張飛，高秀清，張靖潔，劉寶玲，張紅梅，薛金愛，李潤植

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種子特異表達異源基因提高大豆種子含油量和營養(yǎng)品質(zhì)

張飛1，高秀清2，張靖潔2，劉寶玲2，張紅梅1，薛金愛2，李潤植2

1 山西農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，山西 太谷 030801 2 山西農(nóng)業(yè)大學 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801

張飛, 高秀清, 張靖潔, 等. 種子特異表達異源DGAT1基因提高大豆種子含油量和營養(yǎng)品質(zhì).生物工程學報, 2018, 34(9): 1478–1490.Zhang F, Gao XQ, Zhang JJ, et al. Seed-specific expression of heterologous gene DGAT1 increase soybean seed oil content and nutritional quality. Chin J Biotech, 2018, 34(9): 1478–1490.

為提高大豆種子含油量和營養(yǎng)品質(zhì)，文中以二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶1 (Diacylglycerol acyltransferase 1，DGAT1) 基因為遺傳修飾靶標。將來自高油植物斑鳩菊L.編碼DGAT1酶蛋白的cDNA克隆在大豆種子特異超表達。連續(xù)選擇獲得高代 (T7)轉(zhuǎn)基因大豆株系。轉(zhuǎn)基因株系表型鑒定顯示，在大豆種子發(fā)育中期 (30–45 DAF)，高表達，相應地DGAT酶活性是非轉(zhuǎn)基因野生型和空載體轉(zhuǎn)化對照的7.8倍。轉(zhuǎn)基因成熟種子含油量比對照提高了5.1%，淀粉含量比對照減少2%–3%，蛋白質(zhì)含量與對照無顯著差異。此外，轉(zhuǎn)基因大豆種子百粒重 (14.5 g) 和種子萌發(fā)率 (95.6%) 與對照亦無明顯差異。種子油脂脂肪酸成分分析顯示，轉(zhuǎn)基因大豆種子油中抗氧化的油酸 (C18:1Δ9) 含量比對照提高8.2%，相應地易氧化的亞油酸 (C18:2Δ9,12) 和亞麻酸 (C18:3Δ9,12,15) 分別減少6%和2%。這些數(shù)據(jù)表明，種子特異超表達外源基因，打破了大豆種子含油量和蛋白質(zhì)含量的負連鎖，顯著提高種子含油量且未導致蛋白含量降低。轉(zhuǎn)基因大豆種子重量和萌發(fā)率亦未顯負效應，而且種子油脂抗氧化性和營養(yǎng)品質(zhì)得以改善。研究表明應用這一高酶活性VgDGAT1A的基因工程是提高種子含油量和改善油脂品質(zhì)的一條有效途徑。

大豆，斑鳩菊，種子營養(yǎng)品質(zhì)，二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶1 (DGAT1)，種子特異表達，脂肪酸和油脂含量

大豆 (L. Merr) 是我國和世界主要糧油作物之一，富含蛋白質(zhì) (約40%)，氨基酸種類多，鈣磷鐵含量豐富，油脂含量高 (約20%)。大豆油除了作為人類食用油的主要來源之外，還用于生產(chǎn)生物柴油、食品和化工品等[1]?，F(xiàn)今全球28%的植物油來源于大豆油，而且大豆油的市場消費量逐年增長[2]。培育高油大豆品種和提高大豆油產(chǎn)量是應對全球大豆油市場需求的有效途徑。然而，常規(guī)育種手段難以克服種子油含量與蛋白含量負相關(guān)的缺點，不易培育獲得種子油脂和蛋白質(zhì)含量雙高的大豆品種。

植物種子油主要為三酰甘油 (Triacylglycerol，TAG)。TAG在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成并儲存于油體內(nèi)。在相關(guān)酶的催化下，甘油分子3個碳原子 (sn-1、-2和-3) 依次分別結(jié)合一個長鏈脂肪酸?；纬蒚AG。二?；视王；D(zhuǎn)移酶 (Diacylglycerol acyltransferase，DGAT) 參與TAG合成的最后一步?；磻荰AG合成的限速酶。DGAT (EC2.3.1.20) 將結(jié)合于CoA分子的長鏈脂肪酸?；D(zhuǎn)移到二酰甘油 (sn-1,2-diacylglycerol，DAG) 的sn-3位置而生成TAG。根據(jù)DGAT的結(jié)構(gòu)、亞細胞定位等信息，可將其分為3種類型：DGAT1、DGAT2和DGAT3。DGAT1和DGAT2為膜結(jié)合蛋白酶，但二者序列不具同源性[3-4]。現(xiàn)已在擬南芥、油菜和大豆等植物中分離到編碼有功能的或基因。DGAT3又稱胞質(zhì)DGAT (Cyto DGAT)，為可溶性酶蛋白，最初從花生種子中分離獲得，且具有DGAT酶活性[5]。擬南芥、亞麻薺和大豆等一些油料作物也發(fā)現(xiàn)DGAT3的同源序列，但還未有功能驗證[1,6]。全基因組分析顯示大豆基因組編碼多個拷貝的DGAT1、DGAT2和DGAT3序列[1]，迄今僅有GmDGAT1A (Glyma13g16560) 和GmDGAT1B (Glma17g06120) 的功能得到鑒定。GmDGAT1A和1B均在大豆種子油脂大量積累時期高表達，預示著二者在大豆種子油脂合成積累中起重要作用。

