范忠誠(chéng) 王琮仁 李 楊
(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬??卺t(yī)院骨科,海南 ???570208)
骨關(guān)節(jié)炎作為一種退行性疾病,以軟骨細(xì)胞異常減少、基質(zhì)降解增多為主要特性,軟骨細(xì)胞占軟骨組織的5%左右,具有維持軟骨組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、保持軟骨組織完整性的作用,其凋亡增多是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的機(jī)制之一〔1〕。氧化應(yīng)激、物理因素、炎癥因子等都可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡,正常情況下,軟骨組織中存在少量的白(IL)-1β,而在關(guān)節(jié)炎患者的軟骨組織中存在大量IL-1β,IL-1β是誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的重要因子〔2,3〕。沉默信息調(diào)節(jié)因子(SIRT)2是一種組蛋白去乙酰酶,依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸,能夠調(diào)控細(xì)胞能量代謝、增殖、凋亡等過(guò)程,其與關(guān)節(jié)炎的發(fā)生有關(guān),在關(guān)節(jié)炎小鼠的軟骨組織中發(fā)現(xiàn)SIRT2 mRNA和蛋白水平均下調(diào)〔4~6〕。本實(shí)驗(yàn)以兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為對(duì)象,研究SIRT2在IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡中的作用。
1.1材料 新西蘭大白兔6只,雌雄不限,2月齡,購(gòu)自長(zhǎng)沙市開(kāi)福區(qū)東創(chuàng)動(dòng)物科技服務(wù)部。SIRT2過(guò)表達(dá)慢病毒由北京合生基因構(gòu)建;0.25%胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco;Ⅱ型膠原酶、MTT、IL-1β購(gòu)自美國(guó)Sigma;DMEM/F12購(gòu)自美國(guó)Thermo;細(xì)胞色素(Cytochrome)C抗體購(gòu)自美國(guó)CTS;Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD;Realtime PCR試劑盒、RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒購(gòu)自大連寶生物;SIRT2抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam;胞質(zhì)蛋白提取試劑盒、線粒體蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海生工。
1.2兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng) 步驟如下〔7〕:2月齡的新西蘭大白兔,共6只,雌雄不限,購(gòu)自長(zhǎng)沙市開(kāi)福區(qū)東創(chuàng)動(dòng)物科技服務(wù)部。耳緣靜脈注入空氣將大白兔處死,無(wú)菌條件下取出膝關(guān)節(jié),于超凈臺(tái)內(nèi)用尖刀刮取膝關(guān)節(jié)軟骨組織,剪成1 mm3的小塊,加入5 ml 0.25%胰蛋白酶,于37℃恒溫水浴箱內(nèi)消化40 min,離心,棄掉上清,加入5 ml DMEM/F12培養(yǎng)基(含有0.2% Ⅱ型膠原酶),于37℃恒溫水浴振蕩器150RPM消化6 h,100 μm的無(wú)菌濾篩將殘?jiān)?,?jì)數(shù),等體積在培養(yǎng)瓶分裝,倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況,觀察到細(xì)胞貼壁后,每2天換液1次,細(xì)胞達(dá)80%~90%生長(zhǎng)融合時(shí)進(jìn)行傳代。選擇第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。
1.3細(xì)胞分組 取第3代兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,分為:Control組、IL-1β組、NC+IL-1β組、SIRT2+IL-1β組共4組,IL-1β組、NC+IL-1β組、SIRT2+IL-1β組細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加10 ng/ml IL-1β,SIRT2+IL-1β組、NC+IL-1β組細(xì)胞分別為感染SIRT2過(guò)表達(dá)慢病毒和對(duì)照慢病毒的兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。Control組、IL-1β組細(xì)胞在培養(yǎng)24 h以后,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。慢病毒感染方法簡(jiǎn)述如下:取第3代兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi),細(xì)胞培養(yǎng)密度為50%時(shí),加入慢病毒液,MOI=10,培養(yǎng)3 d后,將細(xì)胞培養(yǎng)板置于熒光顯微鏡下,觀察GFP綠色熒光表達(dá)情況,細(xì)胞感染效率高于95%,篩選穩(wěn)定感染的細(xì)胞株,給予IL-1β刺激后,用Realtime PCR和Western印跡方法檢測(cè)SIRT2表達(dá)。
1.4Realtime PCR檢測(cè)SIRT2表達(dá) Control組、IL-1β組細(xì)胞按照上述方法培養(yǎng)以后,以RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中的總RNA,RNA用DEPC水溶解以后,取1 μl的RNA,稀釋200倍,用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260nm/OD280 nm的比值。以RNA作為模板,用cDNA合成試劑盒合成cDNA。取1 μl的cDNA,進(jìn)行Realtime PCR,步驟同Realtime PCR試劑盒,PCR體系為:12.5 μl的2×SYBR Green qPCR混合物,1 μl的上下游引物(5 μmol/L),1 μl的cDNA模板,添加9.5 μl的ddH2O。引物為:SIRT2正義鏈5′-CAACCTGGAGAAATACCGTCTT-3′,反義鏈5′-CAGTCCTTTTTCCTTCAGCAG-3′。β-actin正義鏈5′-AGTGCGACGTGGACATCCG-3′,反義鏈5′-TGGCTCTAACAGTCCGCCTAG-3′。
