林建平，王喜，劉午龍，陳藝敏，陳少清，王詩(shī)忠

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福建福州市350003；2.福建省康復(fù)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州市350003；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州市350122；4.福建醫(yī)科大學(xué)，福建福州市350122

隨著生活與工作形式的改變，脊柱退變呈現(xiàn)出年輕化、多樣化趨勢(shì)。椎旁肌，尤其是豎脊肌衰老性萎縮導(dǎo)致骨骼肌質(zhì)量減少和功能減退，是引起脊柱退行性疾病的重要因素。機(jī)體蛋白質(zhì)分解能力增強(qiáng)，合成能力相對(duì)降低，引起蛋白合成與分解的負(fù)平衡，是骨骼肌質(zhì)量隨衰老減少的重要原因，骨骼肌萎縮最顯著的特征是骨骼肌蛋白分解增加和蛋白合成減少[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2-5]，骨骼肌蛋白分解與ATP-泛素-蛋白酶體途徑(ATP-ubiquitin-proteasome pathway,UPP)密切相關(guān)，泛素蛋白連接酶E3是這一途徑的關(guān)鍵酶，尤其是在骨骼肌中特異性表達(dá)的肌萎縮F-box蛋白(muscle atrophy F-box,MAFbx)和肌環(huán)指蛋白1(muscle RING finger 1,MuRF1)兩種E3蛋白，在導(dǎo)致骨骼肌蛋白降解增加引起肌肉萎縮過(guò)程中起著重要作用。我們發(fā)現(xiàn)[6]，督脈灸對(duì)脊柱退行性病變有良好療效。本研究分析督脈灸對(duì)骨骼肌衰老大鼠骨骼肌UPP的影響，探討督脈灸對(duì)衰老性肌萎縮的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)健康雄性Sprague-Dawley大鼠30只，12周齡，體質(zhì)量(270±30)g，合格證號(hào)SYXK(閩)2014-0001。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫20～22℃，相對(duì)濕度45%～55%，12 h明暗交替，自由進(jìn)食飲水。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組和督脈灸組，每組10只。

1.2 主要試劑及儀器

MuRF1 抗 體 (sc-27642， 1∶ 250)、 驢 抗 山 羊IgG-HRP(SC-2020)：SANTA CRUZ公司。Fbx32抗體(ab74023，1∶500)、泛素抗體(ab33893，1∶1000)、β-actin抗體(1∶10000)：ABCAM公司。電泳儀、半干法轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)：BIO-RAD公司。

1.3 造模[7]

模型組和督脈灸組每天頸背部皮下注射D-半乳糖125 mg/kg[8]，連續(xù)6周(42 d)?？瞻捉M每天同法注射等量生理鹽水。

1.4 督脈灸

造模結(jié)束后，督脈灸組行督脈灸治療[9]。大鼠俯臥位固定，沿背部脊柱部位剪毛寬約0.5 cm，將6根艾條用竹簽串連，點(diǎn)燃后置于大椎穴至腰俞穴之間，艾條最低點(diǎn)距大鼠皮膚4～5 cm。每天20 min，連續(xù)20 d。

1.5 Western blotting

干預(yù)結(jié)束后，大鼠稱重，2%戊巴比妥鈉腹腔注射處死80 mg/kg，暴露分離脊柱周圍肌肉，剝離雙側(cè)豎脊肌，-80℃冰箱保存。

稱取豎脊肌組織50 mg，加入裂解液，冰上研磨均勻后靜置30 min，4℃、14000 r/min離心20 min，取上清液，BCA測(cè)蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離，半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至膜上，室溫封閉1 h，分別加入泛素、MuRF1、Fbx32、β-actin一抗孵育，4℃過(guò)夜，驢抗山羊IgG-HRP二抗室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，Image-lab圖像分析系統(tǒng)分析。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)灰度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

與空白組相比，模型組泛素、MuRF1、MAFbx蛋白表達(dá)水平上升(P＜0.05)；與模型組相比，督脈灸組泛素、MuRF1、MAFbx蛋白表達(dá)水平下降(P＜0.05)。見(jiàn)表1、圖1。

圖1 各組泛素、MuRF1、MAFbx蛋白表達(dá)(Western blotting)

表1 各組泛素、MuRF1和MAFbx蛋白表達(dá)(/β-actin)

3 討論

督脈循行在背部正中，為陽(yáng)脈之綱，“總督諸陽(yáng)”，可調(diào)節(jié)全身陽(yáng)氣。脊柱退行性病變?yōu)槎矫}陽(yáng)氣虛，通督強(qiáng)脊，扶陽(yáng)固本可改善脊柱退行性病變。

衰老性肌萎縮的發(fā)病涉及多種因素，如蛋白合成與分解的負(fù)平衡、激素變化、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、線粒體功能障礙、神經(jīng)肌肉調(diào)節(jié)功能退化、運(yùn)動(dòng)單位數(shù)量減少等[10]。Kim等[11]認(rèn)為，UPP在衰老性肌萎縮中發(fā)揮重要作用。MuRF1和MAFbx可以通過(guò)調(diào)節(jié)自身生物活性，或通過(guò)上游因子，參與衰老性肌萎縮。

