王艷寧 王旭光 張 珉 韓 瑩 吳 凡

(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110034)

動(dòng)脈粥樣硬化是一個(gè)包括免疫系統(tǒng)、血管細(xì)胞及某些器官的慢性炎癥性疾病〔1〕。目前已知內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化炎癥過(guò)程中起著決定性的作用，最近研究也證實(shí)許多組織和器官能產(chǎn)生一些可溶的炎性介質(zhì)〔2〕。一些細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子可調(diào)節(jié)炎癥進(jìn)程，同時(shí)內(nèi)分泌激素也參與了炎癥活動(dòng)〔3，4〕，腎素-血管緊張素(Ang)-醛固酮系統(tǒng)(RASS)在其中起到了重要作用〔5〕。AngⅡ是RASS中的活性肽產(chǎn)物，參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展〔6〕。巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)是許多急性和慢性炎癥性疾病的前炎癥調(diào)節(jié)因子，能抑制巨噬細(xì)胞的游走，促進(jìn)巨噬細(xì)胞在炎癥局部浸潤(rùn)，也是體內(nèi)唯一能對(duì)糖皮質(zhì)激素的抗炎性作用起負(fù)調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)〔7〕。本研究觀察AngⅡ能否調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞MIF的表達(dá)，同時(shí)觀察AngⅡ?qū)IF表達(dá)的調(diào)節(jié)是否能通過(guò)核因子(NF)-κB通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1主要材料 THP-1細(xì)胞是由日本山梨大學(xué)醫(yī)學(xué)部分子病理教研室惠贈(zèng)。胎牛血清購(gòu)于天津TBD公司，RPMI1640購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司，AngⅡ購(gòu)于美國(guó)CS BIO公司，吡咯烷二硫代氨基甲酸銨(PDTC)、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒、佛波酯、核漿蛋白抽提試劑盒、Histon H3抗體購(gòu)于上海碧云天公司，CD68抗體購(gòu)于福州邁新公司，NF-κBp65抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，real time RT-PCR試劑盒和RNA抽提試劑盒購(gòu)于大連寶生物公司，PCR引物為Invitrogen公司合成。

1.2THP-1來(lái)源的巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 THP-1細(xì)胞的培養(yǎng)：將THP-1細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃及5%CO2條件下培養(yǎng)。THP-1細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)。將THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞：在含有THP-1細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入50 ng/ml的佛波酯，培養(yǎng)48 h，可見(jiàn)大部分THP-1懸浮細(xì)胞分化成貼壁生長(zhǎng)的巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞的鑒定：在培養(yǎng)皿中放入蓋玻片，THP-1細(xì)胞經(jīng)佛波酯刺激后貼壁生長(zhǎng)。48 h后將細(xì)胞取出，以4%多聚甲醛固定30 min后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，一抗為CD68，4℃過(guò)夜，吸出一抗后磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗干凈加入二抗，室溫孵育1 h，PBS沖洗干凈，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色。CD68染色陽(yáng)性的即為巨噬細(xì)胞。

1.3分組方法 THP-1細(xì)胞經(jīng)佛波酯刺激轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞后進(jìn)行分組。第一組包括對(duì)照組、AngⅡ 1×10-8mol/L組、AngⅡ 1×10-7mol/L組、AngⅡ 1×10-6mol/L組、AngⅡ 1×10-5mol/L組共5份。第二組包括對(duì)照組、AngⅡ(1×10-6mol/L)組、AngⅡ(1×10-6mol/L)+PDTC組、PDTC組共4份。AngⅡ+PDTC組先用1×10-5mol/L PDTC刺激30 min，再加入AngⅡ，作用時(shí)間為24 h。PDTC是NF-κB的特異性阻斷劑。

1.4Western印跡檢測(cè)巨噬細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的表達(dá) 核漿蛋白分離：操作步驟按照核漿蛋白分離試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。蛋白濃度的測(cè)定(BCA法)：將蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制成25 mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋至終濃度為0.5 mg/ml。按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B配制適量BCA工作液。標(biāo)準(zhǔn)品按0，1，2，4，8，12，16，20 μl加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20 μl。將各孔加入200 μl BCA工作液，于37℃放置30 min。測(cè)定A562，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的蛋白濃度。

