于衛(wèi)東，趙穎，譚光明，李守杰，李曉賽，查玉梅，侯為開(kāi)

(1沂水縣人民醫(yī)院，山東沂水276400；2山東大學(xué)齊魯醫(yī)院)

糖尿病患者易較早出現(xiàn)白內(nèi)障，且病情進(jìn)展迅速。長(zhǎng)期高血糖可刺激機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)發(fā)生非酶糖基化，引起多種異構(gòu)體在人體內(nèi)發(fā)生蓄積，臨床上將其稱(chēng)為糖基化終產(chǎn)物(AGEs)[1]。AGEs能與細(xì)胞膜上的糖基化終產(chǎn)物受體結(jié)合，促進(jìn)糖尿病患者白內(nèi)障的發(fā)生與發(fā)展[2,3]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的多肽，可通過(guò)影響晶狀體上皮細(xì)胞引起晶狀體前、后囊膜下發(fā)生纖維化，在白內(nèi)障的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4]。2014年11月～2016年12月，本研究觀察了糖尿病并發(fā)白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜組織TGF-β表達(dá)、血清AGEs水平變化，現(xiàn)分析兩者在糖尿病并發(fā)白內(nèi)障中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期沂水縣人民醫(yī)院收治的糖尿病并發(fā)白內(nèi)障患者20例作為觀察組，男13例、女7例，年齡60～83(70.46±4.56)歲，糖尿病病程5～14(9.68±3.14)年，白內(nèi)障病程1～7(4.15±1.04)年。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合WHO 1998年制定的2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)；②符合白內(nèi)障診斷標(biāo)準(zhǔn)，即晶狀體發(fā)生變性和混濁，變?yōu)椴煌该?，以致影響視力。排除?biāo)準(zhǔn)：①合并惡性腫瘤或嚴(yán)重心、肝、腎功能不全者；②合并其他眼部疾病者。選擇同期收治的單純白內(nèi)障患者20例作為對(duì)照組，男11例、女9例，年齡61～84(69.73±4.49)歲，白內(nèi)障病程1～8(4.01±1.00)年。對(duì)照組白內(nèi)障診斷明確，空腹血糖均在正常范圍(3.9～6.1 mmol/L)。本研究通過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核，患者及其家屬均知情同意。

1.2 晶狀體前囊膜組織TGF-β蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Dot blot法。兩組入院第二天均行常規(guī)白內(nèi)障超聲乳化人工晶狀體移植術(shù)，術(shù)中取出晶狀體囊膜。利用撕囊鑷將其撕開(kāi)，獲得直徑為5～7 mm的前囊膜組織，立即將其放入含RNase酶的EP管中，- 80 ℃保存?zhèn)溆?。取出部分保存?zhèn)溆玫木铙w前囊膜組織，充分研磨后加入細(xì)胞裂解液，抽取蛋白。加熱使蛋白變形，取2 μL蛋白樣品加入硝酸纖維素膜上，晾干后加入濃度為5%的胎牛血清封閉20 min。加入一抗(稀釋比例1∶200)，常溫下孵育30 min；加入PBS漂洗3次，加入二抗(稀釋比例1∶500)，常溫下孵育30 min。加入ECL化學(xué)發(fā)光，孵育1 min，X線膠片下曝光、顯影、定影。采用ImagePro軟件定量分析條帶灰度值。每個(gè)樣本重復(fù)實(shí)驗(yàn)2～3次，取平均值。

1.3 晶狀體前囊膜組織TGF-β各亞型mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取1.2中部分保存?zhèn)溆玫木铙w前囊膜組織，充分研磨后采用TRIzol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。TGF-β1上游引物：5′-AGCGACTCGCCAGAGTGGTTA-3′，下游引物：5′-GCAGTGTGTTATCCCTGCTGTCA-3′，引物長(zhǎng)度293 bp；TGF-β2上游引物：5′-ACGGGGCGGGGCGGTGGA-3′，下游引物：5′-ACGGGGCGGGGCGGTGGA-3′，引物長(zhǎng)度124 bp；TGF-β3上游引物：5′-GGGCTCATCGGAGTAACTTTCC-3′，下游引物：5′-TCTCTCGGTCATTCCCTTGG-3′，引物長(zhǎng)度261 bp；內(nèi)參β-action上游引物：5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，下游引物：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′，引物長(zhǎng)度118 bp。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 血清AGEs檢測(cè) 采用ELISA法。兩組入院第2天均留取空腹肘靜脈血3 mL，離心后分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用ELISA法檢測(cè)血清AGEs水平，嚴(yán)格按照AGEs試劑盒使用說(shuō)明書(shū)操作。試劑盒購(gòu)自北京方程生物科技有限公司。

1.5 觀察組晶狀體前囊膜組織TGF-β表達(dá)與血清AGEs水平關(guān)系的分析 采用Pearson相關(guān)分析法分析觀察組晶狀體前囊膜組織TGF-β蛋白表達(dá)及其各亞型mRNA表達(dá)與血清AGEs水平的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 兩組晶狀體前囊膜組織TGF-β蛋白表達(dá)及血清AGEs水平比較 觀察組與對(duì)照組晶狀體前囊膜組織TGF-β蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為45 863.58±231.08、32 314.88±158.42，血清AGEs水平分別為(17.26±2.32)、(11.15±1.95)μg/L；兩組比較P均<0.01。