用模式植物擬南芥和其他油料作物為受體的轉(zhuǎn)基因試驗表明，超表達不同來源的基因能提高種子含油量，但效應有差異。Jako等研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtDGAT1突變體AS11中種子含油量下降20%–40%，過表達導致種子含油量和千粒重提高[7]。過表達源于旱金蓮L.的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子油含量提高3.5%[8]。煙草L.基因沉默的轉(zhuǎn)基因煙草成熟種子油含量減少9%–49%[9]。陸地棉沉默引起棉籽種仁含油量下降3.13%[10]。Taylor 等報道超表達擬南芥和甘藍型油菜的可使油菜種子含油量分別提高2.5%和5%[11]。將在油菜種子中超表達，種子油含量提高14%，而且轉(zhuǎn)基因植株耐旱性增強[12]。同一作物不同的等位基因其效應也存在差異。Zheng等發(fā)現(xiàn)，過表達來自低油玉米的基因?qū)е罗D(zhuǎn)基因玉米種胚含油量提高12.4%，而表達來自高油玉米的基因，轉(zhuǎn)基因玉米種胚含油量提高26.1%[13]。

超表達基因亦可提高大豆種子含油量。Lardizabal等在大豆中過表達密碼子優(yōu)化的一種真菌基因，使大豆種子含油量提高了1.5%[14]，但是種子蛋白含量小幅降低。種子特異表達來自芝麻的，轉(zhuǎn)基因大豆種子含油量提高1.75%[15]，未報道種子蛋白含量是否變化。Roesler等對大豆GmDGAT1 (Glyma.17G053300) 部分編碼序列進行修飾 (替換了14個氨基酸) 獲得酶活性提高的突變體，將野生型GmDGAT1和突變型GmDGAT1分別在大豆體細胞胚中表達，體細胞胚含油量分別提高5%和10%。一年一點大田試驗結(jié)果顯示，突變型GmDGAT1轉(zhuǎn)基因成熟種子含油量提高3%，蛋白質(zhì)含量未減少，然而可溶性碳水化合物含量降低1.9%[16]。可見，超表達外源或大豆本身基因均可提高大豆種子油脂積累，盡管效應有差異。

本課題組前期從高油野生植物斑鳩菊L. (含油量約60%) 發(fā)育種子中分離到編碼DGAT1的cDNA克隆 (, GenBank登錄號：EF653277)。多種體內(nèi)和體外酶學試驗證明VgDGAT1A酶活性高于大豆等油料作物DGAT1活性5倍多[17-19]，是我們所檢測來源不同的數(shù)種DGAT1酶活性最高者。苑麗霞等將導入油料作物亞麻薺并使其高表達，轉(zhuǎn)基因純合系亞麻薺種子含油量從野生型的37%提高到46%–51%[20]。在棉籽中超表達亦顯著提高了棉花種子含油量[21]。此外，在煙草莖葉等營養(yǎng)器官異源過表達可使煙葉等營養(yǎng)組織TAG含量從野生型的2.1% (干基) 提高到9.8%[22]。這些結(jié)果表明，VgDGAT1在油料作物遺傳改良及代謝工程上具有重要應用價值，的異源表達不僅可提高種子含油量，而且還能顯著提高植株營養(yǎng)器官油脂富集。

在我們前期培育獲得種子特異表達轉(zhuǎn)基因大豆材料基礎上[23]，本研究重點對連續(xù)篩選獲得的高代 (T7) 遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因大豆材料進行表型分析；通過實時熒光定量PCR檢測在大豆發(fā)育種子中的表達譜；提取種子細胞微體膜結(jié)合蛋白、并檢測樣品中DGAT酶活性；分別檢測轉(zhuǎn)基因大豆種子油脂及脂肪酸成分、蛋白和淀粉含量，以及種子干重、種子萌發(fā)率等表型。與非轉(zhuǎn)化的對照植株相比，種子特異超表達基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因系成熟種子含油量平均提高5.1%，且蛋白含量 (41%) 不降低，種子重量和種子萌發(fā)等農(nóng)藝性狀未顯負效應。本研究為全面解析大豆油脂合成積累機制及調(diào)控網(wǎng)絡提供了新知識，亦為大豆等油料作物油脂品質(zhì)改良提供理論及技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 目的基因及大豆遺傳轉(zhuǎn)化

本實驗所用的轉(zhuǎn)基因受體大豆種質(zhì)材料為大豆品種Jack。用于大豆遺傳轉(zhuǎn)化的外源基因來自高油野生植物斑鳩菊、編碼二脂酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶1 (Diacylglycerol acyltransferase 1，DGAT1) 的cDNA克隆 () (GenBank登錄號：EF653277)。構(gòu)建種子特異表達載體，采用基于體細胞再生體系的粒子轟擊法對大豆Jack進行遺傳轉(zhuǎn)化[23]。本實驗所檢測的轉(zhuǎn)基因大豆高代材料 (T7) 由山西農(nóng)業(yè)大學分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所培育和保存。轉(zhuǎn)基因大豆材料 (T7) 種植于山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)作站網(wǎng)室，正常田間管理至種子收獲。

1.2 轉(zhuǎn)VgDGAT1A基因大豆T7植株的DNA檢測

以4周齡的大豆幼苗 (4–6片真葉) 為試材，取新鮮幼葉為樣品，采取改良版的CTAB法[24]提取葉片DNA。用Primer Premier 5.0引物設計軟件設計PCR所用引物 (表1)，設計時應避免引物二聚體的出現(xiàn)，引物由TSINGKE Biological Technology公司合成。PCR反應采用2×PCR StarMix with Loading Dye試劑盒 (Genstar公司)。反應體系包括正向和反向引物各1 μL (10 nmol/L)，10 μL 2×PCR StarMix混合，1 μL DNA和7 μL ddH2O。PCR反應程序為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 轉(zhuǎn)基因大豆VgDGAT1A的表達分析

