趙振華 陳枝挺 劉昌云 吳小敏 李元霄 林漢斌 車春暉 黃華品

(福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床學(xué)院 福建省立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福建 福州 350001)

腦梗死、心肌梗死、下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥等是2型糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥和最主要的死亡原因〔1〕。目前認(rèn)為內(nèi)皮功能損傷是動(dòng)脈粥樣硬化形成和進(jìn)展的始動(dòng)因素。在糖尿病狀態(tài)下，升高的血糖與蛋白質(zhì)、核酸或脂質(zhì)發(fā)生非酶糖基化，形成具有極長(zhǎng)半衰期的晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)〔2〕。AGEs與內(nèi)皮細(xì)胞膜上的糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)結(jié)合加速了活性氧自由基(ROS)生成，一方面導(dǎo)致血管內(nèi)皮舒縮功能障礙，另一方面促進(jìn)炎癥因子表達(dá)升高，加快了糖尿病患者內(nèi)皮細(xì)胞損傷，因此，AGEs的持續(xù)損傷是糖尿病血管并發(fā)癥的重要觸發(fā)因素〔3〕。如何對(duì)抗AGEs的促動(dòng)脈粥樣硬化作用一直是學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)〔4〕。

左旋丁基苯酞(L-3-n-butylphahalide)又名芹菜甲素(apium graveolens linn)，是從芹菜種籽中分離出的有效成分，根據(jù)其結(jié)構(gòu)式，其異構(gòu)體右旋丁基苯酞(d-3-n-butylphahalide)被合成。之后其混合物消旋丁基苯酞(NBP)作為臨床藥物被發(fā)展起來(lái)〔5〕。NBP能夠通過(guò)多種途徑減輕神經(jīng)細(xì)胞缺血缺氧損傷，于2002年11月正式通過(guò)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局的審批成為治療腦卒中的臨床藥物,適應(yīng)于腦梗死急性期治療〔6〕。Li等〔7〕研究表明NBP對(duì)缺氧缺糖損傷的內(nèi)皮細(xì)胞也有保護(hù)作用，能夠抑制缺氧缺糖導(dǎo)致的氧化應(yīng)激、線粒體損傷和細(xì)胞凋亡。但NBP對(duì)AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞非缺氧缺糖損傷是否也具有保護(hù)作用尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究建立AGEs誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)模型，采用不同劑量的NBP進(jìn)行干預(yù)，并初步探討NBP對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用及其相應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 NBP(純度99.6%)由石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司贈(zèng)送。HUVECs購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，MTT(美國(guó)Sigma公司)，胎牛血清(美國(guó)Invitrogen公司)，DMEM培養(yǎng)液和胰蛋白酶(Gibco公司)，Hoechst 33258染色試劑盒(中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所)，熒光定量RT-PCR試劑盒(美國(guó)Promega公司)，Bax和Bcl-2一抗抗體(美國(guó)R&D公司)，β-actin一抗抗體(美國(guó)GenScript 公司)，相應(yīng)二抗抗體(美國(guó)Sigma公司)，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，一氧化氮(NO)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA，美國(guó)Sigma公司)。

1.2AGEs的制備 5 g牛血清白蛋白(BSA)和9 g D-葡萄糖溶于0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.2)中，將配好的溶液通過(guò)0.22 μm的濾頭過(guò)濾除菌后恒溫37℃避光孵育12 w。相同條件下，以5 g BSA溶解于0.2 mol/L PBS(pH=7.2)中孵育作為對(duì)照。AGEs和BSA內(nèi)毒素含量由內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒測(cè)定并確保<1.0 kU/L。采用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法檢測(cè)AGEs濃度，加入含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中配置AGEs終濃度為200 μg/ml。

1.3AGEs環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 HUVECs于含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)于37℃、飽和濕度、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。采用200 μg/ml AGEs對(duì)HUVECs進(jìn)行干預(yù)，以200 μg/ml BSA作為正常對(duì)照組，AGEs干預(yù)組根據(jù)不同的NBP終濃度分為0、0.1、1.0、10.0、100.0 μmol/L 5組，其中以NBP終濃度 0 μmol/L組為陽(yáng)性對(duì)照組。用于實(shí)驗(yàn)的內(nèi)皮細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)基，待細(xì)胞貼壁后分別加入不同濃度NBP共培養(yǎng)0.5 h。然后加入200 μg/ml AGEs或 BSA再培養(yǎng)48 h。

1.4MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖率 取不同處理的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105ml種植于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μl，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至70%～80%時(shí)開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，室溫振蕩10 min至藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)吸光度OD值。

