龍夢嫻，譚瑤瑤，劉柯柯，吳玉嬌，呂青，潘國慶，周澤揚(yáng),2

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家蠶微孢子蟲極管蛋白1 (NbPTP1)在果蠅S2細(xì)胞中的表達(dá)與糖基化修飾

龍夢嫻1，譚瑤瑤1，劉柯柯1，吳玉嬌1，呂青1，潘國慶1，周澤揚(yáng)1,2

1 西南大學(xué) 家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室，重慶 400715 2 重慶師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400047

龍夢嫻, 譚瑤瑤, 劉柯柯, 等. 家蠶微孢子蟲極管蛋白1 (NbPTP1) 在果蠅S2細(xì)胞中的表達(dá)與糖基化修飾. 生物工程學(xué)報, 2018, 34(9): 1460–1468.Long MX, Tan YY, Liu KK, et al. Expression of Polar Tube Protein 1 (NbPTP1) from Nosema bombycis in Drosophila S2 cell lines and its glycosylation. Chin J Biotech, 2018, 34(9): 1460–1468.

極管蛋白（Polar tube protein）是極管的主要成分，能特異性定位于微孢子蟲極管，在微孢子蟲侵染宿主過程中發(fā)揮重要作用。文中分析了家蠶微孢子蟲極管蛋白1中潛在的O-、N-糖基化修飾位點，克隆了家蠶微孢子蟲極管蛋白1全基因序列，并將其插入帶有V5和His標(biāo)簽的真核表達(dá)載體pMT/Bip/V5-His A中，成功構(gòu)建了pMT/Bip/V5-His A-NbPTP1重組質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)NbPTP1基因能在果蠅細(xì)胞中高效表達(dá)。此外，Lectin blotting和β-消除反應(yīng)分析結(jié)果表明：果蠅S2細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的NbPTP1具有O-糖基化修飾特征。以上結(jié)果為研究NbPTP1的糖基化修飾特征與其功能之間的關(guān)系提供了基礎(chǔ)，有助于揭示微孢子蟲侵染機(jī)制，建立可行有效的微孢子蟲病診斷和防治措施。

極管蛋白1，果蠅S2細(xì)胞，糖基化,家蠶微孢子蟲

微孢子蟲是一類宿主廣泛的細(xì)胞內(nèi)專性寄生的單細(xì)胞真核生物[1-3]。迄今已發(fā)現(xiàn)約有200個屬，1 400多種微孢子蟲[4-5]，然而不同種屬微孢子蟲擁有相似的侵染器官和侵染機(jī)制。未侵染宿主的微孢子蟲，其極管能有序地盤繞在孢子內(nèi)部；侵染宿主時，成熟孢子能感知外界環(huán)境變化并觸發(fā)極管，長而中空的極管具有強(qiáng)力彈射和類似“注射器”的功能，能在不足兩秒時間內(nèi)完成整個彈出、刺入宿主細(xì)胞、運(yùn)輸孢原質(zhì)的過程[6-8]。

極管蛋白 (Polar tube protein) 能特異定位于微孢子蟲極管上，是組裝極管的重要成分。目前發(fā)現(xiàn)至少存在5種主要的極管蛋白 (PTP1、PTP2、PTP3、PTP4和PTP5)，其中PTP1的含量約占極管蛋白總量的70%[5,9-12]。不同來源的PTP1溶解性驚人相似，它們易溶于DTT、β-巰基乙醇等還原劑，不溶于SDS、尿素、氯仿等有機(jī)溶劑[12-15]；然而其氨基酸序列同源性較低，脯氨酸和半胱氨酸殘基的位置和數(shù)量卻相對保守。脯氨酸是一個疏水性的氨基酸，其環(huán)狀結(jié)構(gòu)可在多肽中形成緊密結(jié)構(gòu)使肽鏈具有一定的硬度，PTP1蛋白序列中高豐度的脯氨酸能使蛋白質(zhì)具有如膠原蛋白、彈性蛋白一樣的抗張強(qiáng)度、彈力和收縮力，這一蛋白特性將有助于微孢子蟲的極管彈出和孢原質(zhì)輸出[4,16]。

