塞娜 袁碩龍 郭維維 唐朝穎 張桐 趙偉豪 陳林軍 徐良慰 時(shí)晰張悅 邱仕偉 楊仕明 韓維舉

中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉研究所聾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，聾病防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，軍事聲損傷防護(hù)實(shí)驗(yàn)室（北京100853）

【關(guān)鍵字】噪聲性耳聾；炎癥復(fù)合體；蛋白質(zhì)組學(xué)iTRAQ；白介素-1β；NLRP3

噪聲引起的聽(tīng)力損傷是多種因素綜合作用的結(jié)果，而損傷程度又因患者的年齡、易感性、噪聲的強(qiáng)度、接觸時(shí)間、頻譜特性的不同而有所差異。噪聲引起聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)損傷機(jī)制包括機(jī)械損傷、耳蝸微循環(huán)損傷、代謝紊亂導(dǎo)致毛細(xì)胞死亡等，而噪聲損傷引起內(nèi)耳的免疫/炎癥可能是噪聲損傷的重要環(huán)節(jié)，近年來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展使得我們有可能闡明耳蝸炎癥復(fù)合體在耳蝸噪聲損傷中的作用。同位素標(biāo)記的相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）[1,2]是美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（Applied Biosystems Incorporation，ABI）研發(fā)的一種多肽體外標(biāo)記技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)iTRAQ試劑特異性標(biāo)記蛋白質(zhì)的氨基酸N端及賴氨酸側(cè)鏈，而后進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，可同時(shí)比較多種不同樣品中蛋白質(zhì)的相對(duì)/絕對(duì)含量。基于其靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、高通量等優(yōu)勢(shì)[3]，目前已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)和臨床研究的相關(guān)領(lǐng)域[4]。

小型豬的內(nèi)耳形態(tài)結(jié)構(gòu)與聽(tīng)功能方面與人類具有高度相似性[5-6]。本研究采用iTRAQ技術(shù)研究小型豬耳蝸蛋白質(zhì)組在噪聲暴露前后的差異，并進(jìn)行生物學(xué)分析，以揭示免疫和炎癥等因素對(duì)噪聲性聽(tīng)力損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)用小型豬30只，體重5kg左右，性別不限，由涿州市康寧小型豬養(yǎng)殖有限公司提供，集中飼養(yǎng)于21-24℃、相對(duì)濕度50-80%的環(huán)境中。動(dòng)物均無(wú)噪聲接觸史，未使用過(guò)耳毒性藥物，并且耳鏡檢查鼓膜正常。

1.2 小型豬穩(wěn)態(tài)噪聲性聾模型的建立

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌瑢?dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=10)，噪聲暴露后一天組(n=10)和噪聲暴露后七天組(n=10)。將清醒的小型豬置于50×30×25cm的籠內(nèi)，放置于密閉聲場(chǎng)，使用120dB(A)白噪聲連續(xù)暴露2天，每天3小時(shí)。

1.3 聽(tīng)性腦干反應(yīng)測(cè)試（Auditory brainstem response,ABR）

用速眠新Ⅱ0.25ml/kg+戊巴比妥鈉0.03g/kg肌肉注射復(fù)合麻醉動(dòng)物。待其進(jìn)入深度麻醉后，連接TDT電極。選擇短聲“Click”，短純音“tone burst”：設(shè)定頻率包括2kHz、4kHz、8kHz、16kHz、24kHz，聲音強(qiáng)度設(shè)定為為20-90dB SPL，按10dB SPL遞減，在接近聽(tīng)閾時(shí)給聲遞減間隔為5dB SPL。同樣方法測(cè)試雙側(cè)耳。以能分辨出可重復(fù)的ABRⅤ波的最低刺激強(qiáng)度為閾值。具體電極連接方式及參數(shù)設(shè)置詳見(jiàn)既往文獻(xiàn)報(bào)道[7]。

1.4 同位素標(biāo)記的相對(duì)和絕對(duì)定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)

