楊新樂，王明，楊成偉，張亞強，徐雅潔，鞏棟，甄平

1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅蘭州市730000；2.蘭州總醫(yī)院全軍骨科中心，甘肅蘭州市730050；3.河南省榮軍醫(yī)院，河南新鄉(xiāng)市453000

脊髓損傷可導(dǎo)致嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙，盡管目前出現(xiàn)許多新的治療手段，但對神經(jīng)功能恢復(fù)的作用相當(dāng)有限[1-2]。細胞移植能促進脊髓損傷后功能恢復(fù)，其中成體干細胞(如骨髓間充質(zhì)干細胞等)移植是目前研究較多的方法，它通過促進神經(jīng)細胞再生、抑制其凋亡，恢復(fù)神經(jīng)功能[3-7]。神經(jīng)干細胞來源于中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)，具有強大的再生及多向分化潛能。一些研究發(fā)現(xiàn)[8-11]，脊髓損傷后移植的神經(jīng)干細胞可遷徙至損傷區(qū)，并顯著促進神經(jīng)功能恢復(fù)。目前用于研究的神經(jīng)干細胞主要來自體骨髓或異體組織，容易產(chǎn)生感染、免疫排斥等并發(fā)癥，甚至倫理問題。尋找新的干細胞來源對提高干細胞移植的臨床應(yīng)用有重要意義。

位于鼻腔的嗅黏膜神經(jīng)干細胞(olfactory mucous neural stem cells,OM-NSCs)能夠分化為嗅鞘細胞、膠質(zhì)細胞等，比骨髓間充質(zhì)干細胞更易獲得，在細胞移植研究中具有明顯優(yōu)勢[12-13]。目前已有較多研究探討OM-NSCs提取及培養(yǎng)方法，技術(shù)較為成熟[13-15]。但OM-NSCs移植治療，尤其是治療脊髓損傷的研究極為有限。本研究觀察大鼠OM-NSCs對神經(jīng)元凋亡的影響，為臨床治療脊髓損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SPF級Sprague-Dawley大鼠和孕15 d Sprague-Dawley大鼠，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基、Neurobasal和B27培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加劑(insulin-transferrin-selenium,ITS)、表皮細胞生長因子(epidermal growth factor,EGF)、CY3山羊抗小鼠紅色熒光蛋白、CY3山羊抗兔紅色熒光蛋白、FITC山羊抗小鼠綠色熒光蛋白、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體(小鼠抗大鼠)：美國LIFE TECHNOLOGIES公司。Transwell共培養(yǎng)小室(孔徑0.4μm)：美國MILLIPORE公司。青霉素-鏈霉素：碧云天公司。堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、脫氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease,DNase)、多聚-L-賴氨酸(Poly-L-Lysine,PLL)、Hoechst 33258熒光染料、微管結(jié)合蛋白2(microtubule associated protein 2,MAP2)抗體(小鼠抗大鼠)、DAPI：美國SIGMA-ALDRICH公司。Nestin抗體(小鼠抗大鼠)：美國BD公司。S100抗體(兔抗大鼠)：美國ABCAM公司。P75抗體(小鼠抗大鼠)：日本CHEMI-CON公司。Triton X-100：生工生物工程(上海)有限公司。TUNEL試劑盒：美國ROCHE公司。

1.3 方法

1.3.1 OM-NSCs的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化

雄性Sprague-Dawley大鼠CO2窒息處死，嚴(yán)格消毒后打開鼻腔，取近段1/3鼻中隔，分離嗅黏膜，置PBS緩沖溶液中，剪碎，0.25%胰蛋白酶消化，1000 r/min離心10 min獲取細胞；完全培養(yǎng)基徹底重懸，接種于無菌培養(yǎng)皿中，CO2培養(yǎng)箱37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)，每2天換液1次。細胞貼壁后，換用神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基(DMEM/F12、青霉素100 U/ml-鏈霉 素 0.1 mg/ml、 1%ITS、 bFGF 20 ng/ml、 EGF 40 ng/ml)接種于培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，每天向培養(yǎng)基中加入bFGF和EGF，每3天換液1次；約1周后，出現(xiàn)半貼壁的神經(jīng)球。當(dāng)出現(xiàn)大量神經(jīng)球時，棄去培養(yǎng)基，加0.25%胰蛋白酶消化1 min，輕輕吹打懸浮神經(jīng)球，留下貼壁細胞；將懸液移入離心管繼續(xù)吹打并消化1 min，使神經(jīng)球分散，完全培養(yǎng)基終止消化。800 r/min離心10 min，神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基重懸細胞為1×105/ml，接種于PLL包被的培養(yǎng)皿，置CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)，每天加入bFGF和EGF，每3天半量換液；約1周后懸浮細胞形成神經(jīng)球；重新分散重懸后，再次接種于PLL包被過的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，方法同前。將上述獲得的神經(jīng)球用0.25%胰蛋白酶消化并吹散，800 r/min離心10 min獲取細胞，加入神經(jīng)細胞分化培養(yǎng)基(10%胎牛血清、DMEM/F12、青霉素100 U/ml-鏈 霉 素 0.1 mg/ml、 bFGF 20 ng/ml、 EGF 40 ng/ml)，調(diào)整細胞濃度為1×105/ml，接種于有PLL包被蓋玻片的6孔板中，CO2培養(yǎng)箱37℃、5%CO2中培養(yǎng)，每2天更換半量培養(yǎng)基，顯微鏡觀察細胞分化情況。