微孢子蟲在侵染宿主過程中，超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)極管刺入宿主細(xì)胞時，宿主細(xì)胞膜會發(fā)生內(nèi)陷，但此過程中極管與宿主細(xì)胞膜之間互作的分子機(jī)制尚未闡明[9,17]。微孢子蟲能瞬間完成整個侵染過程，其中宿主細(xì)胞膜上一定存在能識別極管的受體，最新的研究發(fā)現(xiàn)海倫微孢子蟲極管蛋白4 (EhPTP4) 能與宿主表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體發(fā)生相互作用從而介導(dǎo)微孢子蟲對宿主的侵染[18]。Xu等發(fā)現(xiàn)海倫微孢子蟲EhPTP1能結(jié)合凝集素ConA，且經(jīng)PNGase F酶處理后的EhPTP1仍能與ConA結(jié)合，說明PTP1具有O-糖基化修飾而不具有N-糖基化修飾，并且兔腦炎微孢子蟲EcPTP1能夠被3H-Mannose標(biāo)記，說明EcPTP1是一個O-甘露糖基化修飾蛋白[19-22]。利用甘露糖處理兔腎細(xì)胞RK13后，海倫微孢子蟲對其侵染率明顯低于未處理組，說明甘露糖封閉了宿主細(xì)胞表面的甘露糖結(jié)合位點，使微孢子蟲極管上的PTP1蛋白無法結(jié)合宿主表面受體而降低了微孢子蟲的感染率[19]。

家蠶微孢子蟲是微孢子蟲屬的典型種，其快速的水平傳播和垂直傳播所引發(fā)的家蠶微粒子病給我國乃至世界養(yǎng)蠶業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。前期我們已經(jīng)成功地獲得了家蠶微孢子蟲NbPTP1原核表達(dá)蛋白及其抗體[23]，為了更好地研究具有翻譯后修飾的家蠶微孢子蟲極管蛋白1的功能，本研究采用果蠅S2表達(dá)系統(tǒng)，真核表達(dá)具有糖基化修飾的NbPTP1。對極管蛋白1開展深入研究有利于揭示微孢子蟲侵染的關(guān)鍵機(jī)制，建立行之有效的微孢子蟲病診斷和防治措施。

1 材料與方法

1.1 材料

pMT/Bip/V5-His A 載體、果蠅S2細(xì)胞購自Invitrogen公司；菌種DH5α為本實驗室保存；酶、T4 DNA連接酶購自TaKaRa 公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自Qiagen公司；各種限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；HRP-ConA購于Sigma公司；NbPTP1兔源多克隆抗體由本實驗室制備，V5鼠源單克隆抗體購自Abcam公司；X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑購自Roche公司；DNA Marker、ECL蛋白Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物合成與DNA測序由生工生物工程 (上海) 股份有限公司進(jìn)行。家蠶微孢子蟲CQ1分離株，由家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室病原微生物學(xué)研究組分離，保存于中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心 (CVCC)，保藏號：CVCC102059。

1.2 糖基化修飾位點分析

利用在線工具NetOGlyc 4.0 Server (http:// www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/) 和NetNGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) 在家蠶微孢子蟲數(shù)據(jù)庫中SilkPathDB (http:// silkpathdb.swu.edu.cn/) 分別分析家蠶微孢子蟲極管蛋白1序列中O-糖基化修飾位點和N-糖基化修飾位點。

1.3 表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)獲得的家蠶微孢子蟲極管蛋白基因序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計特異引物 F (5′-GG AAACATGGCATGTTCACCCGG-3′，下劃線為Ⅱ酶切位點) 和引物R (5′-CCGGTTTAGCACACATGGATTAT-3′，下劃線為Ⅰ酶切位點)，以家蠶微孢子蟲基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃終止。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用膠回收試劑盒回收目的條帶。將回收的PCR產(chǎn)物與載體pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化DH5α進(jìn)行T克隆。對陽性克隆pMD19- NbPTP1進(jìn)行雙酶切和PCR驗證后送生工生物工程 (上海) 股份有限公司測序。

分別用Ⅱ和Ⅰ雙酶切pMD19-NbPTP1質(zhì)粒和pMT/Bip/V5-His A質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳分離后，膠回收試劑盒分別回收NbPTP1基因片段和pMT/Bip/V5-His A載體片段，將基因與載體片段連接后，轉(zhuǎn)化DH5α進(jìn)行亞克隆。對陽性克隆進(jìn)行pMT/Bip/V5-His A-NbPTP1雙酶切和PCR驗證。