三組各隨機(jī)抽取3只動(dòng)物，麻醉后迅速斷頭處死，取出雙側(cè)耳蝸后用PBS沖洗后迅速放入液氮中冷凍10min，之后置于-80℃冰箱保存。

iTRAQ實(shí)驗(yàn)流程：

耳蝸樣品制備（提取蛋白）→SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白質(zhì)量→（樣品蛋白合格）胰蛋白酶Trypsin酶解→iTRAQ試劑標(biāo)記分級(jí)→質(zhì)譜分析→軟件分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析→生物信息學(xué)分析（GO分析、KEGGPathway）。

1.4.1 蛋白質(zhì)抽提及定量

用研缽將豬耳蝸研碎，蛋白質(zhì)提取及定量方法詳見(jiàn)既往文獻(xiàn)報(bào)道[8]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相關(guān)系數(shù)R2=0.9714＞0.95,認(rèn)為蛋白量與OD吸光值有線性相關(guān)關(guān)系。12%的SDS-PAGE電泳測(cè)定總蛋白在14-100kDa分子量范圍內(nèi)得到一定的分離，三組樣本組內(nèi)的蛋白條帶具有相似的帶型。

1.4.2 蛋白樣品胰蛋白酶消化與iTRAQ試劑肽段標(biāo)記

具體實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)既往文獻(xiàn)報(bào)道[8]。iTRAQ試劑標(biāo)記肽段：各組樣品肽段分別取約100μl，按照AB公司 iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit（AB SCIEX）試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行肽段標(biāo)記，不同樣品用不同大小的同位素標(biāo)記，標(biāo)記信息見(jiàn)表1。正常對(duì)照組行2次生物學(xué)重復(fù)（N1,N2），噪聲后一天組（NE1d-1,2,3）和七天組（NE7d-1,2,3)分別行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.4.3 質(zhì)譜分析

毛細(xì)管高效液相色譜及質(zhì)譜鑒定方法詳見(jiàn)既往文獻(xiàn)報(bào)道[8]。每份樣品經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后用Q-Exactive HF質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.4.4 數(shù)據(jù)分析

原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)：質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)為RAW格式文件，用軟件Sequest和Proteome Discoverer進(jìn)行搜庫(kù)定性及定量分析。

數(shù)據(jù)庫(kù)：uniprot_Sus.scrofa_160920.fasta

搜庫(kù)：搜庫(kù)時(shí)將RAW文件通過(guò)Proteome Discoverer提交至Sequest服務(wù)器，選擇已經(jīng)建立好的數(shù)據(jù)庫(kù)，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索。

1.5 Western blot檢測(cè)

三組各隨機(jī)抽取3只動(dòng)物，抽提蛋白及蛋白質(zhì)定量方法同前述。配置10ml的10%分離膠，4ml的5%濃縮膠濃度。待檢測(cè)蛋白樣品上樣量20μg/孔，濃縮膠恒壓80V，約30分鐘；分離膠恒壓120V，轉(zhuǎn)膜2小時(shí)。用5%BSA-TBST按1:1000稀釋一抗（山羊NLRP3多克隆抗體，兔Caspase-1多克隆抗體，兔IL-1β，小鼠NF-κB p65單克隆抗體，兔TNF-α多克隆抗體，小鼠β-actin單克隆抗體），4℃冰箱孵育過(guò)夜。TBST洗膜5min×3次，加入5%脫脂奶粉-TBST稀釋的二抗，室溫孵育40分鐘,TBST洗膜，10min×3次。ECL 顯影、定影后，以目的蛋白/β-actin內(nèi)參蛋白灰度比較耳蝸中上述蛋白質(zhì)的表達(dá)量。