目前所知蛋白質(zhì)降解方式主要包括UPP、鈣依賴的蛋白酶途徑、溶酶體蛋白酶途徑、Caspase和凋亡蛋白酶體途徑[12]。蛋白降解主要是通過(guò)UPP完成，在各類肌萎縮中都發(fā)揮重要作用，約降解骨骼肌細(xì)胞蛋白質(zhì)的50%～70%[13]。生理狀態(tài)下，UPP降解體內(nèi)受到損傷、功能不全的蛋白質(zhì)。UPP也稱泛素蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system,UPS)或泛素系統(tǒng)，主要由泛素和26S蛋白酶體組成[14]，在一系列關(guān)聯(lián)酶，包括泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3等的催化下，泛素與目標(biāo)蛋白結(jié)合，提供一個(gè)標(biāo)記，使其能夠被26S蛋白酶體所識(shí)別；之后將底物靶蛋白降解，同時(shí)釋放出游離的泛素，可以循環(huán)利用[15]。這一途徑有兩個(gè)步驟。

第1步是靶蛋白泛素化：①伴隨ATP提供能量，泛素被E1激活，E1上的活化位點(diǎn)半胱氨酸殘基和泛素上C端活化的甘氨酸殘基結(jié)合，形成高能硫酯鍵；②泛素經(jīng)E1轉(zhuǎn)到E2上，釋放出E1，形成E2-泛素復(fù)合物；③E3識(shí)別并結(jié)合底物蛋白；④泛素經(jīng)E2轉(zhuǎn)到E3上，結(jié)合成高能鍵。E1只有一種或幾種，E2有約數(shù)十種，而E3達(dá)數(shù)千種之多。E3是這一途徑的關(guān)鍵酶，UPP的特異性和速度由E3決定[16]。E2在與底物靶蛋白的結(jié)合上，有一定專一性，但由于E3種類更多，有更高的專一性。作為UPP中重要的限速步驟，機(jī)體對(duì)E3的調(diào)控非常復(fù)雜及嚴(yán)格，E3對(duì)底物靶蛋白的選擇性識(shí)別發(fā)揮著重要作用[14]。

第2步是蛋白降解：①底物在19S蛋白酶體的作用下，經(jīng)由裂隙進(jìn)入20S被降解；②在相關(guān)酶類等的作用下，釋放出游離泛素，參與下次循環(huán)。

在肌萎縮發(fā)生時(shí)，由于UPP激活，導(dǎo)致蛋白降解增加；蛋白酶體抑制劑能夠阻斷蛋白酶體途徑，從而抑制蛋白降解[17]。在大鼠的多種肌萎縮模型中均可發(fā)現(xiàn)一種物質(zhì)表達(dá)水平顯著增高，稱為MAFbx[18]。同時(shí)，人們也發(fā)現(xiàn)了另外一個(gè)與骨骼肌萎縮密切相關(guān)的物質(zhì)Atrogin-1[19]。研究證實(shí)，MAFbx和Atrogin-1是同一種物質(zhì)，在骨骼肌萎縮中發(fā)揮重要作用。Atrogin-1中含有一個(gè)PDZ結(jié)合域、一個(gè)核定位序列和一個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，這些部位均和蛋白質(zhì)之間的相互作用有關(guān)。Atrogin-1中還含有一個(gè)與結(jié)合底物靶蛋白功能有密切關(guān)系的F-box功能結(jié)構(gòu)域[20]。Atrogin-1能與Skp1、Rbx1和Cul1結(jié)合，共同組成SCF型E3復(fù)合物。Atrogin-1的表達(dá)水平升高，導(dǎo)致E3表達(dá)增強(qiáng)，從而促進(jìn)泛素激活及表達(dá)水平升高，增強(qiáng)UPP，引起骨骼肌蛋白分解增加，導(dǎo)致肌肉萎縮。

MuRF1是另一個(gè)與骨骼肌萎縮密切相關(guān)、在骨骼肌中特異性表達(dá)的泛素連接酶E3[18]。MuRF1蛋白含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域：①Ring-Finger結(jié)構(gòu)域，即E3的活性區(qū)，是保持E3酶活性所所需的結(jié)構(gòu)；②功能尚不清楚的B-box結(jié)構(gòu)；③MuRF1與蛋白形成異二聚體所必需的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域。MuRF1正常發(fā)揮功能，與Ring結(jié)構(gòu)域密切相關(guān)，一旦這個(gè)結(jié)構(gòu)被破壞，肌肉萎縮會(huì)受到抑制。MuRF1可以通過(guò)與肌節(jié)蛋白titin的激酶區(qū)結(jié)合，參與維持并調(diào)節(jié)M線和粗肌絲的完整性；如果激酶區(qū)和聯(lián)結(jié)區(qū)域出現(xiàn)破壞和缺失，將引起肌節(jié)降解和肌肉力量下降[21]。而如果MuRF1表達(dá)水平過(guò)高，將會(huì)引起肌節(jié)蛋白titin與MuRF1的結(jié)合部位破壞，導(dǎo)致蛋白降解增加。在衰老、癌癥、損傷等引起的肌肉萎縮中，MuRF1表達(dá)水平明顯升高；敲除小鼠MuRF1基因能有效降低骨骼肌蛋白降解速度，抵抗肌萎縮[18]。作為泛素連接酶E3中的兩種關(guān)鍵因子，Atrogin-1/MAFbx和MuRF1的表達(dá)水平在多種肌萎縮模型中都明顯上升[20]，可以作為標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)進(jìn)行深入研究[22]。

本研究通過(guò)檢測(cè)骨骼肌中泛素、MuRF1、MAFbx等關(guān)鍵指標(biāo)的表達(dá)，探討督脈灸改善肌肉萎縮的作用機(jī)制。研究顯示，肌肉萎縮可能與UPP中泛素、MuRF1、MAFbx的表達(dá)升高有關(guān)；而督脈灸能降低大鼠骨骼肌中泛素、MuRF1和MAFbx蛋白表達(dá)水平。督脈灸可能影響UPP，減輕肌肉蛋白降解，延緩肌肉萎縮。