使用Total RNA Extractor試劑盒 (BBI Life Science公司) 提取總RNA。取大豆開花后(Day after flowering，DAF) 12、25、35、45、50、60 d的種子為樣品，在液氮中充分研磨，然后進行總RNA提取。將所得到的RNA樣品置于?80 ℃保存?zhèn)溆?。使用cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Genstar公司) 合成cDNA。用2×增強型染料實時熒光定量PCR 預混液 (GenStar公司) 進行qRT-PCR。反應體系包括：正向和反向引物 (定量引物見表1) 各1 μL (10 nmol/L)，25 μL 2×RealStar Green Power Mixture混合，1 μL DNA，1 μL ROX Reference Dye (50×)，21 μL RNase-free H2O。每個樣品至少做6個生物學重復。反應程序為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，59 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。以大豆管家基因作內(nèi)參 (內(nèi)參引物見表1)，采用2–ΔΔCq來計算目的基因相對表達水平。

取8周齡轉(zhuǎn)基因大豆根、莖、葉、花 (花被未開啟) 和豆莢為樣品，在液氮中充分研磨，然后進行總RNA提取。將所得到的RNA樣品置于?80 ℃保存?zhèn)溆?。使用cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Genstar公司) 合成cDNA。用不同器官和35 d種子的cDNA樣品進行半定量RT-PCR檢測。體系包括：正向和反向引物 (定量引物見表1) 各1 μL (10 nmol/L)，10 μL 2×PCR StarMix混合，1 μL DNA和7 μL ddH2O。PCR反應程序為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 PCR檢測轉(zhuǎn)VgDGAT1A大豆植株的引物

1.4 VgDGAT1A轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)育種子的DGAT酶活性分析

依據(jù)Yu等[18]描述的方法進行微體蛋白分離和DGAT酶活性分析。主要步驟包括：取足量的發(fā)育中期大豆種子樣品 (500–800 mg)，置于液氮中研磨成粉末狀，加入提取緩沖液 (100 mmol/L HEPES-KOH，pH 7.4，0.32 mol/L蔗糖，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L二硫蘇糖醇)，冰上繼續(xù)研磨。將研磨所得細胞混液過濾后離心 (10 000 r/min，20 min)，取上清液超高速離心 (105 000 r/min，1 h)，獲得粗酶液樣品。用提取液重新懸浮微體蛋白，測蛋白濃度并將各樣品蛋白濃度標定一致便于后續(xù)分析。

DGAT酶活性測試所用放射性底物均從Sigma公司定制，包括1-[14C]16:0-CoA (56 mCi/mmol)、1-[14C]18:0-CoA (56 mCi/mmol)、1-[14C]18:1-CoA (56 mCi/mmol)，16C DAG (56 mCi/mmol) 和18C DAG (56 mCi/mmol)。非放射性標記的CoAs、ATP、CoASH以及TAG標樣等酶活性測試化學藥品購自Sigma公司。酶活性測試反應體系 (500 μL)：微體蛋白 (富集DGAT) 100–200 μg，90 mmol/L HEPES-NaOH，0.5 mmol/L ATP，0.5 mmol/L CoASH，1 mmol/L MgCl2，200 μm14C labeled sn-1，2 di18:1 (溶于0.02% Tween 20，/，10 nCi/nmol)，18或40 μm14C-labeled acyl-CoA (10 nCi/nmol)。反應體系在pH 7.4、30 ℃水浴振蕩 (100 r/min) 反應30–60 min。加入二氯甲烷∶異丙醇 (1∶2) 終止反應。分層后取有機相用硅膠G板進行TLC層析，分離和純化放射性標記TAGs。層析介質(zhì)為已烷∶二乙醚∶乙酸 (70∶30∶1，//)。用放射性TCL掃描儀查看TCL板上放射性條帶，并將條帶刮下，用液體閃爍計數(shù)器檢測各樣品的放射性TAG條帶的放射強度，每個樣品至少做6個生物學重復，計算樣品所含DGAT酶活性 (pmol/min·mg蛋白)。

1.5 大豆種子油脂脂肪酸成分測定

參照Li等[25]的方法提取大豆種子脂肪酸并進行甲酯化反應。使用Agilent 7890B氣相色譜儀對提取的大豆油甲酯化樣品進行分析，VF-23MS毛細管色譜柱30 m×0.25 m×0.25 μm。載氣為高純氮氣，分流比為30∶1，進樣口溫度250 ℃，進樣體積為1 μL。程序升溫：初始溫度為110 ℃，運行3 min，以4 ℃/min升至220 ℃后運行15 min，F(xiàn)ID檢測器溫度為260 ℃，尾吹氣氮氣45 mL/min，空氣450 mL/min，氫氣40 mL/min。每個樣品至少做6個生物學重復。

1.6 大豆種子含油量、蛋白及淀粉含量、百粒重和發(fā)芽率的測定

種子含油量的測定采用氯仿甲醇法。利用分析天平分別準確稱取50 mg粗研的野生型大豆Jack和轉(zhuǎn)基因大豆種子粉末，加入石英砂后充分研磨。研磨后置于50 mL離心管中，加入7.5 mL甲醇：氯仿 (2∶1) 溶液，置于37 ℃的搖床抽提24 h，離心后收集上層有機相。剩余的樣品殘渣再加入7.5 mL甲醇：氯仿 (2∶1) 溶液重復抽提12 h，并離心收集上層有機相。同理進行第3次抽提后合并3次的有機相。加入5 mL氯仿、9 mL 1%的NaCl溶液，使得最后甲醇：氯仿：H2O的比例為2∶2∶1.8?；靹蚝? 000 r/min離心10 min，收集下層有機相到稱重的玻璃管中，氮氣吹干后稱出玻璃管及脂肪酸的總重量。每個樣品至少做6個生物學重復。

蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法，淀粉含量測定采用蒽酮比色法。每個樣品至少做6個生物學重復。

百粒重測定：用分析天平對野生型的Jack大豆和轉(zhuǎn)基因大豆進行百粒重測定，每個樣品至少做6個生物學重復。

發(fā)芽率測定：野生型的Jack大豆和轉(zhuǎn)基因大豆各選用150粒種子，放置于鋪有專用發(fā)芽濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，30粒/皿，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。發(fā)芽率測定期間，每天定時檢查保持濾紙濕潤。以胚根突破種皮，長度達到種子長度的1/2作為發(fā)芽標準，統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)量并計算發(fā)芽率。

上述所有測試數(shù)據(jù)均使用SPSS軟件進行統(tǒng)計學分析，差異顯著性用-test檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 高代VgDGAT1A轉(zhuǎn)基因大豆植株的DNA檢測

以高代轉(zhuǎn)基因大豆植株的核DNA為模板，PCR檢測基因 (1 828 bp)，凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物 (圖1)，在第7代大豆材料中，共檢測大豆植株2 000株，檢測出含轉(zhuǎn)基因的植株有1 988株，占99.4%，表明試驗用轉(zhuǎn)基因高代大豆材料已基本純合，且目的基因遺傳穩(wěn)定。

2.2 外源基因VgDGAT1A在大豆發(fā)育種子中的表達分析

檢測大豆發(fā)育種子總RNA提取質(zhì)量顯示，260/280范圍在1.97–2.01，條帶清晰、沒有彌散帶、質(zhì)量好，可以用于后續(xù)cDNA第一鏈合成及qRT-PCR實驗。對轉(zhuǎn)基因大豆根、莖、葉、花、豆莢和種子RNA樣品進行半定量RT-PCR檢測 (圖2)，僅在大豆種子中檢測到的高表達。這說明在高代轉(zhuǎn)基因大豆材料中目的基因按試驗設計僅在發(fā)育種子中有效高表達，且遺傳穩(wěn)定。對轉(zhuǎn)基因大豆種子發(fā)育不同階段樣品中的表達進行熒光定量PCR檢測(圖3)，結(jié)果顯示，基因表達隨種子發(fā)育呈現(xiàn)先升高再降低的單峰曲線。在大豆種子發(fā)育前期 (12–25 DAF) 和后期 (60 DAF)表達量低，在發(fā)育中期 (35–50 DAF) 高量表達。高量表達時期與大豆種子油脂快速積累時期相吻合，這預示著VgDGAT1A在轉(zhuǎn)基因大豆種子油脂合成積累過程起重要作用。

2.3 VgDGAT1A轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)育種子的DGAT酶活性檢測

我們前期研究已證明VgDGAT1A能夠催化二酰甘油 (DAG) 連接來自?；?CoA的脂肪酸?；扇８视?(TAG)[17-18]。為鑒定轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)育種子是否表達VgDGAT1A蛋白并正確行使催化功能，分別檢測了野生型Jack和T7代轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)育種子中的DGAT酶活性。不同的反應底物DAG和酰基-CoA分子分別用[14C]放射性標記。將萃取獲得的富集VgDGAT1酶蛋白的微體膜蛋白和放射性底物加入反應體系，通過檢測反應體系生成放射性TAG的多少和速率來測定DGAT酶活性 (圖4)。與非轉(zhuǎn)基因的野生型大豆相比，轉(zhuǎn)基因大豆種子中DGAT酶活性提高了約7.8倍左右。特別是以18:1-CoA和18:1-DAG為底物時，DGAT酶活性最高。這表明外源基因不僅穩(wěn)定高效表達，所編碼的蛋白也能正確生成，且具有極高的DGAT酶活性，尤其是對18:1-CoA有較高的底物選擇性。

圖1 VgDGAT1A轉(zhuǎn)基因大豆的PCR檢測

圖2 轉(zhuǎn)基因大豆VgDGAT1A基因在不同器官和組織中表達的半定量RT-PCR分析

圖3 轉(zhuǎn)基因大豆種子不同發(fā)育時期VgDGAT1A基因的表達水平

圖4 VgDGAT1A轉(zhuǎn)基因大豆與野生型Jack發(fā)育種子的DGAT酶活性檢測

2.4 VgDGAT1A轉(zhuǎn)基因大豆種子不同發(fā)育時期油脂成分的分析

為檢測外源超表達是否對大豆種子油脂成分產(chǎn)生影響，我們應用GC測試對照 (非轉(zhuǎn)基因野生型Jack和和空載體轉(zhuǎn)化大豆) 和高代轉(zhuǎn)基因種子不同發(fā)育時期油脂樣品主要脂肪酸含量。結(jié)果顯示 (圖5A–C)，與野生型 (Jack) 和空載體轉(zhuǎn)化樣品相比，轉(zhuǎn)基因大豆種子發(fā)育早期 (25 DAF) 各脂肪酸含量無明顯差異 (<0.01)。在種子發(fā)育中期 (45 DAF)，油酸 (C18:1Δ9) 含量上升，到后期時 (55 DAF) 油酸含量比對照提高了8.2%。然而，亞油酸 (C18:2Δ9,12)和亞麻酸 (C18:3Δ9,12,15) 含量在種子發(fā)育中期高于對照，在種子發(fā)育后期比對照分別降低4%和2%。棕櫚酸 (C16:0) 和硬脂酸 (C18:0) 含量在轉(zhuǎn)基因種子和對照種子間無顯著差異。轉(zhuǎn)基因大豆種子油酸含量提高和亞油酸及亞麻酸含量降低可明顯改善大豆油抗氧化性和營養(yǎng)品質(zhì)。

