何亞楠 張枝雪 高源 趙海榮 巫秀美 武琦梅 何苗

【摘 要】 目的：觀察蜜蜂蜂毒（Bee venom，BV）對大鼠急性血瘀證的影響。方法：以皮下大劑量注射鹽酸腎上腺素（Adrenalin hydrochloride，A）后再施以冰水游泳復制急性血瘀模型。通過測定血液流變學、凝血四項、纖溶活性等各項指標評價BV對大鼠急性血瘀證的影響。結果：與NS模型組比較，BV中劑量組不同切變率的全血粘度均顯著降低（P<0.05或P<0.01）；BV高、中、低劑量組血漿粘度、紅細胞聚集指數(shù)、卡松粘度均有降低趨勢；BV高、低劑量組PT、APTT有延長趨勢，中、低劑量組TT有延長趨勢；BV中劑量組可顯著降低FIB含量（P<0.01）。結論：BV具有改善大鼠急性血瘀證的作用，其機制與降低血液粘度、FIB含量有關。

【關鍵詞】 BV；急性血瘀證；血液流變學；凝血四項

【中圖分類號】R965 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2018）11-0010-04

Abstract：Objective To observe the effects of BV on acute blood stasis syndrome in rats.Methods The acute blood stasis model was replicated by swimming with ice water after injection of Adrenalin hydrochloride （Adrenalin hydrochloride， A） with high dose of subcutaneous injection. The effect of BV on acute blood stasis syndrome of rats was evaluated by measuring hemorheology， four blood clotting items and fibrinolytic activity. Result That compared with NS model group， BV middle dose group in different shear rate of whole blood viscosity decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）； BV high， medium and low dose group of plasma viscosity， erythrocyte aggregation index and Casson viscosity all decreased； BV high and low dose group PT， APTT had a increasing trend， medium and low dose group， TT had a increasing trend； BV middle dose group could significantly reduce the content of FIB （P<0.01）. Conclusion BV has the effect of improving the syndrome of acute blood stasis in rats， and its mechanism is related to the reduction of blood viscosity and the content of FIB.

Keywords：Bee Venom； Acute Blood Stasis Syndrome； Hemorheology； Four Blood Clotting Items

血瘀證是中醫(yī)臨床常見的證候類型之一，形成的原因主要有外傷、寒邪、郁怒、氣虛、血虛、陰陽虛等[1]。血瘀證是腦缺血的基礎證型，中醫(yī)常用活血化瘀療法治療腦缺血。蜜蜂蜂毒為蜜蜂科昆蟲中華蜜蜂等的工蜂尾部螫刺腺體中排出的毒汁，中醫(yī)藥及民間醫(yī)藥均有很長的使用蜂毒治療疾病的歷史，其具有祛風濕、止痛的功效，用于治療風濕性關節(jié)炎，腰膝酸痛，坐骨神經(jīng)痛等?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，BV具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗輻射、抗血小板聚集等作用。臨床用于治療各種神經(jīng)炎、風濕性關節(jié)炎及心血管等多種疾病。據(jù)報道[2-3]，BV至少有14個生物活性肽，如melittin、apmin、sceapin 、peptide-401等，且均具有較強的藥理作用和生物活性[4-8]，其具活性成分主要有活性酶類、多肽類、糖類、脂類、氨基酸類和胺類物質(zhì)等。其中，melittin可抗血小板聚集、延長小鼠體外凝血時間；apmin則可以通過血腦屏障，直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[9]。中醫(yī)常用活血化瘀法治療腦缺血，而蜂毒體外具有很強的抗凝血作用[10]，本研究旨在通過建立動物血瘀模型，考察其是否具有活血化瘀的作用?；诜涠局饕煞譃槎嚯募懊割惓煞?，口服往往無效而注射給藥存在很大的致敏風險，本試驗依據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)經(jīng)皮給藥途徑，將BV制備成涂膜劑進行考察，以大鼠急性血瘀模型作為觀察對象，以血液流變學、凝血四項、纖溶活性等臨床常用的客觀指標作為評定手段，系統(tǒng)地觀察BV經(jīng)皮給藥對血瘀證的影響，初步探討B(tài)V經(jīng)皮給藥的活血化瘀作用。