1.6 熒光實(shí)時(shí)定量PCR

擴(kuò)增引物：NLRP3:Forward:5'-GACCTCAGCCAAGATGCAAG-3',Reverse:5'-TCTGATGCCCAGTCCAACAT-3';Caspase-1:Forward:5'-CCTCGAACTCT CCACAGGTT-3',Reverse:5'-GAAGACGCAGGCTTAACTGG-3';IL-1β:Forward:5'-CACACATGCTGAAGGCTCTC-3',Reverse:5'-GGGTGGGCGTGTTATCTTTC-3'; TNF-α:Forward: 5'-AAGGTCAACCTCCTCTCTGC-3',Reverse:5'-CCTCCCAGGTAGATGGGTTC-3';NF-κB:Forward:5'-TGCATCCACAGCTTCCAGAAC-3',Reverse:5'-CGCACAGCATTCAGGTCGTA-3';GAPDH:Forward:5'-TGGAAAGGCCATCACCATCT-3',Reverse:5'-ATGGTCGTGAAGACACCAGT-3'。使用Trizol試劑提取耳蝸中的總RNA。通過(guò)光譜測(cè)定RNA樣品的濃度和純度。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)。GADPH 作為內(nèi)參。2-△△CT方法對(duì)qRT-PCR的基因表達(dá)相對(duì)變化進(jìn)行分析。CT值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。△△CT=△CT(樣品A)-△CT（樣品B），△Ct(樣品X)=CT（樣品X,目的基因）-CT（樣品X，內(nèi)參基因）。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。通過(guò)單因素方差分析分析比較三組之間的差異，兩組數(shù)據(jù)比較使用t檢驗(yàn)。認(rèn)為P≤0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 樣本標(biāo)記信息Table 1 Information of sample tag

2 結(jié)果

2.1 小型豬噪聲性聾模型聽(tīng)力結(jié)果

所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物噪聲處理前均接受ABR測(cè)試，結(jié)果顯示30只正常小型豬ABR閾值為35.4±2.6 dB SPL。對(duì)三組動(dòng)物進(jìn)行ABR-click、tone burst測(cè)試，正常對(duì)照組小型豬10只（20耳）、噪聲后一天組小型豬10只（20耳）、噪聲后七天組小型豬10只（20耳），測(cè)試結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析詳見(jiàn)表2。用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，噪聲后一天內(nèi)平均聽(tīng)閾提高到72.1±4.1dB SPL，在4k Hz處聽(tīng)力損失最嚴(yán)重，高頻聽(tīng)力損失較低頻嚴(yán)重；噪聲后七天平均聽(tīng)閾可恢復(fù)至52.8±4.7dB SPL水平，4k Hz以上聽(tīng)力損失恢復(fù)較低頻恢復(fù)稍差。

2.2 iTRAQ實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分級(jí)脫鹽合并后的6個(gè)fraction經(jīng)質(zhì)譜分析搜庫(kù)，結(jié)果以PSM FDR≤0.01，Protein FDR≤0.01篩選過(guò)濾，共鑒定到蛋白質(zhì)2158種，相對(duì)分子量集中在10-110kDa，蛋白質(zhì)標(biāo)記效率：99.2%。

使用Proteome Discover蛋白質(zhì)組學(xué)分析軟件實(shí)現(xiàn)iTRAQ定量。根據(jù)定量結(jié)果，設(shè)定在1.2差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）閾值條件下，進(jìn)行差異蛋白篩選，F(xiàn)C≥1.2為上調(diào)，F(xiàn)C≤0.83為下調(diào)，0.83＜FC＜1.2認(rèn)為表達(dá)量無(wú)明顯差異。結(jié)果噪聲暴露后較正常組具有顯著差異表達(dá)的蛋白質(zhì)共227個(gè)，噪聲后1天和7天組顯著差異蛋白有162個(gè)。樣品定量結(jié)果中大部分蛋白質(zhì)FC應(yīng)接近1。運(yùn)用頻數(shù)分布直方圖對(duì)iTRAQ定量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，兩組樣本定量比值FC取Log2對(duì)數(shù)，見(jiàn)圖1。

圖1 蛋白定量比值分布直方圖Fig.1 Distribution of protein quantitative ratio histogram

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 Gene Ontology（GO）分析

通過(guò)搜索Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.geneontology.org）進(jìn)行基因本體分析是生物信息領(lǐng)域中一個(gè)非常重要的方法和工具。通過(guò)建立一套具有動(dòng)態(tài)形式的控制字集（controlled vocabulary），來(lái)解釋基因和蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)所發(fā)揮的作用，從而全面描述生物體中基因和基因產(chǎn)物的屬性。GO注釋分析圖詳見(jiàn)圖2。