1.5Western印跡檢測(cè)SIRT2表達(dá) Control組、IL-1β組細(xì)胞按照上述方法培養(yǎng)以后,在細(xì)胞中添加含有1 mmol/L的PMSF的細(xì)胞裂解液,將細(xì)胞裂解以后,轉(zhuǎn)移到EP管中,12 000 r/min離心10 min,吸取上清溶液,保存在-20℃。用BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)。取蛋白樣品,進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳,在上層膠中電壓為80 V,在下層膠中電壓為120 V,每個(gè)上樣孔添加30 μg蛋白樣品。取出蛋白凝膠,以150 V的電壓轉(zhuǎn)膜1 h以后,蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上。用5%的牛血清白蛋白將非特異性的位點(diǎn)封閉以后,再把NC膜放在1/500的一抗中,4℃過(guò)夜,NC膜再與1/3 000的二抗室溫中孵育2 h以后,按照ECL顯色試劑盒顯色后,用Band Scan分析條帶的灰度值,計(jì)算SIRT2灰度值/β-actin的灰度值。
1.6MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 取感染慢病毒后的兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,接種到96孔板內(nèi),細(xì)胞接種的密度為5×104個(gè)/ml,按照Control組、IL-1β組、NC+IL-1β組、SIRT2+IL-1β組分組處理后,分別在24、48、72、96 h時(shí)取出培養(yǎng)板,在每個(gè)孔內(nèi)加入MTT溶液約10 μl,置于37℃孵育4 h以后,把上清溶液吸棄,再加入150 μl的DMSO溶液,置于低速搖床上孵育10 min,置于酶標(biāo)儀上檢測(cè)490 nm的OD值。
1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取感染慢病毒后的兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,按照Control組、IL-1β組、NC+IL-1β組、SIRT2+IL-1β組分組處理24 h以后,以胰蛋白酶消化,2 000 r/min離心10 min,把上清吸棄以后,添加上樣緩沖液混合后,此時(shí)細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml,轉(zhuǎn)移到流式管中,添加5 μl的PI及Annexin V-FITC,置于室溫中孵育25 min后,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
1.8Western印跡檢測(cè)胞質(zhì)和線粒體中CytochromeC蛋白水平 取感染慢病毒后的兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,按照Control組、IL-1β組、NC+IL-1β組、SIRT2+IL-1β組分組處理24 h以后,按照試劑盒提取細(xì)胞線粒體和胞質(zhì)中的蛋白,以Western印跡方法檢測(cè)CytochromeC蛋白水平,具體步驟同上,胞質(zhì)蛋白以β-actin為參照,線粒體蛋白以Porin為內(nèi)參。
1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn),單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。
2.1IL-1β誘導(dǎo)后SIRT2表達(dá)水平降低 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞經(jīng)過(guò)IL-1β誘導(dǎo)處理以后,細(xì)胞中的SIRT2 mRNA和蛋白水平下降,提示IL-1β減少關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中SIRT2的表達(dá),見(jiàn)圖1,表1。
圖1 IL-1β減少關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中SIRT2蛋白表達(dá)
2.2慢病毒感染促進(jìn)IL-1β條件下關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中SIRT2的表達(dá) 經(jīng)過(guò)IL-1β誘導(dǎo)處理以后,細(xì)胞中的SIRT2水平升高,提示成功構(gòu)建了上調(diào) SIRT2的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,見(jiàn)圖2,表2。
2.3SIRT2提高IL-1β條件下關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖活性 IL-1β處理后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的OD值明顯降低,而過(guò)表達(dá)SIRT2后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)處理以后,細(xì)胞的OD值有所升高。過(guò)表達(dá)SIRT2拮抗IL-1β對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖的抑制作用,見(jiàn)表3。
表1 IL-1β處理后關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中SIRT2水平
圖2 慢病毒感染上調(diào)IL-1β作用后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中SIRT2的表達(dá)
表2 各組SIRT2 mRNA及蛋白水平比較
與IL-1β組比較:1)P<0.05
2.4SIRT2抑制IL-1β條件下關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡 IL-1β處理后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡率〔(26.14±2.87)%〕明顯高于Control組〔(6.25±0.47)%〕,而過(guò)表達(dá)SIRT2后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)處理以后,細(xì)胞凋亡率〔(15.28±1.65)%〕較NC+IL-1β組〔(27.42±2.49)%〕明顯降低,過(guò)表達(dá)SIRT2減少IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡。