1 儀器與材料

1.1 藥物試劑 鹽酸腎上腺素（批號：10150902，上海禾豐制藥有限公司）；氫化可的松（批號：1501271，天津金耀藥業(yè)有限公司）；水合氯醛（批號：20120827，天津市光復精細化工研究所）；硫酸阿托品注射液（批號03141205，上海禾豐制藥有限公司）；薇婷脫毛膏（批號：J20140017，利潔時家化（中國）有限公司）；蜜蜂蜂毒（BV）（批號：20150307，大理大學藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心提供），使用前，依據(jù)工藝制備成涂膜劑給藥。

1.2 儀器 SA-7000型全自動血液流變測試儀（北京賽科希德科技發(fā)展有限公司）；CA-620型全自動凝血分析儀（上海希森美康醫(yī)用電子有限公司）。

1.3 實驗動物 成年健康雄性（Sprague Dawley，SD）大鼠，體重250～300 g，SPF級，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK（湘）2011-0003。25℃室溫喂養(yǎng)，給予大鼠專用標準飼料、純凈水，自由取食飲水。所有實驗研究符合中國倫理委員會有關動物研究指導原則。

2 方法

2.1 急性血瘀模型復制 健康SD雄性大鼠60只，體重250～300 g，隨機分為6組，每組10只。即正常對照組、NS模型組、醒腦靜注射液組（1.68 mL/kg·BW）、BV高、中、低劑量組（6.40、3.20、1.60 mg/kg）。各組動物于給藥前日，用人用脫毛膏于太陽穴兩側局部脫毛。正常對照組正常飼養(yǎng)；NS模型組、醒腦靜注射液組肌肉注射給藥；BV組將涂膜劑均勻涂敷于兩側太陽穴，每側0.03 mL；涂膜劑涂抹后要待水分揮發(fā)后形成薄膜，保持10 min左右后放回籠盒；重復給藥前應用蘸生理鹽水的棉簽輕輕擦去殘留的薄膜，每天給藥1次。預防給藥5 d，末次給藥后1 h，參考文獻[11-12]方法，除正常對照組外，其余各組大鼠皮下注射A 0.8 mL/kg·BW每次，共2次，間隔時間為4 h，第1次皮下注射A 2 h后，將大鼠置于4 ℃冰水中游泳5 min，2 h后第2次皮下注射A，造成急性血瘀證模型。

2.2 血液采集及指標測定 急性血瘀各組動物于第2次皮下注射 A 24 h后取血。以10%水合氯醛0.35 mg/kg·BW腹腔注射麻醉，腹主動脈快速取血6 mL，其中4 mL用肝素抗凝，采用全自動血液流變儀分別測定全血粘度、血漿粘度、紅細胞聚集指數(shù)和卡松粘度。另外2 mL用3.8%枸櫞酸鈉溶液與全血1：9抗凝，采用全自動凝血分析儀測定血漿纖維蛋白原（Plasma fibrinogen，F(xiàn)IB）、纖維蛋白降解產(chǎn)物（Fibrin degradation products，F(xiàn)DP）、血漿D-二聚體（D-dimer，D-D）、活化部分凝血活酶時間（Activated partial thromboplastin time，APTT）、血漿凝血酶原時間（Plasma prothrombin time，PT）、血漿凝血酶時間（Thrombin time，TT）。

2.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計描述和統(tǒng)計分析，以均值加減標準差表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)性且方差齊的，采用參數(shù)檢驗中的單因素方差分析（one-way ANOVA）比較，組間兩兩比較采用LSD（最小顯著差檢驗），數(shù)據(jù)不符合正態(tài)性或方差不齊的采用非參數(shù)檢驗中的Kruskal-Wallis 檢驗分析比較，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 BV對急性血瘀大鼠全血粘度的影響 經(jīng)單因素方差分析，與正常對照組比較，NS模型組不同切變率全血粘度顯著升高（P<0.01）；與NS模型組比較，醒腦靜組可降低切變率為1/s、10/s和60/s的全血粘度（P<0.05）；BV中劑量組不同切變率的全血粘度均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且切變率為1/s、10/s的全血粘度效果顯著優(yōu)于醒腦靜組（P<0.05）。見表1。