2.5 VgDGAT1A轉(zhuǎn)基因大豆種子總油脂、蛋白質(zhì)及淀粉含量的分析

為檢測超表達基因是否引起大豆種子油脂、蛋白質(zhì)及淀粉合成積累的變化，我們分別測試了T7代轉(zhuǎn)基因大豆株系收獲的成熟種子含油量、蛋白質(zhì)及淀粉含量。如圖6所示，與野生型 (Jack) 品種相比，轉(zhuǎn)基因大豆種子總油脂含量提高4%–9%，平均提高了5.1%。蛋白質(zhì)含量在對照 (含量39.94%) 和轉(zhuǎn)基因大豆種子間無顯著差異 (<0.05)，盡管部分轉(zhuǎn)基因株系的蛋白含量略高于對照1%左右。轉(zhuǎn)基因大豆種子淀粉含量比對照種子 (10%) 減少2%–3%。這表明在大豆種子特異高效表達顯著提高種子儲藏油脂合成積累，并沒有以降低蛋白質(zhì)合成為代價，而是引起淀粉合成減少。淀粉含量降低不影響大豆種子作為油脂和優(yōu)質(zhì)蛋白的市場價值。

圖5 大豆種子不同發(fā)育時期的油脂成分含量

圖6 VgDGAT1A轉(zhuǎn)基因大豆種子的油脂、蛋白質(zhì)和淀粉含量

2.6 VgDGAT1A轉(zhuǎn)基因大豆種子重量和發(fā)芽率的分析

為了分析種子特異超表達基因是否對大豆的產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀產(chǎn)生影響，進一步定量檢測了T7代轉(zhuǎn)基因大豆株系收獲的成熟種子百粒重和萌發(fā)率等表型。就百粒重而言 (圖7A)，轉(zhuǎn)基因大豆與野生型相比沒有顯著差異 (<0.01)，盡管有部分轉(zhuǎn)基因株系百粒重提高。種子萌發(fā)率測試 (圖7B–D) 表明，轉(zhuǎn)基因大豆與野生型相比無明顯差異。這些數(shù)據(jù)至少表明，種子特異超表達基因沒有對大豆種子重量和萌發(fā)等農(nóng)藝性狀造成負影響。

圖7 VgDGAT1A轉(zhuǎn)基因大豆與野生型Jack種子的百粒重及萌發(fā)率

3 討論

就大豆等普通油料作物而言，培育種子含油量和蛋白質(zhì)含量雙高的種質(zhì)，可顯著提高其作為優(yōu)異油脂和蛋白質(zhì)資源的市場價值，始終是油料作物遺傳改良的主要目標之一。然而，種子含油量和蛋白質(zhì)含量遺傳上呈負相關(guān)[26]，常規(guī)育種方法少有獲得高油或高蛋白種質(zhì)、且同時保持蛋白或種子油含量不降低。迄今，絕大多數(shù)商業(yè)化的大豆品種含油量和蛋白含量分別維持在20%和40%左右[27-28]。

為打破種子含油量和蛋白含量的負相關(guān)，不少研究致力于對參與油料作物油脂生物合成的相關(guān)酶及調(diào)節(jié)蛋白進行基因修飾。如前所述，控制TAG合成最后一步?；磻腄GAT酶基因是一個重要靶標。種子特異超表達DGAT導致油菜種子含油量提高2%–5%[8,11-12]，玉米種胚含油量提高12%–26%[13,29]。相應地，這些DGAT轉(zhuǎn)基因種子蛋白含量小幅降低。在大豆種子特異表達來自真菌拉曼毛霉的基因，種子含油量比對照提高1.5%，蛋白質(zhì)含量亦發(fā)生減少，盡管轉(zhuǎn)基因種子產(chǎn)量與對照相比沒有明顯差異[14]。在玉米籽粒中超表達來自真菌粗糙脈孢菌的基因，導致玉米籽粒含油量比對照 (4%)上升0.5%–0.9%，但對種子萌發(fā)及幼苗生長有負效應[29]。上述這些轉(zhuǎn)基因種子油脂肪酸成分未檢測到顯著改變。