1.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞與融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

利用無內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取試劑盒抽提重組表達(dá)質(zhì)粒pMT/Bip/V5-His A-NbPTP1和空載對照pMT/Bip/V5-His A。按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，過程如下：分別將2 μg DNA質(zhì)粒 (pMT/Bip/ V5-His A-NbPTP1和空載對照pMT/Bip/V5-His A) 溶于200 μL無血清的Schneider’sMedium中，混勻后，將制備好的DNA與6 μL脂質(zhì)體輕輕混合均勻，即為包裹好的脂質(zhì)體DNA，室溫放置30 min；制備好的脂質(zhì)體/DNA小心滴加至S2細(xì)胞表面 (2.5×106個細(xì)胞／孔)，置于28 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h。轉(zhuǎn)染 24 h 后，加入終濃度 500 μmol/L 的CuSO4進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，轉(zhuǎn)染72 h后收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.5 融合蛋白鑒定

別收集轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pMT/Bip/V5-His A-NbPTP1和空載質(zhì)粒pMT/Bip/V5-His A的細(xì)胞，經(jīng)3 000 r/min離心5 min，分離細(xì)胞上清和沉淀。沉淀溶于RIPA緩沖液中，4 ℃溶解10 min后，12 000 r/min離心10 min取上清。采用12% SDS-PAGE和Western blotting檢測NbPTP1基因在果蠅S2細(xì)胞中的表達(dá)。

1.6 融合蛋白的糖基化修飾分析

Lectin blotting分析將細(xì)胞表達(dá)融合蛋白樣品經(jīng)12% SDS-PAGE后, 通過電轉(zhuǎn)移方法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，膜用含2% (/) Tween-20的PBS緩沖液室溫封閉2 min；將膜用PBS緩沖液洗2次；用1 μg/mL的HRP-Con A室溫孵育16 h；用PBS緩沖液洗去多余的HRP-Con A，ECL顯色。

參考Xu等[19]的β-消除方法，利用5 μL的0.1 mol/L NaOH溶液，分別與適量的家蠶微孢子蟲天然PTP1蛋白和果蠅S2細(xì)胞表達(dá)的PTP1融合蛋白混合，在45 ℃下反應(yīng)20 min和30 min后，置冰上并迅速加入1 μL 10%醋酸溶液終止反應(yīng)。Western blotting和Lectin blotting方法分析NbPTP1在家蠶微孢子蟲和果蠅S2細(xì)胞中糖基化修飾特征。利用Image J軟件分析蛋白質(zhì)含量，設(shè)反應(yīng) 0 min的蛋白含量為100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 NbPTP1糖基化修飾位點分析

根據(jù)糖基化修飾位點分析結(jié)果 (圖1) 發(fā)現(xiàn)，NbPTP1蛋白序列上存在3個潛在的O-糖基化位點，分別為位于22位氨基酸的甲硫氨酸、位于26位和108位氨基酸的脯氨酸；其序列中無任何N-糖基化位點。依據(jù)前期報道[23]，NbPTP1蛋白序列的N端前20個氨基酸組成了信號肽，去除基因信號肽后的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pMT/Bip/ V5-His A-NbPTP1并不影響其蛋白的翻譯后修飾，應(yīng)存在3個潛在的O-糖基化修飾位點，而無潛在的N-糖基化修飾位點。

2.2 融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)家蠶微孢子蟲基因組數(shù)據(jù)庫，由于NbPTP1基因內(nèi)不存在內(nèi)含子，因此以家蠶微孢子蟲基因組DNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，獲得長度約為1 200 bp的NbPTP1基因。并將獲得的DNA片段與載體pMD19-T連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌落PCR 擴(kuò)增驗證正確后，通過基因測序進(jìn)一步確認(rèn)克隆構(gòu)建成功。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pMD19-NbPTP1與載體pMT/Bip/V5-His A通過Ⅱ和Ⅰ雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，利用PCR和雙酶切的方法對陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行驗證 (圖2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性重組質(zhì)粒pMT/Bip/V5-His A-NbPTP1中目的基因片段、載體片段與理論大小一致。