3.2 BV對急性血瘀大鼠血漿粘度、紅細胞聚集指數(shù)和卡松粘度的影響 經(jīng)單因素方差分析，與正常對照組比較，NS模型組大鼠血漿粘度、紅細胞聚集指數(shù)、卡松粘度顯著增加（P<0.01）；與NS模型組比較，BV涂膜劑中劑量組血漿粘度、紅細胞聚集指數(shù)、卡松粘度均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且血漿粘度、紅細胞聚集指數(shù)效果顯著優(yōu)于醒腦靜組（P<0.01或P<0.05）。見表2。

3.3 BV對急性血瘀大鼠PT、APTT和TT的影響 經(jīng)Kruskal-Wallis 檢驗，與正常對照組比較，NS模型組僅TT存在統(tǒng)計學差異（P<0.05）；與NS模型組比較，所有給藥組PT、APTT及TT均無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。提示BV經(jīng)皮給藥對急性血瘀大鼠凝血時間的影響并不明顯。見表3。

3.4 BV對急性血瘀大鼠FIB、FDP和D-二聚體的影響 經(jīng)單因素方差分析，與正常對照組比較，NS模型組大鼠血漿FIB、FDP、D-二聚體含量顯著增加（P<0.01）；與NS模型組比較，BV中劑量組可顯著降低FIB含量（P<0.01），且效果顯著優(yōu)于醒腦靜組（P<0.01），BV涂膜劑高、低劑量組有降低FDP和D-二聚體含量的趨勢。見表4。

4 討論

除傳統(tǒng)的活血化瘀中藥外，近現(xiàn)代藥理研究的許多動物藥針對心腦血管疾病均有顯著的治療作用，如水蛭[13]、蚯蚓[14]、蛛毒[15]、蛇毒[16]及昆蟲毒素[17-20]等。在部分藥用植物資源不足的情況下，這些動物資源可能是以后心腦血管疾病新藥研發(fā)的重點來源。

實驗借助“郁怒”和“寒邪”兩個病因，通過注射大劑量A模擬人暴怒時的機體狀態(tài)，施以冰水游泳，模擬“寒邪”入侵，二者共同作用來復制大鼠急性血瘀證。實驗過程中由于麻醉、低溫、游泳疲勞，部分大鼠狀態(tài)較差，有死亡。結果顯示，除了凝血系統(tǒng)相關的PT和APTT兩個指標基本無差異外，NS模型組的血液流變學、纖溶活性等相關指標均與正常對照組存在統(tǒng)計學差異，提示皮下注射鹽酸腎上腺素伴以4℃冰水游泳可以有效復制大鼠血急性瘀證模型。陽性藥醒腦靜注射液可降低部分血粘度，與文獻報道一致[21]。與模型組比較，BV可降低血瘀大鼠全血粘度、血漿粘度及卡松粘度，提示BV能有效改善急性血瘀大鼠的血流變性；與模型組比較，BV中劑量組可顯著降低FIB含量（P<0.01），其他兩個劑量組亦有降低趨勢，提示BV能有效緩解急性血瘀模型大鼠的血液高凝狀況。結果表明，BV能顯著降低急性血瘀模型大鼠的全血粘度、血漿粘度、卡松粘度，有效改善血瘀狀況，但對內(nèi)源性（APTT）及外源性（PT）的凝血途徑均無明顯影響。其可能通過血瘀狀態(tài)下，有效抑制凝血因子FIB的生成而發(fā)揮作用。此外，BV能改善模型大鼠的血液流變性，但沒有明顯劑量依賴關系，推測原因可能與BV涂膜劑為多組分混合物及透皮吸收相關，筆者將在后續(xù)實驗中進一步深入研究。

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