1.3.2 OM-NSCs的鑒定

用PBS洗滌接種于玻片上的細胞增殖球及貼壁細胞3次，每次2 min；4%多聚甲醛固定30 min；PBS洗滌3次，每次2 min；0.3%Triton X-100通透處理15 min，PBS洗滌3次，每次2 min；3%牛血清蛋白溶液37℃封閉30 min；加入Nestin、S100、P75、GFAP抗體，4℃濕盒孵育過夜；PBS洗滌3次，每次2 min；加入CY3紅色熒光蛋白、CY3紅色熒光蛋白、FITC綠色熒光蛋白，37℃避光孵育2 h；PBS洗滌3次，每次2 min；滴加Hoechst 33258熒光染料，37℃避光孵育30 min，PBS洗滌3次，每次2 min；甘油封片，熒光顯微鏡觀察并采集照片。

1.3.3 神經(jīng)元的培養(yǎng)和鑒定

孕鼠CO2窒息處死，消毒后取出子宮內(nèi)胎鼠，置含解剖液的無菌培養(yǎng)皿中。嚴(yán)格無菌操作分離胎鼠大腦皮層組織，剪為1 mm3碎塊置DMEM/F12培養(yǎng)基中；0.25%胰蛋白酶37℃消化20 min，胎牛血清終止消化；200目無菌濾網(wǎng)過濾，800 r/mim離心5 min，棄上清；加入含10%胎牛血清和青霉素-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，1×106/孔接種于PLL包被的的6孔板中，孵育4 h后將培養(yǎng)液換為含有10%B27和青霉素-鏈霉素的Neurobasal培養(yǎng)基，每3天半量換液。7 d后，4%多聚甲醛固定，0.3%Triton X-100通透，3%牛血清蛋白封閉，加MAP2抗體4℃濕盒內(nèi)孵育過夜，滴加CY3山羊抗小鼠紅色熒光蛋白，37℃避光孵育90 min，DAPI染核，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.3.4 神經(jīng)元凋亡的誘導(dǎo)及與OM-NSCs共培養(yǎng)

神經(jīng)元1×106/孔接種于含Neurobasal培養(yǎng)基的6孔板中?？瞻捉M正常培養(yǎng)。對照組加20 ng/ml白細胞介素-1β (interleukin-1β,IL-1β)刺激 24 h，全量更換Neurobasal培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實驗組在IL-1β刺激后，全量更換Neurobasal培養(yǎng)基，孔內(nèi)放入Transwell小室；取第3代大鼠OM-NSCs，1×106/孔接種于Transwell小室內(nèi)，OM-NSCs位于Transwell小室上方，神經(jīng)元位于Transwell小室下方，培養(yǎng)24 h。

1.3.5 神經(jīng)元TUNEL和MAP2雙標(biāo)染色

PBS洗滌神經(jīng)元3次，每次2 min；4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌3次，每次2 min；0.3%Triton X-100處理15 min，PBS洗滌3次，每次2 min；按TUNEL試劑盒說明滴加相關(guān)試劑，37℃溫箱孵育2 h，PBS洗滌3次，每次2 min；3%牛血清蛋白溶液37℃封閉30 min；加MAP2抗體，4℃濕盒內(nèi)孵育過夜；PBS洗滌3次，每次2 min，加CY3山羊抗小鼠紅色熒光蛋白，37℃避光孵育90 min；PBS洗滌3次，每次2 min；滴加DAPI染液，37℃避光孵育10 min；PBS溶液洗滌3次，每次2 min。甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

每張玻片隨機選取5個高倍視野，計數(shù)每個視野內(nèi)MAP2陽性細胞數(shù)和MAP2和TUNEL雙陽性細胞數(shù)，計算神經(jīng)元凋亡率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠OM-NSCs的培養(yǎng)和鑒定

