孫 雨 張 靜 趙咫龍 佟 青 李 博

(錦州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院普外科,遼寧 錦州 121000)

結直腸癌發(fā)病率在全球排名第三，每年的新增患者約130萬例〔1，2〕。結直腸癌不僅受遺傳、環(huán)境、生活方式、致癌物與飲食等多種因素的影響，同時也與癌基因、抑癌基因、信號傳導通路、細胞增殖和細胞凋亡等異常關系密切。部分患者就診時多為中晚期，常伴有淋巴結轉移等現(xiàn)象，且錯過了手術治療的最佳時期，而放化療也有自身的局限性，導致死亡率一直居高不下。膜聯(lián)蛋白(ANX)家族是一種Ca2+依賴磷脂結合蛋白的超家族，在細胞增殖、侵襲和凋亡等生理活動中具有重要作用〔3～5〕。ANXA4是ANX家族中的重要成員，在肝門部膽管癌、卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌等腫瘤組織中高表達，且在細胞增殖和黏附等生理活動中發(fā)揮重要作用〔6～9〕。有研究指出ANXA4在結直腸癌中高表達，提示其可能在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色〔10〕。本研究擬探討干預ANXA4表達對結直腸癌細胞增殖、黏附、剝脫和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1細胞 正常結腸上皮NCM460細胞、結直腸癌HCT116細胞均購于美國ATCC。

1.2主要試劑 siRNA-ANXA4和陰性對照購于美國Origene公司。胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)和無血清細胞培養(yǎng)基(RPMI)1640購于美國Gibco公司，聚偏氟乙烯(PVDF)膜購于Milipore 公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑、Trizol試劑和放射免疫沉淀法(RIPA)細胞裂解液購于上海碧云天公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、逆轉錄試劑盒、電化學發(fā)光(ECL)檢測試劑盒和lipofectamineTM2000購于美國Invitrogen公司。辣根過氧化物酶標記羊抗兔/鼠(HRP-IgG)二抗、ANXA4抗體、埃茲蛋白(Ezrin)抗體、骨橋蛋白(OPN)抗體、細胞表面黏附分子(CD44v6)抗體和β肌動蛋白(β-actin)抗體購自美國Santa Cruz公司。引物由上海生工合成。

1.3方法

1.3.1細胞培養(yǎng) HCT116和NCM460細胞采用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，于CO2濃度50 ml/L、溫度37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞80%貼壁時，以濃度25 g/L胰蛋白酶消化傳代。收集生長情況好HCT116和NCM460細胞進行實驗。

1.3.2ANXA4 mRNA檢測 采用Trizol法提取HCT116和NCM460細胞的總RNA，并用Nanodrop 2000對其進行定量。取2 μl RNA模板，采用逆轉錄試劑盒獲取cDNA。先配制包含1 μl cDNA、1 μl正反向引物、10 μl 2×SYBR Premix Ex TaqⅡ和7 μl ddH2O的反應體系，上PCR儀，在循環(huán)參數(shù)95℃ 5 min(1×)、95℃ 30 s(35×)、60℃ 30 s(35×)、72℃ 30 s(35×)和72℃ 6 min(1×)條件下擴增，獲取產(chǎn)物。每種細胞設置3個平行。以β-actin為內(nèi)參，2-△△CT法計算ANXA4 mRNA的相對表達量。其中，ANXA4正向引物為5′-ACCAGCAGCAATATGGACGG-3′，反向引物為5′-TTCACCTCATCTGTCCCCCA-3′；β-actin正向引物為 5′-AGCGCAAGTACTCCGTGTG-3′；反向引物為 5′-AAGCAATGCTATCACCTCCC-3′。

1.3.3ANXA4蛋白檢測 取HCT116和NCM460細胞，采用RIPA細胞裂解液提取兩種細胞的總蛋白，并以BCA試劑盒定量。取變性后的總蛋白60 μg，每份設3個平行孔，上樣至聚丙烯酰胺凝膠(濃度120 g/L)中電泳至分離。取出凝膠，以半干法轉PVDF膜。經(jīng)TBST(Tween+Tris-HCl緩沖鹽溶液)封閉液處理后，加入ANXA4(1∶250稀釋)和β-actin(1∶1 000稀釋)一抗反應過夜，經(jīng)TBST漂洗后，加入HRP-IgG(1∶2 000)二抗，待充分反應后洗膜。以ECL試劑盒顯影，E-Gel Image凝膠成像系統(tǒng)成像，QuantityOne軟件對ANXA4蛋白進行定量分析。