十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)：配制5%的濃縮膠與10%的分離膠；取將要上樣的蛋白樣品60 μg/孔，將6倍上樣緩沖液與蛋白樣品混合。樣品漂浮于自來(lái)水中，慢慢煮沸5 min，取出后立即放置于冰上，防止蛋白復(fù)性。12 000 r/min離心以去除殘?jiān)?；垂直凝膠電泳分離不同分子量的蛋白質(zhì)，濃縮膠80 V，30 min，分離膠120 V，當(dāng)Marker的綠色條帶跑至膠中部時(shí)，停止電泳。

Western印跡步驟：制作“三明治”并開(kāi)始電轉(zhuǎn)膜，50 V及120 V，1～2 h轉(zhuǎn)??；取出聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，漂洗后放入含5%脫脂奶粉的T-PBS中封閉，室溫下?lián)u晃1 h；洗膜3次，每次5 min；將膜置入含NF-κBp65(1∶500)和Histon H3(1∶500)的一抗中，在搖床上孵育，4℃過(guò)夜；洗膜3次，每次5 min，將膜置于二抗溶液中(二抗?jié)舛?∶1 000)，孵育1 h；凝膠成像儀成像。

1.5Real time RT-PCR方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞MIF mRNA的表達(dá) 用RNA抽提試劑盒提取第二組細(xì)胞的總RNA，并用核酸分析儀分別檢測(cè)其含量和純度。取1 μl RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，之后再取3 μl cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。MIF上游引物5′-GACATGAAC GCGGCCAAT-3′，下游引物5′-GGGTCCCTGCGGCTCTTA-3′。GAPDH上游引物5′-AGAAGGCTGGGGCTACATTTG-3′，下游引物 5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′；反應(yīng)條件：95℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 31 s，40個(gè)循環(huán)。用內(nèi)參引物GAPDH的CT值對(duì)樣本的拷貝數(shù)進(jìn)行校正，并用2-ΔΔCT法計(jì)算出MIF mRNA與GAPDH mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1巨噬細(xì)胞的鑒定 THP-1細(xì)胞為懸浮生長(zhǎng)的圓形細(xì)胞，給予佛波酯刺激后貼壁，并從胞體伸出偽足。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示：一抗滴加CD68抗體(圖1)，細(xì)胞內(nèi)染成棕黃色，證實(shí)THP-1細(xì)胞已轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞。THP-1細(xì)胞經(jīng)佛波酯刺激后出現(xiàn)偽足，CD68染色后可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)為棕黃色。

圖1 巨噬細(xì)胞鑒定(DAB，×400)

2.2AngⅡ?qū)奘杉?xì)胞核內(nèi)NF-κBp65表達(dá)的影響 Western印跡檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)NF-κBp65蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示：伴隨AngⅡ濃度的升高，NF-κBp65蛋白的表達(dá)逐漸增強(qiáng)(圖2)，可見(jiàn)隨著AngⅡ濃度的增高，NF-κBp65的表達(dá)逐漸增強(qiáng)。

1～5：對(duì)照組、AngⅡ1×10-8mol/L組、AngⅡ1×10-7mol/L組、AngⅡ1×10-6mol/L組、AngⅡ1×10-5mol/L組圖2 各組巨噬細(xì)胞核內(nèi)NF-κBp65的表達(dá)

2.3巨噬細(xì)胞MIF mRNA的表達(dá) 與對(duì)照組(1)相比，AngⅡ組MIF mRNA表達(dá)量明顯增高(3.05±0.13)；給予PDTC后，MIF mRNA表達(dá)明顯降低(AngⅡ+PDTC組為2.01±0.10，PDTC組為1.22±0.05，P<0.01)。