1.5HUVECs凋亡檢測(cè) 在培養(yǎng)板中將已制備完成的細(xì)胞爬片用1×PBS浸洗3次，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞爬片15 min，再用1×PBS浸洗細(xì)胞爬片3次，吸干多余的PBS。加入Hoechst 33258工作液染色，室溫培育15 min，再用1×PBS浸洗細(xì)胞爬片3次，吸干多余的PBS后，用含抗熒光猝滅劑的封片液封片；然后在激光掃描共聚焦顯微鏡下采集圖像。

1.6蛋白印跡試驗(yàn)(Western印跡) 檢測(cè)各蛋白質(zhì)表達(dá)用冷的PBS洗滌細(xì)胞3次后，于細(xì)胞裂解液中重懸細(xì)胞，冰上裂解30 min，4℃，8 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管，用改良的Lowry法進(jìn)行蛋白定量。各組取等量的蛋白上樣，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉，用相應(yīng)稀釋后的一抗4℃孵育過(guò)夜，1×TBST漂洗3次后加入相應(yīng)二抗，室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色，對(duì)條帶進(jìn)行吸光度積分掃描。β-actin作為內(nèi)參照。Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)采用目標(biāo)蛋白吸光度值/內(nèi)參照吸光度值的比值進(jìn)行比較。

1.7流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，加入終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA，以DMSO作為溶劑對(duì)照，37℃孵育細(xì)胞30 min，每3 min顛倒混勻，使探針與細(xì)胞充分接觸。棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。0.25%胰酶消化細(xì)胞2 min，加入培養(yǎng)基終止消化，3 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，收獲1.0×106細(xì)胞懸液。使用485 nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS。

1.8NO檢測(cè) 采用硝酸鹽還原法。棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，加入提取液0.5 ml，混勻2 min，將細(xì)胞破碎制成細(xì)胞懸液，取樣0.1 ml依照試劑盒說(shuō)明操作，反應(yīng)完成后，采用酶標(biāo)儀分析，比色波長(zhǎng)為550 nm。NO含量(μmol/L)=(測(cè)定OD值-空白管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(20 μmol/L)。

1.9RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 收獲1.0×105細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，Trizol法提取總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Western biotechnology)合成cDNA。采用SYBR-GREEN PCR試劑盒擴(kuò)增eNOS、iNOS和β-actin。β-actin上游引物:5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3',下游引物:5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'，iNOS上游引物:5'-GGGACCCGCACCACTACA-3',下游引物:5'-AGATTCTGCCGAGATTTGAGC-3'，eNOS上游引物:5'-GACCCTCACCGCTACAACATC-3'，下游引物:5'-CACGATGGTGACTTTGGCTAG-3'。采用相對(duì)定量法分析eNOS和iNOS的表達(dá)量。表達(dá)量=2-(Ct干預(yù)組-Ct內(nèi)參基因)-(Ct正常對(duì)照組-Ct內(nèi)參基因)，Ct：閾值循環(huán)數(shù)。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組HUVECs細(xì)胞增殖率比較 AGEs誘導(dǎo)后陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞增殖率明顯下降至(62.27±2.56)%，與正常對(duì)照組100.00%比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)NBP干預(yù)后，0.1、1.0、10.0和100.0 μmol/L NBP組細(xì)胞增殖率分別為(64.61±1.80)%、(66.76±2.12)%、(70.09±1.66)%和(73.56±1.98)%。其中，1.0、10.0和100.0 μmol/L NBP組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，100.0 μmol/L NBP組與0.1、1.0 μmol/L NBP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Hoechst 33258染色結(jié)果示，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染或呈碎塊狀致密濃染，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有大量濃染致密的顆粒塊狀熒光。陽(yáng)性對(duì)照組異常染色的細(xì)胞明顯增多，隨著NBP干預(yù)濃度的增高，這些顆粒明顯減少。見(jiàn)圖1。

圖1 各組HUVECs細(xì)胞Hoechst 33258染色(×200)

2.2各組凋亡蛋白表達(dá)比較 AGEs誘導(dǎo)后，陽(yáng)性對(duì)照組Bcl-2蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組明顯降低(0.77±0.16 vs 0.29±0.02)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)NBP干預(yù)后，0.1、1.0、10.0和100.0 μmol/L NBP組Bcl-2蛋白表達(dá)逐步升高(0.29±0.42、0.39±0.02、0.43±0.05、0.54±0.01)，其中10.0 μmol/L和100.0 μmol/L NBP組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

AGEs誘導(dǎo)后，陽(yáng)性對(duì)照組Bax蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組相比明顯升高(0.80±0.08 vs 0.32±0.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)NBP干預(yù)后，0.1、1.0、10.0 μmol/L和100 μmol/L NBP組Bax蛋白表達(dá)逐步降低(0.76±0.09、0.67±0.07、0.55±0.02、0.45±0.02)，其中1.0、10.0和100.0 μmol/L NBP組與陽(yáng)性對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)情況