2.5SIRT2減少IL-1β處理后關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞線粒體釋放CytochromeC IL-1β處理后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞線粒體中CytochromeC蛋白水平明顯降低,而胞質(zhì)中CytochromeC蛋白水平明顯升高。過(guò)表達(dá)SIRT2后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)處理以后,細(xì)胞線粒體中CytochromeC水平有所升高,胞質(zhì)中CytochromeC水平有所降低。過(guò)表達(dá)SIRT2抑制IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞線粒體釋放CytochromeC,見(jiàn)圖3,表4。
1~4:Control組,IL-1β組,NC+IL-1β組,SIRT2+IL-1β組圖3 SIRT2過(guò)表達(dá)減少IL-1β處理后關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞胞質(zhì)及線粒體中CytochromeC蛋白水平
表3 SIRT2提高IL-1β條件下關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖活性
與Control組比較:1)P<0.05;與IL-1β比較:2)P<0.05,下表同
表4 SIRT2過(guò)表達(dá)對(duì)IL-1β處理后關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞胞質(zhì)和線粒體中CytochromeC蛋白水平的影響
骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生以軟骨組織破壞、軟骨變性、關(guān)節(jié)間隙變窄為主要特性,而作為軟骨組織的唯一組成細(xì)胞,軟骨細(xì)胞功能紊亂是關(guān)節(jié)炎發(fā)生的關(guān)鍵〔8〕。研究表明,骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生常常伴隨有軟骨細(xì)胞凋亡過(guò)度等現(xiàn)象,軟骨細(xì)胞受到炎癥因子等的刺激后,細(xì)胞凋亡水平升高,細(xì)胞損傷加重〔9,10〕。IL-1β作為一種炎癥因子,在骨關(guān)節(jié)炎患者中的表達(dá)水平升高,其可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡發(fā)生〔11〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,IL-1β處理后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖活性降低,細(xì)胞凋亡增多,提示成功構(gòu)建了IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞模型。
沉默信息調(diào)節(jié)因子基因家族(Sir2)是一類組蛋白去乙酰酶,其與哺乳動(dòng)物Sir2同源的蛋白共同組成Sirtuin蛋白家族,Sirtuin蛋白家族含有7個(gè)蛋白成員,在不同的組織和器官中表達(dá)水平不同〔12~15〕。SIRT1參與軟骨細(xì)胞炎癥,可以提高軟骨細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激能力并減少軟骨細(xì)胞炎癥等,SIRT1在骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮保護(hù)作用,目前研究表明,SIRT2和SIRT1一樣,作為Sirtuin蛋白家族的成員,都含有較高的去乙?;傅幕钚?,均在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中表達(dá)下調(diào),SIRT2可能也參與關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷發(fā)生〔16~19〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,IL-1β誘導(dǎo)后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的SIRT2表達(dá)水平降低,這與上述研究報(bào)道結(jié)果一致,均表明SIRT2可能參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。
有研究報(bào)道表明,IL-1β可以通過(guò)激活線粒體途徑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡,IL-1β能夠促進(jìn)線粒體中CytochromeC的釋放〔20,21〕。線粒體凋亡途徑又稱為內(nèi)源性凋亡途徑,是細(xì)胞凋亡發(fā)生的重要分支,在幾乎所有的哺乳動(dòng)物凋亡中存在,其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生與CytochromeC有關(guān),CytochromeC是一個(gè)重要的凋亡激活因子,正常情況下,CytochromeC多存在于細(xì)胞線粒體內(nèi),當(dāng)細(xì)胞受到病理因素的刺激以后,線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔打開(kāi),線粒體內(nèi)的CytochromeC釋放至細(xì)胞質(zhì)中,激活位于細(xì)胞質(zhì)中的凋亡反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生〔22,23〕。SIRT2具有抗細(xì)胞凋亡的作用,沉默其表達(dá)后可以減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生,在急性髓系白血病細(xì)胞、帕金森病細(xì)胞模型等中已經(jīng)得到證實(shí)〔24,25〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,IL-1β誘導(dǎo)后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞線粒體釋放的CytochromeC增多,而過(guò)表達(dá)SIRT2后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)后,細(xì)胞凋亡率有所降低,線粒體釋放的CytochromeC減少,細(xì)胞增殖活性升高,說(shuō)明SIRT2可以通過(guò)線粒體途徑減少IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡損傷,SIRT2在軟骨細(xì)胞凋亡中發(fā)揮保護(hù)作用。
總而言之,SIRT2能夠通過(guò)減少線粒體釋放CytochromeC抑制IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡,提高軟骨細(xì)胞活性,SIRT2可能具有抗骨關(guān)節(jié)炎的作用,對(duì)于其作用機(jī)制還需要在以后進(jìn)行驗(yàn)證和探索。