2.3 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

將融合蛋白表達(dá)重組質(zhì)粒pMT/Bip/V5-His A-NbPTP1和空載對照質(zhì)粒pMT/Bip/V5-His A瞬時轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞，經(jīng)CuSO4誘導(dǎo)后, Western blotting檢測結(jié)果見圖3。由圖3A可知，NbPTP1抗體能特異性識別重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞后的胞內(nèi)成分，分子量大小約為55 kDa，比理論分子量偏大約15 kDa，暗示其蛋白進(jìn)行了翻譯后修飾。而無論是空載對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清表達(dá)和胞內(nèi)表達(dá)，還是重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清表達(dá)均無識別信號，說明pMT/Bip/V5-His A-NbPTP1瞬時轉(zhuǎn)染S2細(xì)胞后只在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，未分泌到細(xì)胞上清中。此外，經(jīng)一抗二抗去除液處理后，PVDF膜上的NbPTP1抗體已被成功洗脫。隨后利用V5抗體對同一PVDF膜上的蛋白質(zhì)進(jìn)行雜交，發(fā)現(xiàn)V5抗體也能識別果蠅S2細(xì)胞中胞內(nèi)表達(dá)的融合蛋白，且與NbPTP1抗體雜交的條帶一致 (圖3B)，說明果蠅S2細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的NbPTP1融合蛋白帶有V5標(biāo)簽，由于V5標(biāo)簽和His標(biāo)簽位于同一開放閱讀框內(nèi)，暗示His標(biāo)簽也成功融合表達(dá)在重組蛋白中，可用于后續(xù)融合蛋白純化。

圖1 NbPTP1氨基酸序列分析

圖2 重組質(zhì)粒pMT/Bip/V5-His A-NbPTP1的檢測

圖3 Western blotting分析NbPTP1在果蠅S2細(xì)胞中的表達(dá)

2.4 融合蛋白的糖基化修飾分析

根據(jù)NbPTP1序列分析發(fā)現(xiàn)其具有潛在的糖基化修飾特征，利用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的ConA，結(jié)合Lectin blotting檢測方法，分析果蠅S2細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的NbPTP1融合蛋白糖基化修飾特征。由圖4A可知，HRP標(biāo)記的ConA可以在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒的細(xì)胞上清及胞內(nèi)表達(dá)物中分別識別多條具有糖基化修飾的蛋白條帶。但被ConA識別的蛋白條帶中，僅有55 kDa蛋白條帶最清晰，且蛋白濃度最大。經(jīng)一抗、二抗去除液處理后，PVDF膜上的HRP-ConA已被成功洗脫。隨后利用V5抗體對同一PVDF膜上的蛋白質(zhì)進(jìn)行雜交，結(jié)合圖4B的Western blotting檢測結(jié)果，此55 kDa蛋白條帶既能被HRP標(biāo)記的ConA識別也能被V5標(biāo)簽抗體識別，說明該 55 kDa蛋白條帶為融合表達(dá)的NbPTP1蛋白，而其他未能被V5抗體識別的條帶應(yīng)為果蠅S2細(xì)胞自身表達(dá)的糖蛋白。因此，融合表達(dá)的NbPTP1蛋白具有糖基化修飾。

2.5 融合蛋白的O-糖基化特征分析

前期研究發(fā)現(xiàn)海倫微孢子蟲EhPTP1和腦炎微孢子蟲EcPTP1均具有O-糖基化修飾，而不具有N-糖基化修飾[19-22]；同時我們發(fā)現(xiàn)家蠶微孢子蟲天然極管蛋白1具有O-糖基化修飾特征 (未發(fā)表)。因此，利用β-消除法對果蠅S2細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的NbPTP1融合蛋白O-糖基化修飾進(jìn)行了分析。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不論是天然的NbPTP1還是果蠅S2細(xì)胞表達(dá)的NbPTP1融合蛋白，經(jīng)過0.1 mol/L NaOH處理不同時間后，PTP1總蛋白量有所減少；經(jīng)一抗、二抗去除液處理后，Lectin blotting檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTP1蛋白中的糖蛋白含量也會隨反應(yīng)時間延長而降低，但糖消除速度明顯快于蛋白降解速度 (圖5)。說明果蠅S2細(xì)胞表達(dá)的NbPTP1與天然PTP1一樣，均具有O-糖基化修飾，且ConA可以結(jié)合在O-糖鏈上。