圖2 差異蛋白GO注釋圖Fig.2 GO annotations of differential proteins

表2 三組小型豬ABR閾值結(jié)果（dB SPL）Table 2 ABR threshold for three groups of miniature pigs(dB SPL)

GO總共有三個(gè)本體（Ontology）：

1）細(xì)胞組成（Cellular Component,CC）：是一個(gè)廣義的結(jié)構(gòu)對(duì)象，這可能是一個(gè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)又或者是一個(gè)蛋白生產(chǎn)組件。本研究中，差異表達(dá)蛋白主要富集在細(xì)胞內(nèi)（Cell）和細(xì)胞器上（Organelle）。

2）分子功能(Molecular Function,MF)：描述生物活動(dòng)，也表示一些具體的對(duì)象（分子或復(fù)合物）執(zhí)行的操作。本研究中，差異表達(dá)蛋白主要富集在蛋白結(jié)合（binding）和催化活性（catalytic activity）。其中富集在蛋白結(jié)合功能的相關(guān)蛋白包括：組蛋白H3，ATP合酶，Annexin，鳥苷酸結(jié)合蛋白等；富集在催化活性功能的蛋白包括：HTRA3，LTA4H,凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）等。

3）生物過(guò)程（Biological Process,BP）：是一系列分子功能相互配合的事件，通常都有多個(gè)不同的步驟參與。本研究中，差異表達(dá)蛋白主要富集在細(xì)胞代謝過(guò)程（cellular metabolic process）、生物調(diào)節(jié)（biological regulation）、免疫過(guò)程（immune system process）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（signaling）、應(yīng)激反應(yīng)（response to stimulus）等生物學(xué)過(guò)程。其中富集在細(xì)胞代謝過(guò)程的蛋白包括：琥珀酸脫氫酶輔酶，NADH輔酶,異檸檬酸脫氫酶，ATP合酶，丙酮酸羧化酶等；富集在生物調(diào)節(jié)的蛋白包括：熱休克蛋白A1B,細(xì)胞色素C，鈣蛋白酶抑制素等；富集在免疫過(guò)程的蛋白包括：ASC,caspase-1，IL-1β,血管生成素，CD59等；富集在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白包括：NF-κB p65，TGF-β，趨化因子CCL21等；富集在應(yīng)激反應(yīng)的蛋白包括：ICAM-1，補(bǔ)體C3，CCL14等。

2.3.2 KEGG Pathway代謝通路注釋

在生物體內(nèi)，不同蛋白質(zhì)間相互影響、協(xié)同作用行使其生物學(xué)行為，KEGG Pathway是通過(guò)檢索有關(guān)信號(hào)通路（http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html）公共數(shù)據(jù)庫(kù)，分析基因或蛋白質(zhì)參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。差異蛋白的KEGG功能注釋，見(jiàn)圖3所示。本研究中，富集的KEGG pathway包括：阿爾茲海默病信號(hào)通路（Alzheimer's disease），MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway），吞噬體信號(hào)通路（Phagosome），氧化磷酸化通路（Oxidative phosphorylation)，帕金森病信號(hào)通路（Parkinson's Disease），亨廷頓病信號(hào)通路（Huntington's disease）等。

圖3 差異蛋白信號(hào)通路（KEGG pathway）注釋圖Fig.3 Annotated map of the KEGG pathway

2.4 噪聲刺激引起耳蝸炎癥復(fù)合體相關(guān)蛋白的變化

Western blot檢測(cè)正常對(duì)照組、噪聲后一天組和噪聲后七天組小型豬耳蝸蛋白質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)均有NLRP3,Caspase-1,IL-1β，NF-κB 和 TNF-α的表達(dá)，在噪聲暴露后一天組耳蝸中上述蛋白均發(fā)生顯著上調(diào)，而在噪聲暴露后七天組耳蝸中上述蛋白又有不同程度下調(diào)，但仍高于正常對(duì)照組，三組間灰度比值比較應(yīng)用單因素方差分析，具體結(jié)果見(jiàn)圖4。

熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)對(duì)照組、噪聲后一天組、噪聲后七天組小型豬耳蝸的mRNA水平，NLRP3,Caspase-1,IL-1β，NF-κB 和TNF-α的mRNA水平變化趨勢(shì)與蛋白質(zhì)表達(dá)趨勢(shì)具有一致性，三組間2-△△CT比較使用單因素方差分析，具體結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 噪聲刺激引起耳蝸炎癥復(fù)合體及相關(guān)蛋白的變化情況Fig.4 Changes of cochlea inflammasome-related proteins and mRNAlevels

3 討論

3.1 小型豬穩(wěn)態(tài)噪聲性聽(tīng)力損傷特點(diǎn)

本研究利用120dB(A)白噪聲對(duì)小型豬進(jìn)行連續(xù)噪聲暴露，首次成功構(gòu)建了小型豬穩(wěn)態(tài)噪聲性耳聾模型。小型豬是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中除靈長(zhǎng)類外和人類進(jìn)化關(guān)系最近的物種，但較靈長(zhǎng)類來(lái)說(shuō)不存在倫理問(wèn)題，它與人類在基因、解剖及病理生理學(xué)方面十分相似，尤其是內(nèi)耳器官的結(jié)構(gòu)與人類極為接近,耳蝸鼓階尺寸與人類基本一致[5-6]。小型豬的耳蝸電生理測(cè)試與人類非常相似，ABR可以分化出七個(gè)波，以Ⅱ波和Ⅴ波最穩(wěn)定、重復(fù)率最高，且波形和潛伏期都與人類相近，而人的ABR以Ⅴ波最顯著，小鼠、大鼠、豚鼠等只能分化出Ⅰ-Ⅴ波，說(shuō)明豬在整個(gè)聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路上的神經(jīng)核團(tuán)與人類基本相似。

我們發(fā)現(xiàn)小型豬NIHL早期在4kHz聽(tīng)力損失最嚴(yán)重，高頻聽(tīng)力損失重于低頻，這一表現(xiàn)與人類NIHL基本一致。研究表明小型豬外耳道平均長(zhǎng)度4.1cm[9]，與人類外耳道3cm接近，外耳道共振頻率都在3-4kHz，對(duì)噪聲中該頻率的聲音成分增益最大，因此對(duì)耳蝸的破壞力也最大。陳志婷等[7]用145dB SPL脈沖噪聲首次成功建立爆震性耳聾小型豬模型，發(fā)現(xiàn)50次以上的脈沖噪聲暴露后即刻可造成聽(tīng)閾平均升高70dB SPL以上，這比本研究中穩(wěn)態(tài)噪聲暴露后平均聽(tīng)閾上升38.4dB SPL高很多，說(shuō)明脈沖噪聲對(duì)聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的破壞更嚴(yán)重；他們還發(fā)現(xiàn)噪聲暴露后一周內(nèi)聽(tīng)力恢復(fù)最快，第2-8周的聽(tīng)閾基本穩(wěn)定，這與本研究中穩(wěn)態(tài)噪聲性聾模型聽(tīng)閾改變趨勢(shì)相一致。此外，脈沖噪聲損傷后耳蝸中轉(zhuǎn)和底轉(zhuǎn)Corti氏器結(jié)構(gòu)雖基本保持正常，但內(nèi)、外毛細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的缺失[5，7]，而在穩(wěn)態(tài)噪聲暴露后未觀察到耳蝸有內(nèi)毛細(xì)胞的明顯缺失，外毛細(xì)胞有部分缺失，以中、底轉(zhuǎn)為最重，這說(shuō)明脈沖噪聲在損傷急性期對(duì)耳蝸的損傷以機(jī)械性損傷為主，而120dB(A)的穩(wěn)態(tài)噪聲對(duì)耳蝸的損傷主要以代謝性損傷為主。

