李琦，李濤，范羽，呂家華，袁道足

610041 成都， 四川省腫瘤醫(yī)院·研究所，四川省癌癥防治中心，電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院 放療科

食管癌在全球癌癥相關(guān)性死亡原因中位居第5，我國食管癌的死亡率僅次于肺癌、肝癌、胃癌排第4位[1]，其中以食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)為主，約占90%[2]。目前食管癌的治療效果較差，單純手術(shù)后的患者5年生存率僅為20%～30%[3]。B7家族的程序性死亡配體-1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)是近年來腫瘤免疫治療研究的新熱點，程序性死亡受體-1(programmed cell death-1,PD-1)是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，屬于協(xié)同刺激信號分子CD28家族的成員。PD-1在激活狀態(tài)下的T淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[4-6]。PD-L1是PD-1的主要配體，研究還發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌、頭頸部鱗癌、食管癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞上也有PD-L1的表達(dá)[7-10]，且腫瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)比正常組織中更高。有研究報道檢測到PD-1在肝癌及乳腺癌[11]腫瘤細(xì)胞上表達(dá)，但還未有研究檢測到PD-1在食管癌中的表達(dá)。另外，目前許多研究檢測到PD-L1在食管鱗癌中的表達(dá)率高低不一，其表達(dá)高低與患者預(yù)后的關(guān)系仍有爭議。故本文旨在檢測PD-1及PD-L1在食管鱗癌病理組織上的表達(dá)水平，并探索此二者與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集四川省腫瘤醫(yī)院2012年1月至2013年12月期間收治的87例經(jīng)內(nèi)鏡活檢病理確診的初治食管鱗癌患者臨床資料，具體見表1?；颊吣挲g43～86歲，中位年齡62歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：a.治療前行內(nèi)窺鏡活檢，病理確診為ESCC；b.均為初次治療，拒絕或不適合行手術(shù)，在我院行單純放射治療或同步放化療；c.放射治療前、后患者均已行胸部增強CT掃描和食管鋇餐造影檢查；d.接受的放射總劑量均≥60Gy[12]；e.患者無其他系統(tǒng)(如心、肺、腎、腦等)嚴(yán)重合并癥，無放療禁忌癥；f.放療前卡氏評分(KPS評分)均≥70分。排除標(biāo)準(zhǔn)：a.治療前未病理確診或病理確診為非食管鱗狀細(xì)胞癌患者；b.非初治或未行放療的患者、行手術(shù)治療的患者；c.治療前后未行影像學(xué)檢查的患者；d.接受的放射總劑量<60Gy；e.患者有嚴(yán)重合并癥或放療禁忌癥；f.放療前卡氏評分(KPS評分)<70分。

診斷標(biāo)準(zhǔn)：按AJCC/UICC 2009年第7版食管癌TNM分期。

表1 87例食管鱗癌患者臨床資料Table 1 Clinical data of 87 cases of ESCC

(TBC)

aRT:radiotherapy;bCCRT:concurrent chemoradiotherapy

1.2 治療方式

放療：單純放療組和同步放化療組的放療方案完全相同，采用IMRT或IGRT放療，針對病灶2Gy/天,每周5天，接受放射總劑量均≥60Gy?；煵捎肨P方案，具體劑量為：順鉑25mg/m2,d1-3 +紫杉醇135mg/m2，d1或多西他賽75mg/m2，d1，靜脈滴注 ,每21天一個周期,2～6個周期，中位數(shù)2個周期。

1.3 病理檢查

87例患者的食管鱗癌病理標(biāo)本均經(jīng)過HE制片及免疫組化染色檢測PD-1和PD-L1的表達(dá)水平，抗體購自(北京中杉金橋生物科技有限公司)。免疫組化具體操作參見試劑盒說明書進(jìn)行。免疫組化結(jié)果由2名高級職稱病理科醫(yī)師按照組織化學(xué)評分(histochemistry score，H-Score)標(biāo)準(zhǔn)[13]進(jìn)行獨立觀察評估，將評分的結(jié)果進(jìn)行Kappa一致性分析。