1.3.4分組和轉染 取對數(shù)生長期的HCT116細胞，以胰酶消化后計數(shù)。配制成濃度為4×106個/ml的細胞懸液。取6孔細胞板，以每孔1 ml懸液接種。于第2日，以lipofectamineTM2000試劑按照下列分組進行轉染。將HCT116細胞隨機分為Control組、NC組和ANXA4組。將配制好的含有250 μl無血清培養(yǎng)液、20 μl lipofectamineTM2000和5 μl ANXA4-siRNA/陰性對照的混合液加入ANXA4組/NC組進行轉染，Control組加入等量的無血清培養(yǎng)液和lipofectamineTM2000混合液。轉染4 h后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集各組細胞，以1.3.2和1.3.3中的方法檢測干預效果。

1.3.5細胞增殖實驗 取上述實驗中轉染后培養(yǎng)48 h后的Control組、NC組和ANXA4組細胞，胰酶消化計數(shù)后，以每孔200 μl細胞懸液(濃度5×106個/ml)接種至96孔細胞板上。分別在培養(yǎng)48、72和96 h后，加入20 μl濃度為5 mg/ml MTT溶液，培養(yǎng)4 h后，加入150 μl二甲基亞砜，待充分震蕩反應結束，以酶標儀檢測各組HCT116細胞在490 nm處的吸光度(OD)值。

1.3.6細胞黏附實驗 以Matrigel基質(zhì)膠鋪96孔板(每孔15 μl)，加入小牛血清封閉。取對數(shù)生長期的Control組、NC組和ANXA4組細胞，制備濃度為5×105個/ml懸液，以每孔100 μl接種到經(jīng)Matrigel基質(zhì)膠包被的細胞板上。常溫反應3 h后，以磷酸緩沖液洗滌，加入MTT溶液10 μl，培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)液。加入150 μl二甲基亞砜震蕩溶解10 min。上酶標儀檢測490 nm處的OD值。細胞黏附率=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%。每組設5個復孔。

1.3.7細胞剝脫實驗 取轉染后生長良好的Control組、NC組和ANXA4組細胞，常溫下，以胰酶消化(濃度為0.02%)反應10 min，以磷酸緩沖液洗滌后，收集剝脫的HCT116細胞，統(tǒng)計剝脫及黏附細胞。細胞剝脫百分比=剝脫細胞數(shù)/(剝脫細胞數(shù)+黏附細胞數(shù))。

1.3.8細胞侵襲實驗 取Transwell小室，在上室膜內(nèi)側加入Matrigel基質(zhì)膠30 μl，風干。收取Control組、NC組和ANXA4組細胞，以培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度后，在小室上室中加入200 μl濃度為5×105個/ml細胞懸液。在小室下室中，加入500 μl含10%FBS培養(yǎng)液。常規(guī)條件下培養(yǎng)1 d后，將Transwell小室上室細胞擦去，以4%甲醇固定并風干，加1%結晶紫進行染色。30 min后，洗膜。顯微鏡觀察并統(tǒng)計細胞數(shù)(隨機選取5個視野)。每組實驗設3個平行實驗。

1.3.9Ezrin、OPN和CD44v6蛋白檢測 收集生長狀況良好的Control組、NC組和ANXA4組細胞，經(jīng)總蛋白提取、電泳、轉膜和封閉后，加入Ezrin(1∶500稀釋)、OPN(1∶800稀釋)、CD44v6(1∶500稀釋)和β-actin(1∶1 000稀釋)一抗和HRP-IgG(1∶2 000)二抗，ECL顯影曝光后，收集圖片，以QuantityOne軟件對各組細胞中Ezrin、OPN和CD44v6蛋白進行定量分析。步驟見1.3.3。

1.4統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1ANXA4在HCT116細胞中的表達及轉染效果鑒定 與正常結腸上皮NCM460細胞(1.03±0.12，4.85±0.56)相比，結直腸癌HCT116細胞中ANXA4 mRNA和蛋白表達(0.51±0.12，1.38±0.26)均顯著降低(P<0.05)。見圖1。轉染后，ANXA4組HCT116細胞中ANXA4 mRNA和蛋白表達顯著低于Control組(P<0.05)；而NC組與Control組組間，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2和表1。