3.2 噪聲刺激對(duì)小型豬內(nèi)耳影響的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

強(qiáng)噪聲刺激后內(nèi)耳產(chǎn)生大量自由基，包括活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）和活性氮簇（reactive nitrogen species,RNS）[10]，由于內(nèi)源性的抗氧化物酶不足以清除掉過(guò)量堆積的自由基，進(jìn)而引起細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化以及DNA、蛋白質(zhì)、線粒體等結(jié)構(gòu)的損傷[11,13]本研究基于iTRAQ技術(shù)對(duì)正常對(duì)照組、噪聲暴露后一天組和七天組小型豬耳蝸篩選出有顯著性差異的蛋白質(zhì)進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要富集在細(xì)胞代謝過(guò)程、生物調(diào)節(jié)、免疫/炎癥過(guò)程、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、防御應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程。發(fā)現(xiàn)線粒體氧化呼吸鏈相關(guān)蛋白琥珀酸脫氫酶輔酶、NADH輔酶、ATP合酶等蛋白質(zhì)在噪聲后發(fā)生差異表達(dá)，KEGG Pathway分析中發(fā)現(xiàn)氧化磷酸化通路發(fā)生下調(diào)。眾所周知，氧化呼吸鏈?zhǔn)羌?xì)胞內(nèi)ROS的最主要來(lái)源，而氧化磷酸化過(guò)程是ROS的重要去路，ROS以及噪聲暴露后耳蝸內(nèi)的缺血缺氧狀態(tài)又易損傷線粒體DNA(mtDNA)導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化功能障礙，如此形成惡性循環(huán)，引起耳蝸內(nèi)活性氧自由基過(guò)量堆積。輔酶Q10可抑制線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化、參與ROS的清除，F(xiàn)etoni等發(fā)現(xiàn)提高輔酶Q10的溶解性可有效抑制線粒體的過(guò)氧化，并減輕NIHL的聽(tīng)力損失[10,16-17]。

噪聲暴露后5min即可觀察到耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞損傷區(qū)域有且僅有凋亡發(fā)生，30min后可見(jiàn)凋亡和壞死同時(shí)存在[18]，說(shuō)明NIHL早期毛細(xì)胞死亡方式主要是凋亡，而后期則壞死和凋亡同時(shí)存在[19]。本研究發(fā)現(xiàn)凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）在噪聲暴露后1天內(nèi)表達(dá)上調(diào)，可能是mtDNA損傷導(dǎo)致AIF自線粒體釋放后進(jìn)入細(xì)胞核，通過(guò)依賴caspase-3通路或非依賴caspase-3通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]，也有報(bào)道表明在壞死和凋亡毛細(xì)胞中都有AIF的轉(zhuǎn)移[19]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)噪聲損傷后耳蝸內(nèi)細(xì)胞色素C表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步說(shuō)明噪聲暴露導(dǎo)致的細(xì)胞缺氧、自由基損傷等破壞了線粒功能，使細(xì)胞色素C、AFI釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，最終造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞。