1.4 療效評價

治療前、治療中及治療后1月復(fù)查胸部增強CT及上消化道造影。結(jié)合影像學(xué)檢查結(jié)果按照新版實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)：修訂的RECIST1.1(response evaluation criteria in solid tumors vision 1.1)指南評價近期療效。

1.5 隨訪

電話隨訪患者的生存情況及其他相關(guān)信息，所有病例的隨訪截止日期為2017年1月。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，使用卡方檢驗、Fisher精確檢驗、Logistic回歸、Kaplan-Meier生存分析、Log-rank檢驗以及Cox比例風(fēng)險回歸模型等方法進(jìn)行統(tǒng)計分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 病理結(jié)果

將正常扁桃體組織中PD-1的表達(dá)作為陽性對照。PD-1/PD-L1免疫組化染色在食管鱗癌組織中細(xì)胞膜上表達(dá)。本研究的所有食管鱗癌細(xì)胞標(biāo)記PD-1(-)；有50例食管鱗癌細(xì)胞標(biāo)記PD-L1(+)，其表達(dá)率為57.5%。使用X-tile軟件計算PD-L1免疫組化結(jié)果得出其cut-off值為3分，即總得分≤3分為低表達(dá)，總得分>3分為高表達(dá)。本研究中PD-L1表達(dá)大于cut-off值患者共25例，即高表達(dá)率為28.7%。(圖1、圖2)。

圖1 食管鱗狀細(xì)胞癌HE染色及PD-1免疫組化(40×)Fig. 1 HE staining and immunohistochemical staining of PD-1 in ESCC tissues(40×)A:HE staining of tumor cells(as indicated by the arrow); B：Negative immunoreactivity in tumor cells(as indicated by the arrow)

圖2 食管鱗狀細(xì)胞癌PD-L1免疫組化(40×)Fig. 2 Immunohistochemical staining of PD-L1 in ESCC tissues(40×) A:Low expression of PD-L1 in tumor cells(as indicated by the arrow); B、C、D：High expression of PD-L1 in tumor cells(as indicated by the arrow)

2.2 PD-L1在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與臨床特征的關(guān)系

使用SPSS統(tǒng)計軟件統(tǒng)計PD-L1表達(dá)高低與食管癌一般臨床特征的關(guān)系，統(tǒng)計結(jié)果見表2。分析得出有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的食管癌PD-L1高表達(dá)率為55.6%，明顯高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的食管癌(21.7%)，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.005)。

表2 PD-L1表達(dá)與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系Table 2 Relationship between PD-L1 expression and clinicopathological features of ESCC

(TBC)

*Fisher’s exact test is used

2.3 不同臨床因素與食管癌近期療效的相關(guān)性分析

在食管鱗癌患者完成放療后，以腫瘤客觀緩解率評價近期療效。全部87例食管鱗癌患者在放療前、放療結(jié)束時以及放療結(jié)束后1個月分別行胸部增強CT掃描和食管鋇餐造影檢查，根據(jù)檢查結(jié)果進(jìn)行療效評價，各臨床指標(biāo)與食管癌近期療效的單因素分析見表3。

表3各臨床病理指標(biāo)與食管鱗癌放療后近期療效的單因素分析結(jié)果

Table 3 Clinico-pathological indexes and results of single factor analysis of clinical efficacy and short-term curative effect of radiotherapy for ESCC

VariableNCR+PR (%)Non-CR+PR(%)χ2P value Total8751(58.6)36(41.4) Sex0.0260.873 Male7845(57.7)33(42.3) Female96(66.7)3(33.3)Age(years)4.0210.045 <645235(67.3)17(32.7) ≥643516(45.7)19(54.3)Smoking0.0880.767 Ever6941(59.4)28(40.6) Never1810(55.6)8(44.4)Tumor site2.1670.141 Neck and upper thoracic segment4228(66.7)14(33.3) Middle and lower thoracic segment4523(51.1)22(48.9)X-ray typing0.276* Sclerosing type5131(60.8)20(39.2) Fungating type1913(68.4)6(31.6) Medullary type124(33.3)8(66.7) Ulcerative type53(60.0)2(40.0) TNM staging1.8800.170 Ⅱ/Ⅲ6943(62.3)26(37.7) Ⅳ188(44.4)10(55.6)

(TBC)