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化的形成一直是人們關(guān)注的要點(diǎn)，對(duì)于其發(fā)病機(jī)制目前已經(jīng)有多種學(xué)說(shuō)。研究表明，炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展及破裂的過(guò)程中具有重要的作用。動(dòng)脈粥樣硬化炎癥學(xué)說(shuō)主要包括：炎癥反應(yīng)介導(dǎo)脂質(zhì)沉積于動(dòng)脈壁，參與形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的過(guò)程；在病變處可見(jiàn)大量單核/巨噬細(xì)胞及活化的T 細(xì)胞；細(xì)胞免疫應(yīng)答和抗體都能調(diào)控炎癥反應(yīng)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展。

巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化病變中具有極為重要的作用，其貫穿于動(dòng)脈粥樣硬化各時(shí)期的病變，是炎癥學(xué)說(shuō)中的關(guān)鍵細(xì)胞。巨噬細(xì)胞作用主要為：通過(guò)分泌多種蛋白酶，參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解〔8〕；通過(guò)清道夫受體攝取氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，使巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞；釋放生長(zhǎng)因子刺激平滑肌細(xì)胞增殖和遷移等。由此可見(jiàn)，研究促進(jìn)巨噬細(xì)胞聚集的因素對(duì)研究動(dòng)脈粥樣硬化病變具有重要的作用。以往研究顯示基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的活性增加及降解彈性蛋白形成彈性蛋白肽與巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)有關(guān)〔9〕，這只是眾多因素之一。

有研究表明，MIF有刺激巨噬細(xì)胞聚集的作用，其可在血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞〔10〕等多種細(xì)胞中表達(dá)。MIF在促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的作用中，體現(xiàn)在能直接增加T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的聚集〔11，12〕，還可以誘導(dǎo)不穩(wěn)定斑塊中MMP-1和MMP-9的表達(dá)，這表明MIF在削弱纖維帽、降解膠原蛋白及在斑塊的不穩(wěn)定性中都發(fā)揮著重要作用。目前AngⅡ?qū)IF的調(diào)節(jié)，文獻(xiàn)報(bào)道的很少。研究表明，人動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的MIF的表達(dá)量和強(qiáng)度與動(dòng)脈粥樣硬化的分期有關(guān)。在斑塊有較多炎癥和新生血管的區(qū)域，能見(jiàn)到AngⅡ刺激后的單核細(xì)胞表達(dá)MIF〔13〕。本研究結(jié)果顯示，在體外實(shí)驗(yàn)中，AngⅡ能上調(diào)巨噬細(xì)胞MIF mRNA的表達(dá)。NF-κB參與調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，并與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展和斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān)。通過(guò)藥物META060抑制NF-κB通路，能抑制如白細(xì)胞介素(IL)-1β、MMP-9、巨噬細(xì)胞趨化因子(MCP)-1等THP-1細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)〔14〕。本研究結(jié)果顯示隨AngⅡ濃度的增高，NF-κB在核內(nèi)的表達(dá)也增加，并同對(duì)照組相比均有明顯差異，據(jù)此判斷AngⅡ可以調(diào)節(jié)NF-κB的核內(nèi)活化程度。研究顯示，AngⅡ?qū)HP-1細(xì)胞MMP-9的調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)中，NF-κB通路能被激活〔15〕，我們研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了AngⅡ?qū)F-κB具有上調(diào)作用，且可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)MIF mRNA的表達(dá)，而PDTC作為NF-κB的特異性阻斷劑可抑制這種作用。有研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)用ox-LDL刺激巨噬細(xì)胞，能使其核內(nèi)NF-κB表達(dá)增高，而胞質(zhì)中IκB表達(dá)下降，證實(shí)了刺激因子能促進(jìn)NF-κBP65入核，而PDTC可抑制這一過(guò)程〔16〕。本研究顯示PDTC作為NF-κB的阻斷劑，起到抑制AngⅡ?qū)IF的上調(diào)作用，也說(shuō)明了AngⅡ?qū)奘杉?xì)胞MIF mRNA的表達(dá)可以通過(guò)NF-κB通路調(diào)節(jié)，這也說(shuō)明了在AngⅡ?qū)IF調(diào)節(jié)過(guò)程中，NF-κB信號(hào)通路并不是唯一的通路。