3.3 噪聲引起小型豬耳蝸炎癥復(fù)合體的激活

既往由于BLB這一解剖結(jié)構(gòu)的存在，使內(nèi)耳長(zhǎng)期被認(rèn)為是一“免疫豁免器官”，但晚近的多項(xiàng)研究證實(shí)內(nèi)耳自身具有很強(qiáng)的免疫能力。有研究對(duì)耳蝸感覺(jué)上皮進(jìn)行高通量RNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)噪聲暴露后大部分表達(dá)變化的基因都與免疫和炎癥反應(yīng)有關(guān)[21-22]，說(shuō)明免疫/炎癥反應(yīng)不僅是NIHL的重要機(jī)制，而且是噪聲刺激損傷耳蝸的主要反應(yīng)。本研究著重篩選分析了噪聲暴露后耳蝸中免疫和炎癥相關(guān)的差異表達(dá)蛋白，發(fā)現(xiàn)噪聲暴露后NF-κB和炎癥復(fù)合體相關(guān)蛋白ASC、caspase-1發(fā)生差異表達(dá)，提示噪聲損傷激活了NLRP3-炎癥復(fù)合體。未激活時(shí)NLRP3在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量很低，一般認(rèn)為，NLRP3-炎癥復(fù)合體的激活需要兩個(gè)信號(hào)：第一信號(hào)通過(guò) ROS、TNF-α、IL-1 等結(jié)合 Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）誘導(dǎo)NF-κB活化使得炎癥小體的關(guān)鍵蛋白NLRP3、pro-IL-18、pro-IL-1β表達(dá)上調(diào)[23-24]，而強(qiáng)噪聲暴露通過(guò)TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活免疫/炎癥反應(yīng)已得到證實(shí)[25-26]，第二信號(hào)刺激NLRP3后借助ASC募集并剪切pro-caspase-1為有活性的caspase-1，促使下游的IL-1β和IL-18成熟并釋放或引發(fā)細(xì)胞焦亡（pyroptosis）[23]。我們推測(cè)噪聲損傷產(chǎn)生的第二信號(hào)包括：胞外ATP刺激誘導(dǎo)鉀離子通道開放、引起胞內(nèi)K+降低、Ca2+內(nèi)流，溶酶體酶釋放以及細(xì)胞內(nèi)ROS升高激活NLRP3，而目前研究認(rèn)為ROS升高應(yīng)該是炎癥復(fù)合體激活的主要原因[23]。促炎因子IL-1β可募集白細(xì)胞損傷神經(jīng)元，并導(dǎo)致NO、TNF-α和IL-6從小膠質(zhì)細(xì)胞中分泌，引起神經(jīng)毒性[27]。因此，NLRP3炎癥復(fù)合體及其下游因子IL-18、IL-1β可進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子如TNF-α和IL-6分泌，TNF-α和IL-6再通過(guò)結(jié)合TLRs激活NF-κB信號(hào)通路引發(fā)細(xì)胞凋亡、壞死，后者又能作為第一信號(hào)激活炎癥復(fù)合體，推測(cè)耳蝸內(nèi)可形成上述循環(huán)，加劇最初的炎癥反應(yīng)。正常情況下，炎癥復(fù)合體作為機(jī)體固有免疫的一部分可防御外界細(xì)菌、病毒感染，維持自身穩(wěn)態(tài)，但當(dāng)其活化失控，產(chǎn)生過(guò)度的炎癥反應(yīng)就會(huì)發(fā)生疾病，如NLRP3基因突變會(huì)導(dǎo)致Muckle-Wells綜合征、家族性地中海熱等。研究發(fā)現(xiàn)有進(jìn)行性感音神經(jīng)性聽(tīng)力障礙的Muckle-Wells綜合征患者，經(jīng)過(guò)IL-1β抑制劑治療后大部分聽(tīng)力都得到改善或穩(wěn)定[28]。

目前認(rèn)為，NLRP3-炎癥復(fù)合體與阿爾茲海默病(Alzheimer's disease，AD）、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、帕金森?。≒arkinson's Disease，PD）等退行性疾病密切相關(guān)[29-30]，發(fā)現(xiàn)外源性的炎癥細(xì)胞因子可以改變血-腦屏障的通透性從而進(jìn)入大腦[31]，也可以由病原相關(guān)分子模式(PAMPs)和損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)刺激直接在大腦中產(chǎn)生，應(yīng)用IL-1阻滯劑后可促進(jìn)神經(jīng)功能的愈合。本研究發(fā)現(xiàn)噪聲暴露后差異表達(dá)蛋白KEGG pathway在AD、PD及亨廷頓病等信號(hào)通路有富集，提示NIHL可能與這些中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病在發(fā)生機(jī)制上有所重疊，氧化應(yīng)激損傷在退行性疾病的作用已較為明確，而炎癥復(fù)合體激活可能是介導(dǎo)這些疾病發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制。老年性聾的耳蝸內(nèi)微血管發(fā)生退行性改變、微循環(huán)紊亂引起內(nèi)耳缺血缺氧，線粒體功能障礙釋放ROS，引起聽(tīng)力損傷[30]，并且已有研究證實(shí)老年性小鼠通過(guò)ROS通路激活耳蝸內(nèi)NLRP3介導(dǎo)的炎癥復(fù)合體[32]，提示NIHL和年齡相關(guān)的退行性疾病也可能是依此途徑激活炎癥復(fù)合體進(jìn)而推動(dòng)疾病的進(jìn)展。