*Fisher’s exact test is used

通過卡方檢驗和Fisher精確檢驗對各臨床特征與近期療效的單因素分析的結(jié)果顯示，年齡及PD-L1表達(dá)水平與食管癌放療后近期療效具有相關(guān)性。將年齡和PD-L1表達(dá)水平納入二分類Logistic回歸模型分析結(jié)果顯示：PD-L1低表達(dá)食管癌患者的近期療效比PD-L1高表達(dá)患者更好。詳見表4。

2.4 不同臨床因素與食管癌總生存期的相關(guān)性分析

2.4.1 隨訪 87例食管鱗癌患者隨訪至2017年1月，失訪2例，隨訪率為97.7%。截止隨訪日期有15例患者仍生存，隨訪時間6～60個月，中位隨訪時間38個月，中位總生存時間為14個月。

2.4.2 食管鱗癌治療預(yù)后單因素分析 通過Kaplan-Meier生存分析及Log-rank檢驗分析各臨床因素及治療指標(biāo)對食管鱗癌治療后總生存時間(overall survival，OS)產(chǎn)生的影響，詳見表5。結(jié)果顯示：年齡、PD-L1表達(dá)、腫瘤部位、治療方式、TNM分期和近期療效與食管癌治療預(yù)后有關(guān)。

表4食管鱗癌放療近期療效的影響因素的參數(shù)估計值及檢驗

Table 4 Estimated parameters and test of influencing factors of short-term effects of radiotherapy for ESCC

VariableβWald χ2dfPOR95% CILower limitSuperior limitAge0.7942.95410.862.2130.8945.476PD-L10.9803.86310.0492.6651.0037.084Constant-0.8022.79110.0950.448

表5 臨床因素及治療指標(biāo)對食管鱗癌預(yù)后影響的單因素分析Table 5 Single factor analysis of the effects of clinical factors and treatnsent indicators on prognosis of ESCC

(TBC)

2.4.3 食管鱗癌治療預(yù)后多因素分析 將對預(yù)后影響有意義的單因素均納入Cox回歸模型，分析多因素對預(yù)后的影響，分析結(jié)果可見，年齡是影響食管鱗癌生存預(yù)后的獨立因素(P=0.018)；同時，PD-L1也是影響食管鱗癌生存預(yù)后的獨立因素(P=0.043)，其相對危險度HR=1.587，說明PD-L1高表達(dá)的患者死亡風(fēng)險為PD-L1低表達(dá)的患者的1.587倍，詳見表6。

表6 影響食管鱗癌生存的Cox多因素分析Table 6 Cox multivariate analysis for the survival of patients with ESCC

3 討 論

本研究采用了免疫組織化學(xué)的方法對87例食管鱗癌組織中的PD-1和PD-L1的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，食管鱗癌組織中未檢測到PD-1表達(dá)。Chen等[14]研究食管鱗癌時也未在腫瘤細(xì)胞上檢測到PD-1表達(dá)，而在腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞上可檢測到PD-1表達(dá)，考慮原因與PD-1多表達(dá)于活化的T、B細(xì)胞有關(guān)；但也有研究報道PD-1在其他腫瘤細(xì)胞上有表達(dá)：張勇等[15]采用組織芯片研究肝癌患者時，在肝癌組織及癌旁組織上均檢測到PD-1的表達(dá)。因有相關(guān)研究提示肝細(xì)胞可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞上PD-1表達(dá)上調(diào)，故張勇等的研究與本實驗結(jié)果存在差異考慮原因與此有關(guān)。另外，趙文健等[11]在研究乳腺癌時也檢測到PD-1在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)。本研究采用的組織標(biāo)本未檢測到PD-1的表達(dá)，這是否與采用的組織標(biāo)本是內(nèi)鏡下取得的，標(biāo)本組織較小，所含腫瘤組織少有關(guān)，還需后續(xù)研究進(jìn)一步證實。

