanuts using high oleic fatty acid chemistry. Peanut Sci, 2004, 31(1): 40–45.

[5] Rogalski M, Carrer H. Engineering plastid fatty acid biosynthesis to improve food quality and biofuel production in higher plants. Plant Biotech J, 2011, 9(5): 554–564.

[6] Napier JA. The production of unusual fatty acids in transgenic plants. Annu Rev Plant Biol, 2007, 58: 295–319.

[7] Takeno S, Sakuradani E, Tomi A, et al. Improvement of the fatty acid composition of an oil-producing filamentous fungus,1S-4, through RNA interference with Δ12-desaturase gene expression. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(9): 5124–5128.

[8] Jung S, Swift D, Sengoku E, et al. The high oleate trait in the cultivated peanut [L.]: I. Isolation and characterization of two genes encoding microsomal oleoyl-PC desaturases. Mol Gen Genet, 2000, 263(5): 796–805.

[9] Jung S, Powell G, Moore K, et al. The high oleate trait in the cultivated peanut [L.]: II. Molecular basis and genetics of the trait. Mol Gen Genet, 2000, 263(5): 806–811.

[10] Zhou LX, Tang GY, Chen G, et al. Correlation betweenpolymorphism and oleic acid/linoleic acid ratio in peanut seeds. Acta Agron Sin, 2011, 37(3): 415–423 (in Chinese). 周麗俠, 唐桂英, 陳高, 等. 花生基因的多態(tài)性及其與籽粒油酸/亞油酸比值間的相關(guān)性. 作物學(xué)報, 2011, 37(3): 415–423.

[11] Nayeri FD, Yarizade K. Bioinformatics study of delta-12 fatty acid desaturase 2 (FAD2) gene in oilseeds. Mol Biol Rep, 2014, 41(8): 5077–5087.

[12] Peng Q, Hu Y, Wei R, et al. Simultaneous silencing ofandgenes affects both oleic acid and erucic acid contents inseeds. Plant Cell Rep, 2010, 29: 317–325.

[13] Lee KR, Kim EH, Roh KH, et al. High-oleic oilseed rapes developed with seed-specific suppression ofgene expression. Appl Biol Chem, 2016, 59(4): 669–676.

[14] Kinney AJ. Development of genetically engineered soybean oils for food applications. J Food Lipids, 1996, 3(4): 273–292.

[15] Buhr T, Sato S, Ebrahim F, et al. Ribozyme termination of RNA transcripts down-regulate seed fatty acid genes in transgenic soybean. Plant J, 2002, 30(2): 155–163.

[16] Liu Q, Singh SP, Green AG. High-stearic and high-oleic cottonseed oils produced by hairpin RNA-mediated post-transcriptional gene silencing. Plant Physiol, 2002, 129(4): 1732–1743.

[17] Chen YR, Zhou XR, Zhang ZJ, et al. Development of high oleic oil crop platform in flax through RNAi-mediated multiplegene silencing. Plant Cell Rep, 2015, 34(4): 643–653.

[18] Zhang XQ, Shan L, Tang GY, et al. Transformation of RNAi suppressed expression vector containing of Δ12fatty acid desaturase gene viainfection inL. Chin J Oil Crop Sci, 2007, 29(4): 409–415, 419 (in Chinese). 張小茜, 單雷, 唐桂英, 等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花生Δ12脂肪酸脫氫酶基因RNAi抑制表達(dá)遺傳轉(zhuǎn)化研究. 中國油料作物學(xué)報, 2007, 29(4): 409–415, 419.

[19] Sukhija PS, Palmquist DL. Rapid method for determination of total fatty acid content and composition of feedstuffs and feces. J Agric Food Chem, 1988, 36(6): 1202–1206.

[20] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局. GB/T 21514?2008/ISO/TS 17764:2002, 飼料中脂肪酸含量的測定. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008.

[21] Stoutjesdijk PA, Singh SP, Liu Q, et al. HpRNA-mediated targeting of the Arabidopsisgene gives highly efficient and stable silencing. Plant Physiol, 2002, 129(4): 1723–1731.

[22] Wang ML, Barkley NA, Chen ZB, et al.gene mutations significantly alter fatty acid profiles in cultivated peanutsBiochem Genet, 2011, 49(11/12): 748–759.

[23] Huang BY, Zhang XY, Miao LJ, et al. RNAi transformation ofgene and fatty acid analysis of transgenic seeds. Chin J Oil Crop Sci, 2008, 30(3): 290–293 (in Chinese). 黃冰艷, 張新友, 苗利娟, 等. 花生基因RNAi載體轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因籽粒脂肪酸分析. 中國油料作物學(xué)報, 2008, 30(3): 290–293.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

Analysis of the peanut transgenic offspring with depressinggene

Pingli Xu1,2, Guiying Tang1,2, Yuping Bi1,2, Zhanji Liu3, and Lei Shan1,2

1 Bio-Tech Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, Shandong, China 2 Shandong Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Ecology and Physiology, Jinan 250100, Shandong, China 3 Shandong Cotton Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, Shandong, China

The delta-12 fatty acid desaturase (Δ12FAD or FAD2) is a key enzyme that catalyzes oleic acid to linoleic acid by dehydrogenation at Δ12position offatty acid carbon chain. In peanut, reduction or loss of FAD2 activity could enhance the relative content of oleic acid in kernels, and improve the quality and oxidation stability of peanut kernels and products. RNA interference (RNAi) technology could lead to non-expression or down-regulated expression ofgene. We constructed two RNA interference expression vectors with the inverted repeat sequence of partialgene, which were driven separately by cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter or soybean agglutinin lectin seed-specific promoter. Homozygous transgenic lines carrying the two constructs stably in genetics were developed by peanut genetic transformation. There were no significant differences between the transgenic lines and the control through investigating the main agronomic traits. We analyzed the transcriptional level expression ofgene in transgenic lines and the control by real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR). The results suggested that the target genes of transgenic lines were likely suppressed by RNA interference, but showed different transcriptional levels in different peanut transgenic lines. Compared with untransformed lines, the resulting down-regulation ofgene resulted in a 15.09% or 36.40% increase in oleic acid content in the seeds of transformed HY23 and FH1 lines respectively, and the content of linoleic acid decreased by 16.19% or 29.81%, correspondingly, the ratio of oleic acid and linoleic acid (O/L) improved by 38.02%, 98.10%. The oleic acid content had significant differences between the two transformation constructs, and also among different transgenic lines. Moreover, the inhibition effect of RNAi was more obvious in the transgenic lines with FH1 as the receptor, and with transformation structure driven by seed specific promoter. The suppressed expression ofgene enabled the development of peanut fatty acid, which indicated that RNA interference would be a reliable technique for the genetic modification of peanut seed quality and the potential for improvement of other traits as well.

peanut(L.), Δ12fatty acid desaturase (FAD2), RNA interference (RNAi), transgenic, the ratio of oleic acid and linoleic acid (O/L)

December 23, 2017;

June 8, 2018

National Natural Science Foundation of China (Nos. 31201272, 31470349), Agricultural Improved Seed Project of Shandong Province (2014-2017).

Lei Shan. Tel: +86-531-66659435; E-mail: shlei1025@sina.com

國家自然科學(xué)基金(Nos. 31201272，31470349)，山東省農(nóng)業(yè)良種工程(2014-2017) 資助。

2018-07-06

10.13345/j.cjb.170508

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180709.1036.001.html