原代OM-NSCs貼壁后，換用神經(jīng)干細胞專用培養(yǎng)基，可見大量增殖球形成；通過對增殖球傳代培養(yǎng)和再成球，獲得純度較高的神經(jīng)干細胞。在含10%胎牛血清的普通DMEM/F12培養(yǎng)基中，神經(jīng)干細胞散在分布，不再形成增殖球，呈梭形或紡錘型(圖1)。

免疫熒光染色顯示，培養(yǎng)細胞Nestin、S100、P75、GFAP均呈陽性(圖2)。

圖1 原代OM-NSCs的形態(tài)(100×)

圖2 OM-NSCs的免疫熒光染色(400×)

2.2 神經(jīng)元的培養(yǎng)和鑒定

胎鼠原代神經(jīng)元接種4 h后見貼壁良好，鏡下觀察貼壁細胞呈圓形，表面光滑；隨后神經(jīng)元逐漸長出軸突與樹突。MAP2染色陽性(圖3)。

2.3 各組神經(jīng)元凋亡情況

空白組神經(jīng)元凋亡率(20.667±1.764)%；對照組凋亡率(74.697±5.175)%；實驗組凋亡率(39.013±5.196)%。實驗組凋亡率明顯低于對照組(F=39.764,P=0.003)(圖 4)。

圖3 神經(jīng)元免疫熒光染色(400×)

圖4 各組神經(jīng)元雙標(biāo)免疫熒光染色(200×)

3 討論

脊髓損傷是脊柱骨折的嚴(yán)重并發(fā)癥，給患者及其家庭帶來災(zāi)難性后果，也給社會造成極大負擔(dān)[16]。脊髓損傷后，由于血脊髓屏障破壞，炎癥細胞進入脊髓組織，釋放蛋白水解酶、氧化酶以及一系列促炎細胞因子[17]；同時星形膠質(zhì)細胞活化，形成膠質(zhì)瘢痕，使脊髓發(fā)生不可逆損傷[3]，最終導(dǎo)致脊髓神經(jīng)元凋亡或死亡。

神經(jīng)干細胞移植被廣泛應(yīng)用于脊髓損傷治療的研究中。神經(jīng)干細胞移植對神經(jīng)元有一定保護作用，能改善患者預(yù)后[18-20]。Matsushita等[21]發(fā)現(xiàn)，靜脈輸注骨髓間充質(zhì)干細胞可以經(jīng)血脊髓屏障的滲漏，能改善脊髓挫傷大鼠的運動功能。Gómez等[22]發(fā)現(xiàn)，嗅鞘細胞能分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，減少硫酸軟骨素蛋白多糖的沉積，誘導(dǎo)軸突生長，并具有炎癥調(diào)節(jié)作用，促進脊髓功能的恢復(fù)。

OM-NSCs有強大的再生及多向分化潛能，能分化為嗅鞘細胞、膠質(zhì)細胞等，嗅黏膜相關(guān)神經(jīng)元處于不斷更新中，以替換損傷或衰老神經(jīng)元[22-24]。OM-NSCs位于鼻腔中，較骨髓間充質(zhì)干細胞等更容易獲得；且來源于自體，避免了免疫排斥反應(yīng)及倫理問題，在干細胞移植研究中有明顯優(yōu)勢[15]。本研究分離大鼠嗅黏膜組織進行培養(yǎng)，通過成球、傳代、再成球，獲得較純的神經(jīng)干細胞。神經(jīng)干細胞標(biāo)記物Nestin和S100、嗅鞘細胞標(biāo)記物P75和膠質(zhì)細胞標(biāo)記物GFAP均為陽性，說明培養(yǎng)的細胞是嗅黏膜來源，且具有干細胞特性，有多向分化潛能。

脊髓損傷早期即有IL-1β、IL-6等表達上調(diào)，在脊髓損傷后神經(jīng)元凋亡過程中扮演重要角色[17,25-26]。本研究顯示，IL-1β具有明顯誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的作用。本研究使用MAP2抗體對神經(jīng)元進行標(biāo)記，使用TUNEL法對凋亡細胞進行染色，計算神經(jīng)元凋亡率，避免混雜其他細胞對實驗結(jié)果造成影響。

本研究在體外條件下觀察到，大鼠OM-NSCs對神經(jīng)元有較好保護作用，可有效減少神經(jīng)元凋亡。為OM-NSCs移植治療脊髓損傷提供細胞實驗參考。但具體保護機制，以及OM-NSCs移植治療脊髓損傷的實際效果，有待進一步研究。