PD-L1在食管鱗癌組織中的表達(dá)率為57.5%，其中大于cut-off值的高表達(dá)率為28.7%，結(jié)果與文獻(xiàn)報道基本相符合：Hatogai等[16]采用免疫組化檢測了196例食管癌組織標(biāo)本中的PD-L1的表達(dá)水平，得出其高表達(dá)率為18.4%；Kim等[17]對200例食管鱗癌手術(shù)標(biāo)本行免疫組化檢測得出PD-L1高表達(dá)率為33.5%；Ohigashi[18]及Chen等[14]用免疫組化法分別檢測41例及536例食管鱗癌組織上PD-L1的表達(dá)水平，得出其高表達(dá)率分別為43.9%和41.4%。目前大部分研究均采用免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤組織上PD-L1表達(dá)，得出的PD-L1表達(dá)結(jié)果參差不齊，可能與不同的研究中免疫組化檢測的準(zhǔn)確性有關(guān)。而影響免疫組化準(zhǔn)確性的因素主要有以下幾點：首先,不同研究中使用抗體的敏感性不同；其次,不同研究中,PD-L1染色陽性的標(biāo)準(zhǔn)不同；另外,PD-L1在腫瘤中表達(dá)不均勻,取樣時間和部位都可能影響PD-L1染色的結(jié)果[19]。為了盡量減少以上因素對免疫組化結(jié)果準(zhǔn)確性的影響，未來可通過多個平臺進(jìn)行統(tǒng)一抗體選擇，規(guī)定染色陽性標(biāo)準(zhǔn)等多種手段提高測量的標(biāo)準(zhǔn)化，增加各項研究間的可比性。同時，下一步的研究中將通過更多種的檢測手段來測定PD-L1的表達(dá)水平。

本研究結(jié)果提示，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的食管鱗癌PD-L1高表達(dá)率為55.6% 無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的食管癌PD-L1高表達(dá)率為21.7%，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在腫瘤微環(huán)境中，PD-1/PD-L1信號通路激活可使T細(xì)胞免疫效應(yīng)降低，介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸，促使腫瘤在原發(fā)部位及轉(zhuǎn)移部位生長。另外，有研究者提出PD-1/PD-L1信號通路可影響CD4+CD25+Foxp3+(Forkhead Box P3+,叉狀頭螺旋轉(zhuǎn)錄因子)的分化，PD-L1通過上調(diào)第10號染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白基因(phosphatase and tension homology deleted on chromosome ten,PTEN)及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、PKB、S6激酶(S6 kinase，S6)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶2(extracellular regulated protein kinases 2,ERK2)的磷酸化，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生，通過抑制機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸。Chen[14]等通過免疫組化檢測得出食管癌組織中PD-L1表達(dá)與腫瘤浸潤深度顯著相關(guān)。小鼠實驗證明在腫瘤發(fā)生過程中，PD-L1能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中Slug和Twist轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，使上皮細(xì)胞間質(zhì)化過度發(fā)生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞獲得遷移能力，導(dǎo)致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。綜合上述研究結(jié)果可知：PD-L1高表達(dá)的患者更容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

近期療效是用于評估治療中及治療后近一段時間腫瘤消退情況的指標(biāo)，可直接反映腫瘤治療的近期效果。本研究中所有患者在治療后近期療效中的客觀有效率與患者的年齡大小及PD-L1的表達(dá)水平有關(guān)。年齡<64歲的食管鱗癌患者的客觀有效率明顯高于年齡≥64歲的食管鱗癌患者(P=0.045)；PD-L1高表達(dá)組的客觀有效率明顯低于PD-L1低表達(dá)組(P=0.025)。食管癌近期療效好的患者不一定預(yù)后就好，這與食管癌的易復(fù)發(fā)及易轉(zhuǎn)移特性有關(guān)。但是將近期療效用于食管癌患者的評估仍然有重要意義，因為腫瘤的明顯消退可以改善患者的進(jìn)食梗阻癥狀，從而通過改善患者的營養(yǎng)狀況，增強機(jī)體免疫功能，提高患者的生活質(zhì)量。