商用大豆品種種子油脂肪酸組成中亞油酸 (18:2Δ9,12) 含量占總油脂50% 以上，這種高亞油酸的油脂易氧化，導致營養(yǎng)品質(zhì)減低。單不飽和的油酸 (18:1Δ9) 兼具飽和脂肪酸和多聚不飽和脂肪酸特性，富含油酸的油脂其抗氧化性和營養(yǎng)品質(zhì)最佳[30-31]。在提高大豆種子油含量的同時，若能大幅增加油酸含量，就可顯著提高大豆油的商業(yè)價值和健康營養(yǎng)功能。Zheng等在玉米種子胚中特異表達玉米本身DGAT1-2的高油等位基因，導致玉米籽粒含油量比野生型對照提高0.9%–1.3%，同時引起油酸含量上升18%，亞油酸含量減低13.7%[13]。美洲榛種子油含量為60%，其中油酸含量高達79%。將來自美洲榛的編碼CaDGAT1 的cDNA克隆在大豆體細胞胚中特異表達，體細胞胚含油量由野生型7.6%提高到10%–12%。與野生型相比，轉(zhuǎn)基因大豆體細胞油酸含量由17.9%上升到27%，而亞油酸含量相應降低了6%–9%[16]。將對油?；械孜锾禺愋缘拇蠖笹mDGAT1 (Glyma.17G053300) 突變體在大豆體細胞胚中表達，體細胞胚含油量提高了10%，收獲的成熟種子含油量比野生型提高了3%。而且種子蛋白含量未減，但可溶性碳水化合物含量降低了1.9%。與對照相比，成熟轉(zhuǎn)基因大豆種子油酸含量提高到23%–28%，亞油酸和亞麻酸含量分別減少4% 和6%[16]?？梢?，超表達DGAT提高種子油脂積累的幅度以及對脂肪酸組成、蛋白含量等其他農(nóng)藝性狀的影響大小在不同植物上的效應有差異，這可能與DGAT的來源、使用的種子特異啟動子、DGAT酶活性和受體植物種類不同有關(guān)。

本實驗室前期從一種野生菊科油料植物斑鳩菊發(fā)育種子中分離到編碼DGAT1的cDNA 克隆 ()，一系列試驗證明VgDGAT1A是迄今檢測的活性較高的一個DGAT酶蛋白，且對油?；?CoA有底物特異性[17-19,22]。本研究應用大豆儲藏蛋白Glysin種子特異啟動子驅(qū)動在大豆發(fā)育種子中超表達，對高代轉(zhuǎn)基因大豆株系表型分析顯示，成熟種子含油量比對照提高了5.1%，蛋白質(zhì)含量與對照無顯著差異 (<0.05) (圖6)，盡管部分轉(zhuǎn)基因系種子蛋白含量有所升高。這表明種子特異超表達外源基因，打破了大豆種子含油量和蛋白質(zhì)含量的負連鎖，顯著提高種子含油量并未以降低蛋白積累為代價。轉(zhuǎn)基因大豆種子含油量顯著提高，顯然得益于在種子發(fā)育中期即油脂快速合成積累期高量表達 (圖3) 和DGAT酶活性急劇增加 (圖4)。DGAT酶活性顯著提升，勢必催化更多的DAG和酰基-CoA分子生成TAG而擴充油脂庫容量。TAG貯存量擴大將促使上游更多的光合產(chǎn)物用于油脂合成，但油脂合成增加并未影響到用于蛋白質(zhì)合成的碳源供給。為檢測用于油脂合成增加所需的額外碳源是否來自于其他儲藏化合物合成的減少，我們測試了超表達的大豆成熟種子淀粉含量，與對照相比，淀粉含量平均減少了約3% (圖6)。與之相類似的是，Lardizabal等對轉(zhuǎn)基因大豆種子檢測發(fā)現(xiàn)寡聚糖類化合物相應降低[14]，以及Roesler等發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大豆可溶性碳水化合物含量降低[16]。多糖類化合物減少所節(jié)省的碳源很可能部分地用于種子油脂合成。未來仍需設計精細試驗分析超表達DGAT后種子內(nèi)部碳源是如何分配于不同物質(zhì)合成積累途徑的。

與上述Roesler等[16]報道相似，本研究還顯示，超表達的大豆成熟種子油脂肪酸成分發(fā)生了顯著改變。轉(zhuǎn)基因大豆種子油的油酸 (C18:1Δ9) 含量由對照18.1%提高到26.9%，相應地易氧化的亞油酸 (C18:2Δ9,12) 和亞麻酸 (C18:3Δ9,12,15) 分別減少6%和2% (圖5)。油酸含量提高可能與導入的VgDGAT1A酶蛋白對油?；?CoA底物有高選擇性相關(guān)。對轉(zhuǎn)基因大豆DGAT 酶活性檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因大豆的DGAT酶對18:1-CoA底物選擇性高于對照7倍多 (圖4)。顯然對18:1-CoA底物高選擇性來源于VgDGAT1A酶蛋白。該酶蛋白能高效地將新合成的18:1-CoA油?；苯友杆俎D(zhuǎn)移至DAG而生成更多的18:1-TAG，相應地減少了18:1-CoA油?；D(zhuǎn)入PC (Phosphatidylcholine) 分子，再經(jīng)FAD2 (Fatty acid desaturase 2) 和FAD3 (Fatty acid desaturase 3) 催化依次生成18:2和18:3-TAG的積累量。因此，應用DGAT策略改良油料作物時，最好選擇酶活性強且對油?；?CoA底物特異性高的DGAT酶。這樣就可獲得種子含油量和油酸含量均高的優(yōu)異種質(zhì)。DGAT1作為一種酶蛋白，在動物、植物、微生物細胞內(nèi)均存在和行使功能，未見報道該酶蛋白產(chǎn)生過敏反應[32]和DGAT1異源表達產(chǎn)生毒性反應[33]。此外，轉(zhuǎn)基因大豆種子百粒重和種子萌發(fā)率亦未顯負效應 (圖7)，預示著這些穩(wěn)定遺傳的優(yōu)異轉(zhuǎn)基因品系種子產(chǎn)量至少不低于對照的產(chǎn)量。下一步應進行多點多年的大田實驗，檢測這些品系產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀。

總之，種子特異超表達編碼高酶活性的基因顯著提高了大豆種子油含量，且打破了種子油脂含量與蛋白含量的負連鎖，未對蛋白質(zhì)合成積累和種子重量和萌發(fā)等農(nóng)藝性狀造成負影響。更為重要的是，轉(zhuǎn)基因大豆種子油脂抗氧化性和營養(yǎng)品質(zhì)顯著改善。本研究結(jié)果為全面解析大豆等油料作物種子油脂等儲藏物合成積累調(diào)控機制及遺傳改良提供了參考。

[1] Li RZ, Hatanaka T, Yu KS, et al. Soybean oil biosynthesis: role of diacylglycerol acyltransferases. Funct Integr Genomics, 2013, 13(1): 99–113.