2.3各組ROS比較 AGEs誘導(dǎo)后，陽(yáng)性對(duì)照組ROS生成的熒光值為(763.0±33.8)，與正常對(duì)照組(93.0±4.6)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)NBP干預(yù)后，0.1、1.0、10.0和100.0 μmol/L NBP組熒光值逐漸降低(366.0±16.1、203.7±6.4、155.00±5.6、141.0±3.6)，與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.4各組eNOS、iNOS mRNA及NO比較合成 AGEs誘導(dǎo)后，陽(yáng)性對(duì)照組eNOS表達(dá)明顯減少至正常對(duì)照組的(0.286±0.072)倍，與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)NBP干預(yù)后，0.1、1.0、10.0和100.0 μmol/L NBP組eNOS表達(dá)逐漸增加，分別為正常對(duì)照組的(0.29±0.07)倍、(0.47±0.09)倍、(0.62±0.05)倍和(0.87±0.30)倍，其中10.0和100.0 μmol/L NBP組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

AGEs誘導(dǎo)后，陽(yáng)性對(duì)照組iNOS表達(dá)明顯增加至正常對(duì)照組的(3.94±0.56)倍，與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)NBP干預(yù)后，0.1、1.0、10.0和100.0 μmol/L NBP組iNOS表達(dá)逐漸減少，分別為正常對(duì)照組的(3.78±0.38)倍、(3.10±0.97)倍、(2.29±0.46)倍和(1.74±0.55)倍。其中，10.0和100.0 μmol/L NBP組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

AGEs誘導(dǎo)后，陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)NO合成明顯減少至(14.254±0.555)μmol/L，與正常對(duì)照組(20.263±0.820)μmol/L相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)NBP干預(yù)后，0.1、1.0、10.0和100.0 μmol/L NBP組NO合成分別為(14.273±0.163)、(15.646±0.257)、(16.485±0.322)和(18.568±0.567)μmol/L。其中，1.0、10.0和100.0 μmol/L NBP組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

本研究初步證實(shí)了NBP能有效抑制AGEs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。Hoechst 33258染色證實(shí)了NBP能夠有效抑制AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)的相應(yīng)改變進(jìn)一步支持了NBP的作用。NBP降低了AGEs誘導(dǎo)的ROS生成，在0.1 μmol/L的NBP干預(yù)下細(xì)胞內(nèi)ROS的生成即明顯減少，且隨著NBP濃度的升高，ROS生成也逐漸減少，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，特別是NO生物合成減少導(dǎo)致的內(nèi)皮功能障礙，普遍存在于糖尿病患者中。這是糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生和進(jìn)展的重要因素〔8〕。NO是內(nèi)皮細(xì)胞功能的標(biāo)志物之一，是體內(nèi)最強(qiáng)大而有效的血管舒張因子。研究表明，糖尿病患者體內(nèi)NO合成減少和活性降低，導(dǎo)致血管痙攣和異常收縮、誘發(fā)血小板聚集及血管增生〔3〕。張勝雷等〔9〕研究表明100 mg/L的AGEs能夠?qū)е氯四氺o脈內(nèi)皮生成NO明顯減少，且隨著AGEs濃度的繼續(xù)增加，NO生成進(jìn)一步減少。本研究結(jié)果表明NBP能夠有效緩解AGEs對(duì)HUVECs NO生成的抑制作用。

一氧化氮合酶是NO合成的限速酶，包括內(nèi)皮型、神經(jīng)型和誘導(dǎo)型。其中，eNOS主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞，是血管壁上NO的主要來(lái)源，eNOS脫耦聯(lián)是內(nèi)皮細(xì)胞NO下降和氧自由基升高的重要機(jī)制〔10〕。iNOS則是在各種細(xì)胞因子或內(nèi)毒素刺激情況下才出現(xiàn)大量表達(dá)，導(dǎo)致NO大量產(chǎn)生和釋放，進(jìn)而直接損傷細(xì)胞〔11〕。既往研究顯示動(dòng)脈粥樣硬化患者較健康對(duì)照人群體內(nèi)NO 基礎(chǔ)水平降低，表明一氧化氮合酶的最終效應(yīng)仍然是以eNOS為主導(dǎo)〔12〕。Xu等〔13〕研究表明，AGEs可以作用于內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)降低eNOS的磷酸化和蛋白表達(dá)，從而降低eNOS的活性，減少NO生成，介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)。本研究結(jié)果提示，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞NOS表達(dá)可能是NBP上調(diào)HUVECs NO生成的途徑。

綜上，NBP存在抗自由基，保護(hù)神經(jīng)元，減輕線粒體損傷等多種藥理學(xué)活性。NBP可能存在抑制AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙的積極作用，抑制氧化應(yīng)激損傷和調(diào)節(jié)NOS表達(dá)可能是NBP保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)制。