本研究多因素分析結(jié)果提示，年齡與食管鱗癌預(yù)后呈負(fù)相關(guān)(P=0.018)，PD-L1高表達(dá)的食管鱗癌患者預(yù)后更差(P=0.043)。年齡和PD-L1表達(dá)水平均是食管鱗癌的獨立預(yù)后因素。Loos等[20]通過101例食管癌標(biāo)本的免疫組化實驗也得出相同結(jié)論。大量研究得出，PD-1/PD-L1信號通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系：PD-L1可以通過傳遞負(fù)性調(diào)控信號抑制活化T細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)T細(xì)胞功能耗竭，使機(jī)體免疫反應(yīng)受到抑制，促使腫瘤細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)控。本研究中也揭示了食管鱗癌上PD-L1表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān);同時，與食管鱗癌患者的預(yù)后也有一定聯(lián)系。Ohigashi等[18]通過對食管鱗癌中PD-L1表達(dá)與患者總生存關(guān)系的研究，分析得出PD-L1表達(dá)與分期晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者的預(yù)后顯著相關(guān)，且PD-L1狀態(tài)是一個獨立預(yù)后因素，本研究結(jié)果也與上述結(jié)論相符。但也有不同的觀點的存在，Jiang等[21]通過對278例食管鱗癌標(biāo)本進(jìn)行免疫組化研究發(fā)現(xiàn)：在Ⅰ、Ⅱ期及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況下，腫瘤PD-L1表達(dá)是患者的獨立預(yù)后因素，而在Ⅲ、Ⅳ期及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況下，PD-L1表達(dá)不是獨立預(yù)后因素。該實驗得出的不同結(jié)論，考慮其與不同研究中研究者對于PD-L1表達(dá)cut-off值的選取，即對于PD-L1高表達(dá)的判定標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)。此外，Topalian等[22]提出PD-L1的陽性表達(dá)能反映免疫反應(yīng)狀態(tài)，可提示更好的總生存。Hatogai等[16]等采用免疫組化檢測了196例食管癌組織標(biāo)本中的PD-L1表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)食管癌腫瘤細(xì)胞PD-L1陽性表達(dá)率為18.4%，得到PD-L1在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)與總體生存率呈正相關(guān)的結(jié)論。該實驗提出，在腫瘤發(fā)生時，活化T細(xì)胞誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)，腫瘤細(xì)胞周圍出現(xiàn)大量炎性浸潤細(xì)胞如CD8+、PD-1+細(xì)胞，PD-1和PD-L1的表達(dá)可反映機(jī)體的免疫反應(yīng)水平，將其作為良好預(yù)后的指標(biāo)。這與前文研究結(jié)果不一致，考慮是因為免疫檢查點調(diào)節(jié)器在免疫抑制通路中同時發(fā)揮著正負(fù)兩方面的作用，而PD-L1在T細(xì)胞的免疫反應(yīng)中也有雙重作用，即共刺激性和共抑制性：共刺激性是指PD-L1升高后，可以刺激機(jī)體的初級T細(xì)胞增殖分化；共抑制性是指PD-L1可以通過傳遞負(fù)性調(diào)節(jié)信號抑制活化T細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)T細(xì)胞功能耗竭，甚至促使T細(xì)胞凋亡。

大量研究結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞PD-L1高表達(dá)提示預(yù)后不良。PD-L1可能會成為一個判斷腫瘤預(yù)后的新指標(biāo)，進(jìn)而成為腫瘤免疫治療的新靶點，臨床上也可通過檢測腫瘤患者PD-L1的表達(dá)狀態(tài)，篩選出部分高風(fēng)險、疾病預(yù)后差的患者，對其進(jìn)行的有效治療，最大程度延緩疾病進(jìn)展，延長患者的生命。

目前免疫治療已成為腫瘤治療新的研究熱點，近年來大量研究得出，PD-1/PD-L1信號通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系。PD-1/PD-L1抗體在非小細(xì)胞肺癌、惡性黑色素瘤等腫瘤的治療上也有了較好的成果。目前食管鱗癌組織中可測出PD-L1的表達(dá)，本研究也證實了PD-L1的高表達(dá)與食管鱗癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，這些研究均為將抗PD-1/PD-L1用于食管鱗癌的免疫治療提供了理論依據(jù)，雖然還需要進(jìn)一步的臨床研究來證實其療效，但這也在食管鱗癌的治療方法上，除傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療等外，為臨床工作者提供了新的思路。

作者聲明：本文第一作者對于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任；

利益沖突：本文全部作者均認(rèn)同文章無相關(guān)利益沖突；

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