[2] Qi WD, Shang MR. Research on China’s soybean industry development. Chin Agric Sci Bull, 2014, 30(17): 88–96 (in Chinese). 祁旺定, 尚明瑞. 中國大豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展問題研究. 中國農(nóng)學通報, 2014, 30(17): 88–96.

[3] Cases S, Stone SJ, Zhou P, et al. Cloning of DGAT2, a second mammalian diacylglycerol acyltransferase, and related family members. J Biol Chem, 2001, 276(42): 38870–38876.

[4] Lardizabal KD, Mai JT, Wagner NW, et al. DGAT2 is a new diacylglycerol acyltransferase gene family: purification, cloning, and expression in insect cells of two polypeptides fromwith diacylglycerol acyltransferase activity. J Biol Chem, 2001, 276(42): 38862–38869.

[5] Saha S, Enugutti B, Rajakumari S, et al. Cytosolic triacylglycerol biosynthetic pathway in oilseeds. Molecular cloning and expression of peanut cytosolic diacylglycerol acyltransferase. Plant Physiol, 2006, 141(4): 1533–1543.

[6] Yuan LX, Mao X, Zhao K, et al. Characterisation of phospholipid: diacylglycerol Acyltransferases (PDATs) fromand their roles in stress responses. Biol Open, 2017, 6(7): 1024–1034.

[7] Jako C, Kumar A, Wei YD, et al. Seed-specific over-expression of an Arabidopsis cDNA encoding a diacylglycerol acyltransferase enhances seed oil content and seed weight. Plant Physiol, 2001, 126(2): 861–874.

[8] Xu JY, Francis T, Mietkiewska E, et al. Cloning and characterization of an acyl-CoA-dependent() gene from, and a study of the functional motifs of the DGAT protein using site-directed mutagenesis to modify enzyme activity and oil content. Plant Biotechnol J, 2008, 6(8): 799–818.

[9] Zhang FY, Yang MF, Xu YN. Silencing ofin tobacco causes a reduction in seed oil content. Plant Sci, 2005, 169(4): 689–694.

[10] Liu ZJ, Zhang Y, Wang YM, et al. Construction and transformation of RNAi vector of genein upland cotton. J China Agric Univ, 2013, 18(5): 1–8 (in Chinese). 劉正杰, 張園, 王玉美, 等. 陸地棉基因干涉載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化. 中國農(nóng)業(yè)大學學報, 2013, 18(5): 1–8.

[11] Taylor DC, Zhang Y, Kumar A, et al. Molecular modification of triacylglycerol accumulation by over-expression ofto produce canola with increased seed oil content under field conditions. Botany, 2009, 87(6): 533–543.

[12] Weselake RJ, Shah S, Tang MG, et al. Metabolic control analysis is helpful for informed genetic manipulation of oilseed rape () to increase seed oil content. J Exp Bot, 2008, 59(13): 3543–3549.

[13] Zheng PZ, Allen WB, Roesler K, et al. A phenylalanine in DGAT is a key determinant of oil content and composition in maize. Nat Genet, 2008, 40(3): 367–372.

[14] Lardizabal K, Effertz R, Levering C, et al. Expression ofin seed increases oil in soybean. Plant Physiol, 2008, 148(1): 89–96.

[15] Wang ZK, Huang WJ, Chang JM, et al. Overexpression of SiDGAT1, a gene encoding acyl CoA: diacylglycerol acyltransferase from -. L. increases oil content in transgenic Arabidopsis and soybean. Plant Cell Tissue Organ Cult, 2014, 119(2): 399–410.

[16] Roesler K, Shen B, Bermudez E, et al. An improved variant of soybean type 1 diacylglycerol acyltransferase increases the oil content and decreases the soluble carbohydrate content of soybeans. Plant Physiol, 2016, 171(2): 878–893.

[17] Yu KS, McCracken CT Jr, Li RZ, et al. Diacylglycerol acyltransferases fromandprefer substrates with vernolic acid. Lipids, 2006, 41(6): 557–566.

[18] Yu KS, Li RZ, Hatanaka T, et al. Cloning and functional analysis of two type 1 diacylglycerol acyltransferases from. Phytochemistry, 2008, 69(5): 1119–1127.

[19] Li RZ, Yu KS, Hatanaka T, et al.DGATs increase accumulation of epoxy fatty acids in oil. Plant Biotechnol J, 2010, 8(2): 184–195.

[20] Yuan LX, Mao X, Gao CY, et al. Seed-specific over-expression of a diacylglycerol acyltransferase 1 gene () increase seed oil accumulation in. Plant Physiol J, 2015, 51(5): 668–678 (in Chinese). 苑麗霞, 毛雪, 高昌勇, 等. 種子特異表達二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因()提高亞麻薺種子油脂積累. 植物生理學報, 2015, 51(5): 668–678.

