劉文波，高貝貝，楊春燕，張瑾錦

（濱州醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，煙臺 264003）

腸道是機體消化系統(tǒng)主要組成部分，具有免疫調(diào)節(jié)、黏膜屏障等功能，腸粘膜屏障在維護腸道功能中發(fā)揮重要作用。腸上皮細胞糖萼是覆蓋于上皮細胞表面的一層富含多糖的結(jié)構(gòu)，也是腸粘膜屏障的組成部分，其在腸粘膜損傷中會發(fā)生改變。1966年Luft等[1]首次利用透射電子顯微鏡觀察到糖萼的存在。以往研究多見于血管內(nèi)皮糖萼，迄今為止，利用特殊方法顯示腸粘膜糖萼的報道尚不多見。本實驗擬以大鼠為研究對象，以脂多糖（LPS）制造腸粘膜損傷模型[2]，利用硝酸鑭作為腸上皮細胞糖萼示蹤劑，取小腸組織制備超薄切片，利用透射電子顯微鏡觀察腸上皮糖萼，以探討硝酸鑭作為示蹤劑顯示腸上皮細胞表面糖萼的效果。

材料和方法

1 主要試劑和儀器

脂多糖（LPS，美國Sigma公司），二甲胂酸鈉（山東西亞化工有限公司，進口分裝，批號：N6347），硝酸鑭（天津福晨化學(xué)試劑廠，批號：20080317），戊二醛（美國Alfa Aesar公司），鋨酸（美國Ted Pella公司），Epon812環(huán)氧樹脂(美國SPI公司 )。

透射電子顯微鏡（日本JEOL公司，JEM-1400型，配美國Gatan公司792型CCD），超薄切片機（德國Leica公司，UC7型）。

2 實驗材料與方法

雄性SD大鼠（體質(zhì)量220±20g）6只，購自山東省濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，實驗動物合格證 No∶0024545，許可證號：SCXK(魯)20140007，隨機分成2組，每組3只，分別為對照組( A組)和模型組( B組)；各組動物在相同條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)7d，自由飲食、飲水。造模前1d禁食不禁水，造模當(dāng)天行腹腔注射，A組腹腔注射生理鹽水，B組腹腔注射LPS 0.5mg/kg(生理鹽水配制)，注射6h后各組動物進行取材。

3 動物處理及取材

各組動物經(jīng)4%水合氯醛麻醉后，打開腹腔，取空腸組織3塊，標(biāo)本經(jīng)生理鹽水漂洗后置于含2.5%戊二醛、2%硝酸鑭的0.1mol/L二甲胂酸鈉溶液（pH 7.4）中，標(biāo)本均于4℃低溫下固定24h。

4 透射電鏡樣品制備

將經(jīng)過固定的標(biāo)本用0.1mol/L二甲胂酸鈉緩沖液漂洗，再經(jīng)1%鋨酸（由二甲砷酸緩沖液配制，4℃條件下）后固定1.5h，緩沖液漂洗后經(jīng)梯度乙醇脫水至無水，再經(jīng)丙酮置換，Epon812浸透、包埋，升溫聚合后進行半薄切片定位到腸粘膜游離面縱切方向，切70nm厚度超薄切片撈于200目銅網(wǎng)上，兩組切片不經(jīng)染色直接在透射電鏡下觀察、拍照。

結(jié) 果

糖萼廣泛存在于哺乳動物細胞膜的表面，尤以上皮細胞和內(nèi)皮細胞糖萼更為豐富。上皮細胞表面的糖萼富含多糖，常與細胞膜上脂類和蛋白質(zhì)結(jié)合形成糖脂和糖蛋白。糖萼帶有負(fù)電荷，三價陽離子鑭與之結(jié)合后在透射電鏡下原位顯示為覆蓋于細胞表面的高電子密度致密物。正常腸粘膜表面富含糖萼，硝酸鑭與其結(jié)合使其保存下來，在后期制樣中也不容易流失，透射電鏡下可見到小腸黏膜上皮細胞微絨毛頂端及側(cè)面均有鑭鹽附著，多呈高電子密度的團簇狀，微絨毛頂端更為豐富（圖1A），腸粘膜損傷后糖萼明顯減少乃至消失，故高密度的鑭鹽數(shù)量和分布均明顯減少（圖1B）。