2.2 兩組晶狀體前囊膜組織TGF-β各亞型mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 觀察組晶狀體前囊膜組織TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，TGF-β2mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組(P均<0.05)；兩組晶狀體前囊膜組織TGF-β3mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組晶狀體前囊膜組織TGF-β各亞型mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.3 觀察組晶狀體前囊膜組織TGF-β表達(dá)與血清AGEs水平的關(guān)系 觀察組晶狀體前囊膜組織TGF-β蛋白表達(dá)、TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量與血清AGEs水平均呈正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.86、0.93，P均<0.01)，晶狀體前囊膜組織TGF-β2mRNA相對(duì)表達(dá)量與血清AGEs水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.84，P<0.01)，晶狀體前囊膜組織TGF-β3mRNA相對(duì)表達(dá)量與血清AGEs水平無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。

3 討論

糖尿病患者發(fā)生白內(nèi)障的相關(guān)因子及調(diào)控機(jī)制仍不清楚。TGF-β是一種分泌型多肽信號(hào)分子，具有促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成和組織修復(fù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化等作用[5]。TGF-β有三種不同的亞型，即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。TGF-β1在細(xì)胞或組織中的含量最為豐富，主要與慢性炎癥或纖維化相關(guān)。TGF-β2可表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞中，在上皮細(xì)胞的分化及成熟中發(fā)揮作用；TGF-β2可調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)合成，抑制晶狀體上皮細(xì)胞的增殖，對(duì)于維持眼的正常生理功能具有重要作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)可產(chǎn)生TGF-β3，并且TGF-β3在間質(zhì)細(xì)胞中亦有表達(dá)[6～9]。研究顯示，TGF-β在糖尿病患者并發(fā)白內(nèi)障的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，TGF-β過(guò)度表達(dá)可能參與了糖尿病患者前囊膜下白內(nèi)障的發(fā)生[10]。亦有研究顯示，TGF-β細(xì)胞因子能通過(guò)誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而參與白內(nèi)障發(fā)生[11]。此外，TGF-β還可能通過(guò)增強(qiáng)纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原蛋白、平滑肌肌動(dòng)蛋白mRNA表達(dá)而發(fā)揮作用[12,13]。本研究結(jié)果顯示，觀察組晶狀體前囊膜組織TGF-β蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，提示晶狀體前囊膜上皮細(xì)胞TGF-β表達(dá)升高在糖尿病患者并發(fā)白內(nèi)障的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究?jī)山M各亞型mRNA表達(dá)均出現(xiàn)差異性，觀察組晶狀體前囊膜組織TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，TGF-β2mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，兩組TGF-β3mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TGF-β1表達(dá)升高提示患者纖維化或炎癥水平較為明顯，TGF-β2表達(dá)降低提示患者晶狀體上皮細(xì)胞增殖較為明顯，說(shuō)明TGF-β1、TGF-β2介導(dǎo)的纖維化或炎癥水平加重及晶狀體上皮細(xì)胞增殖共同參與了糖尿病并發(fā)白內(nèi)障的發(fā)病過(guò)程。

AGEs是由還原糖在無(wú)酶催化下與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等反應(yīng)生成的大分子物質(zhì)，易積聚于各個(gè)組織、器官間隙[14]。AGEs在正常機(jī)體內(nèi)的形成過(guò)程很緩慢，與蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞氧化應(yīng)激及炎癥等均有關(guān)。研究表明，長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)可以增強(qiáng)非酶糖基化作用，加速AGEs在晶狀體的形成和積累，己形成的AGEs可能通過(guò)修飾蛋白質(zhì)等直接作用或發(fā)生配體-受體作用啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而參與糖尿病并發(fā)白內(nèi)障的發(fā)生、發(fā)展[15～18]。本研究結(jié)果顯示，觀察組血清AGEs水平明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明血清AGEs水平升高可能與糖尿病患者并發(fā)白內(nèi)障有關(guān)；觀察組血清AGEs水平與晶狀體前囊膜組織TGF-β蛋白表達(dá)、TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系，與TGF-β2mRNA相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與TGF-β3mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯相關(guān)性，表明TGF-β與AGEs尤其是TGF-β1、TGF-β2亞型相互作用，二者可能共同參與了糖尿病并發(fā)白內(nèi)障的發(fā)生、發(fā)展，也說(shuō)明AGEs與TGF-β1、TGF-β2介導(dǎo)的纖維化或炎癥水平加重及晶狀體上皮細(xì)胞增殖共同參與了糖尿病患者并發(fā)白內(nèi)障的發(fā)病過(guò)程。AGEs與TGF-β1、TGF-β2之間的相互作用及調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，糖尿病并發(fā)白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜組織TGF-β蛋白表達(dá)、TGF-β1mRNA表達(dá)及血清AGEs水平均升高，晶狀體前囊膜組織TGF-β2mRNA表達(dá)降低；TGF-β1、TGF-β2與AGEs可能共同參與了糖尿病患者白內(nèi)障的發(fā)生過(guò)程。