[21] Wang AK. Sudy on genetic transformation and expression ofin cotton (L.)[D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2013 (in Chinese). 王安可. 棉花轉(zhuǎn)VgDGAT1基因的遺傳轉(zhuǎn)化和表達研究[D]. 杭州: 浙江大學, 2013.

[22] Gao CY, Mao X, Shang HQ, et al. Enhanced oil accumulation in tobacco (L.) leaves by ectopic overexpression offor renewable biofuel oil. Curr Sci, 2018, 114(6): 1246.

[23] Li RZ, Yu KS, Wu YM, et al.DGATs can complement the disrupted oil and protein metabolism in epoxygenase-expressing soybean seeds. Metab Eng, 2012, 14(1): 29–38.

[24] Murray MG, Thompson WF, Wendel JF, et al. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res, 1980, 8(19): 4321–4325.

[25] Li RZ, Yu KS, Hildebrand DF.,andexpression in seeds and other tissues of epoxy and hydroxy fatty acid accumulating plants. Lipids, 2010, 45(2): 145–157.

[26] Clemente TE, Cahoon EB. Soybean oil: genetic approaches for modification of functionality and total content. Plant Physiol, 2009, 151(3): 1030–1040.

[27] Eskandari M, Cober ER, Rajcan I. Genetic control of soybean seed oil: II. QTL and genes that increase oil concentration without decreasing protein or with increased seed yield. Theor Appl Genet, 2013, 126(6): 1677–1687.

[28] Sonah H, O'Donoughue L, Cober E, et al. Identification of loci governing eight agronomic traits using a GBS-GWAS approach and validation by QTL mapping in soya bean. Plant Biotechnol J, 2015, 13(2): 211–221.

[29] Oakes J, Brackenridge D, Colletti R, et al. Expression of fungalgenes to increase kernel oil in maize. Plant Physiol, 2011, 155(3): 1146–1157.

[30] Gillingham LG, Harris-Janz S, Jones PJH. Dietary monounsaturated fatty acids are protective against metabolic syndrome and cardiovascular disease risk factors. Lipids, 2011, 46(3): 209–228.

[31] Brink J, Ludtke SJ, Kong YF, et al. Experimental verification of conformational variation of human fatty acid synthase as predicted by normal mode analysis. Structure, 2004, 12(2): 185–191.

[32] Leamy AK, Hasenour CM, Egnatchik RA, et al. Knockdown of triglyceride synthesis does not enhance palmitate lipotoxicity or prevent oleate-mediated rescue in rat hepatocytes. Biochim Biophys Acta (BBA)-Mol Cell Biol Lipids, 2016, 1861(9): 1005–1014.

[33] Liu L, Shi XJ, Bharadwaj KG, et al. DGAT1 expression increases heart triglyceride content but ameliorates lipotoxicity. J Biol Chem, 2009, 284(52): 36312–36323.

(本文責編 郝麗芳)

Seed-specific expression of heterologous geneincrease soybean seed oil content and nutritional quality

Fei Zhang1, Xiuqing Gao2, Jingjie Zhang2, Baoling Liu2, Hongmei Zhang1, Jinai Xue2, and Runzhi Li2

1 College of Life Science, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China 2 Institute of Molecular Agriculture and Bioenergy, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China

Enhancing soybean () oil production is crucial to meet the market demand of vegetable oil. Diacylglycerol acyltransferase (DGAT) catalyzes the final acylation reaction of triacylglycerol (TAG) synthesis, acting as one of the rate-limiting enzymes for oil biosynthesis in plant seeds. Here, a cDNA cloneencoding the DGAT1 protein was isolated from the high oil plant.was specifically overexpressed in soybean seeds, and several high-generation transgenic lines (T7) were obtained by continuous selection. qPCR analysis showed thatwas highly expressed in the mid-development stage (30–45 DAF) of the transgenic seeds. Accordingly, the DGAT enzyme activity in the transgenic seeds was increased by 7.8 folds in comparison with the wild-type controls. Seed oil and starch contents were, respectively, increased by 5.1% (Dry weight) and reduced by 2%–3% in the transgenic soybeans. Importantly, protein content was not significantly different between transgenic and control seeds. Seed weight and germination rate of the transgenic lines exhibited no negative effect. Fatty acid profiling demonstrated that antioxidant oleic acid (C18:1Δ9) content in the transgenic seed oil was elevated by 8.2% compared to the control, and correspondingly, easily-oxidized linoleic acid (C18:2Δ9,12) and linolenic acid (C18:3Δ9,12,15) were decreased by 6% and 2% respectively. Taken together, seed-specific overexpression of an exogenousgene can break the negative linkage of oil and protein contents in soybean seeds, indicating that engineering of this highly-active DGAT enzyme is an effective strategy to improve oil yield and nutritional value in oilseeds.

soybean (),, seed nutritional quality, diacylglycerol acyltransferase 1 (DGAT1), seed-specific expression, fatty acid and oil content

June 8, 2018;

July 20, 2018

National Natural Science Foundation of China (Nos. 30971806, 31201266, 31401430), National Department of Agriculture “948” Program (No. 2014-Z39), Coal-based Key Sci-Tech Project of Shanxi Province, China (No. FT-2014-01), Key Project of The Key Research and Development Program of Shanxi Province, China (No. 201603D312005), Research Project Supported by Shanxi Scholarship Council of China (No. 2015-064).

Hongmei Zhang. Tel: +86-354-6286908; E-mail: tgzhhm@163.com Runzhi Li. Tel: +86-354-6288344; E-mail: rli2001@126.com

10.13345/j.cjb.180236

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