圖1 大鼠小腸上皮細胞微絨毛糖萼透射電鏡觀察（超薄切片未經(jīng)染色）。A,對照組，糖萼經(jīng)硝酸鑭染色，呈高電子密度團簇狀（箭頭）附著于微絨毛(MV)表面及側(cè)面；B,模型組，微絨毛表面及側(cè)面的糖萼數(shù)量明顯減少；比例尺，0.5μmFig. 1 Transmission electron microscopic observation of glycalyx on the microvilli of rat intestinal epithelial cells ( not stained by uranium acetate and lead citrate). A, control group, glycalyx stained with lanthanum nitrate, a large number of clusters of lanthanum salt (arrow) were deposited on the surface and side of microvilli; B, model group, the deposition of lanthanum salt on the surface and side of microvilli obviously decreased. MV, microvilli;scale bar, 0.5μm

討 論

腸上皮細胞糖萼是上皮細胞產(chǎn)生的糖蛋白，其糖鏈含半乳糖、葡萄糖、巖藻糖、甘露糖和唾液酸等糖基。帶正電荷的硝酸鑭可與帶負(fù)電荷的糖基結(jié)合，在透射電鏡下呈現(xiàn)高電子密度，從而原位顯示出糖萼的位置和數(shù)量。上皮細胞糖萼對上皮細胞有保護作用，在細胞識別中起重要作用，細胞表面的糖鏈能吸收胰蛋白酶和胰淀粉酶等消化酶，微絨毛表面有雙糖酶和多肽酶，故腸上皮細胞的微絨毛與表面的糖萼是消化的關(guān)鍵場所，又是物質(zhì)吸收的門戶。

在常規(guī)透射電鏡制樣中標(biāo)本需經(jīng)過多次緩沖液漂洗和乙醇、丙酮等有機溶劑脫水，造成糖萼在制樣中不斷流失，最終在透射電鏡下很難直接觀察到糖萼的存在，故鮮有采用常規(guī)透射電鏡方法研究細胞表面糖萼的報道。1966年Luft等[1]應(yīng)用釕紅染色首次在電子顯微鏡下觀察到內(nèi)皮細胞表面約20nm厚呈毛絨狀的糖萼的存在。Haldenby等[3]以阿利新藍（alcian blue）代替釕紅觀察到了兔動脈內(nèi)皮細胞表面厚度約45-80nm的糖萼。吳雙等[4]利用阿利新藍和硝酸鑭染色觀察了小鼠空腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞表面糖萼的形態(tài)及厚度，劉增波等[5]利用硝酸鑭示蹤顯示腎小球血管內(nèi)皮細胞糖萼的結(jié)構(gòu)，也獲得良好的效果。Hegermann J 等[6]利用膠體態(tài)的氧化釷作示蹤劑觀察了大鼠腎小球血管內(nèi)皮細胞表面糖萼，觀察到的厚度50～300nm。由于各種糖萼染料的性質(zhì)差異及樣品固定方法的不同，導(dǎo)致細胞表面糖萼形態(tài)和厚度的觀察結(jié)果有很大差異[7]。冷凍蝕刻透射電鏡技術(shù)是觀察細胞表面糖萼的有效技術(shù)，Ghadially 等[8]應(yīng)用冷凍蝕刻復(fù)型技術(shù)原位觀察到腸上皮細胞微絨毛表面保存完好地糖萼結(jié)構(gòu)。Ebong等[9]通過高壓冷凍-冷凍替代的方法也較好地保存了糖萼結(jié)構(gòu)，測得其厚度達1μm以上，但受到儀器設(shè)備制約，這兩種技術(shù)應(yīng)用受到很大限制。

本實驗應(yīng)用硝酸鑭示蹤來顯示小腸上皮細胞微絨毛表面的糖萼，超薄切片不需染色即可直接觀察，由于沒有鉛、鈾等染料的干擾，實驗結(jié)果直觀且明確。實驗結(jié)果顯示正常大鼠小腸上皮細胞微絨毛表面有大量糖萼存在，微絨毛頂端和側(cè)面均有，在微絨毛頂端糖萼最為豐富；而受損傷的模型組的小腸上皮細胞微絨毛表面糖萼明顯減少，很多部位甚至消失，與預(yù)期結(jié)果一致。實驗結(jié)果表明應(yīng)用硝酸鑭示蹤腸上皮細胞糖萼是一種簡單有效的方法，可以應(yīng)用于各種腸粘膜損傷導(dǎo)致的糖萼數(shù)量改變的研究中。