圖4 Lectin blotting分析果蠅S2細(xì)胞中表達(dá)NbPTP1的糖基化修飾

3 討論

自1857年Nageli從病蠶中分離到第一個微孢子蟲起，研究人員對微孢子蟲的形態(tài)結(jié)構(gòu)、分類、侵染機(jī)制等方面進(jìn)行了大量研究。微孢子蟲宿主域廣、種類繁多，不同種屬微孢子蟲均擁有一個獨特的侵染器官——極管。

圖5 家蠶微孢子蟲天然NbPTP1與果蠅S2細(xì)胞中表達(dá)NbPTP1的O-糖基化修飾特征

極管蛋白1作為微孢子蟲中第一個被鑒定的能定位于極管上的蛋白，其含量最為豐富，也是目前研究的最為透徹的極管蛋白。隨著各微孢子蟲基因組測序工作相繼完成[24-25]，發(fā)現(xiàn)各種屬微孢子蟲極管蛋白1的序列中N端均具有信號肽、富含脯氨酸、具有糖基化修飾等特征。研究發(fā)現(xiàn)，EhPTP1和EcPTP1均具有O-甘露糖基化修飾，并且證實極管蛋白1的糖基化修飾與微孢子蟲對宿主的侵染有密切聯(lián)系[9,16-17]。蛋白質(zhì)的糖基化修飾在許多病原真菌侵染宿主的過程中起著粘附、侵染和維持穩(wěn)定等重要作用[26]。自然界中許多病原都具有類似侵染機(jī)制，如添加外源糖可以降低動物體內(nèi)病原細(xì)菌的粘附宿主細(xì)胞能力，從而阻止病原侵染[27]。對于腸道原蟲，它們大多利用自身表面糖蛋白粘附宿主上的粘膜細(xì)胞進(jìn)而侵染宿主[28-29]。推測微孢子蟲極管蛋白1的O-糖基化修飾可能在保護(hù)自身極管免受宿主細(xì)胞消化或與宿主細(xì)胞膜上的甘露糖受體發(fā)生相互作用的過程中發(fā)揮功能，從而促進(jìn)微孢子蟲對宿主的侵染[19,30-31]。

由于蛋白溶解性極差，使得從微孢子蟲中分離純化天然極管蛋白1并進(jìn)行后續(xù)功能研究變得十分艱難。另外，微孢子蟲具有一層厚而堅固的孢壁，加之其嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生，現(xiàn)有的遺傳操作體系在微孢子蟲體內(nèi)均無法實施，因此，微孢子蟲中蛋白質(zhì)功能研究進(jìn)展相對緩慢。為了更好地研究NbPTP1功能，前期我們已經(jīng)成功地對其進(jìn)行了原核表達(dá)，制備了相應(yīng)的多克隆抗體，但原核表達(dá)的NbPTP1蛋白并不能真實反映家蠶微孢子蟲極管蛋白的天然折疊及翻譯后修飾特征，對后續(xù)研究其功能造成了阻礙。目前，家蠶微孢子蟲也可以通過酵母表達(dá)系統(tǒng)異源表達(dá)相關(guān)蛋白，研究其功能[32]；然而，酵母表達(dá)時常出現(xiàn)表達(dá)的蛋白發(fā)生自剪切的情況。與酵母表達(dá)系統(tǒng)相比，果蠅S2表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合了哺乳動物細(xì)胞和昆蟲表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點，培養(yǎng)條件要求低，生長周期短，是一種成本低廉、容易操作的高效表達(dá)系統(tǒng)。本研究利用果蠅S2細(xì)胞表達(dá)家蠶微孢子蟲的極管蛋白1，能表達(dá)既具有天然構(gòu)象、又具有翻譯后糖基化修飾的蛋白，為后續(xù)NbPTP1的功能研究奠定基礎(chǔ)。