2.2干預ANXA4表達對HCT116細胞增殖能力的影響 NC組與Control組OD值隨時間延長差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。48 h時，ANXA4組與Control組OD值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但在72和96 h時，OD值均顯著低于Control組(P<0.05)。見表2。

圖1 Western印跡檢測各細胞ANXA4蛋白表達

圖2 Western印跡檢測轉染后各組HCT116細胞中ANXA4蛋白表達結果

2.3干預ANXA4表達對HCT116細胞黏附和剝脫能力的影響 與Control組相比，NC組中HCT116細胞黏附率和剝脫百分比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而ANXA4組均顯著降低(P<0.05)。見表3。

2.4干預ANXA4表達對HCT116細胞侵襲的影響 ANXA4組侵襲細胞數(shù)〔(56.4±3.8)個〕明顯少于Control組〔(145.5±8.3)個，P<0.05〕，而NC組〔(133.2±10.6)個〕較Control組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.5干預ANXA4表達對HCT116細胞中Ezrin、OPN和CD44v6蛋白的影響 NC組細胞中Ezrin、OPN和CD44v6蛋白表達水平與Control組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而ANXA4組均顯著低于Control組(P<0.05)。見圖3和表4。

表1 各組ANXA4 mRNA和蛋白表達比較

與Control組比較：1)P<0.05；下表同

表2 干預ANXA4表達對各組HCT116細胞增殖的影響值)

表3 干預ANXA4表達對HCT116細胞黏附和剝脫能力的影響

圖3 Western印跡檢測各組細胞中CD44v6、OPN和Ezrin蛋白表達

表4 各組細胞中CD44v6、OPN和Ezrin蛋白的相對表達量

3 討 論

ANXA4可以同Ca2+結合，影響多種基因的轉錄活性，參與依賴于Ca2+途徑的生物學活動，如細胞增殖、侵襲和轉移等〔7〕。ANXA4在乳腺癌、肝癌和宮頸癌等多種腫瘤組織中高表達，與腫瘤轉移和預后不良等關系密切〔11～13〕。李泰階等〔9〕發(fā)現(xiàn)，在肝癌MHCC97H細胞中干擾ANXA4表達后，細胞黏附能力顯著受到抑制。Kakubari等〔14〕和Mogami等〔15〕指出在卵巢癌細胞中，反義寡核苷酸Annexin A4或敲除ANXA4可以提高RMG-1細胞的順鉑耐藥性，引起OVTOKO細胞生長遲緩、細胞遷移及侵襲能力下降。研究報道，Annexin A4在結直腸癌中表達上調(diào)〔16〕，但其對結直腸癌細胞生物學特性影響的報道較少，其作用機制也并不明確。本研究結果發(fā)現(xiàn)，干預ANXA4表達能夠抑制結直腸癌HCT116細胞的增殖、黏附、剝脫和侵襲能力，且高表達的ANXA4在結腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

CD44家族是一類高度特異性的膜糖蛋白家族，在細胞的特異性黏附過程中發(fā)揮重要作用。CD44v6是CD44家族中研究較多的一種細胞表面黏附分子，與多種腫瘤黏附、侵襲和轉移等關系密切。OPN是一種磷酸化的糖蛋白，可以與CD44結合，促進腫瘤細胞的轉移。Ezrin蛋白是一種與膜連接的骨架蛋白，可以與CD44形成復合物，影響細胞間的黏附能力，進而影響細胞的浸潤與轉移。CD44V6、OPN和Ezrin在結直腸癌中均高表達，與浸潤深度、淋巴結轉移、早期復發(fā)和不良預后密切相關〔17～19〕。本研究提示，在結直腸癌中，ANXA4可能通過調(diào)控Ezrin、OPN和CD44v6蛋白表達促進細胞增殖、黏附、剝脫和侵襲等生物學行為。

綜上，干預ANXA4表達能夠抑制結直腸癌HCT116細胞的增殖、黏附、剝脫和侵襲能力，其分子機制可能與下調(diào)Ezrin、OPN和CD44v6蛋白表達有關。ANXA4可能是治療結直腸癌復發(fā)和轉移的有效靶點。