本研究是首次利用果蠅S2異源真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)家蠶微孢子蟲的極管蛋白。結(jié)果表明，NbPTP1蛋白在果蠅S2細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)，其分子量比理論分子量偏大約15 kDa，通常情況下發(fā)生翻譯后修飾的蛋白質(zhì)都會比其理論分子量大；并且表達(dá)的蛋白能夠被ConA抗體識別，說明其具有糖基化修飾特征；β-消除反應(yīng)后果蠅S2細(xì)胞表達(dá)的NbPTP1上糖鏈被消去的速度明顯快于總蛋白的降解速度，說明果蠅S2細(xì)胞表達(dá)的NbPTP1融合蛋白與家蠶微孢子蟲天然PTP1蛋白一致，都是O-糖基化蛋白；融合蛋白具有V5、His標(biāo)簽便于后續(xù)蛋白純化。然而，此融合蛋白的表達(dá)還存在一些不足之處，需要在后續(xù)實驗中改進(jìn)：1) 果蠅S2表達(dá)系統(tǒng)所用載體pMT/Bip/V5-His A中Bip序列是一個分泌型信號，能使表達(dá)的目的蛋白分泌到細(xì)胞上清中，無需裂解細(xì)胞就能獲得大量的目的蛋白[33]。在昆蟲表達(dá)系統(tǒng)中提高異源蛋白分泌表達(dá)的一大策略就是使用一個昆蟲特異的信號肽來替代異源蛋白信號肽[34]，然而并非所有信號肽的替換都能成功地將異源蛋白表達(dá)至細(xì)胞上清中[35]，此外更換信號肽對某些特定蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)程度并無任何影響[36]。我們的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，去除了目的蛋白NbPTP1的信號肽，僅靠Bip序列并不能將表達(dá)的目的蛋白分泌到細(xì)胞上清中，因此后續(xù)會優(yōu)化信號肽序列與表達(dá)條件。2) 可建立穩(wěn)定表達(dá)NbPTP1的細(xì)胞系，讓蛋白在細(xì)胞上清中持續(xù)分泌表達(dá)，利于大規(guī)模的連續(xù)生產(chǎn)[37-38]。3) 可利用融合蛋白帶有His標(biāo)簽的特征，對表達(dá)的NbPTP1蛋白進(jìn)行分離純化，進(jìn)行后續(xù)糖基化修飾位點、糖鏈特征鑒定及其功能分析。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Expression of Polar Tube Protein 1 (NbPTP1) frominS2 cell lines and its glycosylation

Mengxian Long1, Yaoyao Tan1, Keke Liu1, Yujiao Wu1, Qing Lü1, Guoqing Pan1, and Zeyang Zhou1,2

1 State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University, Chongqing 400715, China 2 College of Life Sciences, Chongqing Normal University, Chongqing 400047, China

The polar tube protein is the major component of polar tube, and can specifically locate on the polar tube of microsporidia and plays an important role in invasion host cell. In this study, we analyzed the potential O- and N- glycosylation sites in polar tube protein 1 from. NbPTP1 was successfully cloned to eukaryotic expression vector pMT/Bip/V5-His A, involved V5 and His tags. After transfection,gene could be efficiently expressed inS2 cells. In addition, Lectin blotting and beta elimination analysis showed that NbPTP1 expressed inS2 cells was O-glycosylation. These studies provided a basis for understanding the relationship between glycosylation and function of NbPTP1, helped us to reveal the infection mechanism of microsporidia and established effective diagnosis and prevention methods for microsporidia.

polar tube protein 1,S2 cells, glycosylation,

December 4, 2017;

April 25, 2018

National Natural Science Foundation of China (Nos. 31402138, 31601678), Chongqing Research Program of Basic Research and Frontier Technology (No. cstc2018jcyjAX0550), Fundamental Research Funds for the Central Universities (Nos. XDJK2015B031, XDJK2018AA001), Start-up Grant from Southwest University (No. SWU111081).

Zeyang Zhou. Tel: +86-23-68251088; E-mail: zyzhou@swu.edu.cn

10.13345/j.cjb.170478

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 31402138, 31601678)，重慶市基礎(chǔ)科學(xué)與前沿探索項目 (No. cstc2018jcyjAX0550)，中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費 (Nos. XDJK2015B031, XDJK2018AA001)，西南大學(xué)博士基金 (No. SWU111081)資助。