吳翟 王彩榮 張靈敏 楊建新 周恒 王麗

【摘 要】 目的：通過觀察金蛭方對缺血性中風大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)區(qū)細胞調(diào)亡相關(guān)因子Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白含量的影響，探討金蛭方治療缺血性中風的作用機制。方法：采用線栓法復(fù)制缺血性中風大鼠模型，隨機分為假手術(shù)組、模型對照組、金蛭方高劑量組、金蛭方低劑量組、陽性藥尼莫地平片對照組。應(yīng)用western-blot技術(shù)檢測caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白含量變化。結(jié)果：模型組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Bcl-2蛋白表達較假手術(shù)組明顯降低（P<0.01）；caspase-3、Bax蛋白表達較假手術(shù)組明顯升高（P<0.01）。用藥后各治療組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Bcl-2蛋白表達明顯升高（P<0.05，P<0.01）；caspase-3、Bax蛋白表達明顯降低（P<0.05，P<0.01）。高、低劑量組在增強Bcl-2蛋白表達和降低caspase-3、Bax蛋白表達方面的作用優(yōu)于對照組。結(jié)論：金蛭方通過調(diào)節(jié)缺血性中風大鼠caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達達到拮抗缺血性中風作用。

【關(guān)鍵詞】 金蛭方；缺血性中風；caspase-3、Bax、Bcl-2

【中圖分類號】R965 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2018）11-0006-04

Abstract：Objective To observe the effect of Jinzhifang on the content of Bax， bcl-2， caspase-3 protein in cerebral cortex region of ischemic stroke rats， and to investigate the mechanism of the treatment of ischemic stroke with Jinzhifang. Methods Using the suture method to copy the rat model of ischemic stroke were randomly divided into sham operation group， model control group， the Jinzhi fang decoction high dose group， the Jinzhi fang low dose group， positive drug nimodipine tablets in the Jinzhi fang. The content changes of caspase-3， Bax and bcl-2 were detected by using western-blot technique. Results The expression of Bcl-2 protein in ischemic cortex in model group was significantly lower than that in sham group（P<0.01）. The expression of caspase-3 and Bax protein was significantly higher than that of sham operation group （P<0.01）. The expression of Bcl-2 protein in the ischemic cortex of rats increased obviously after the treatment（P<0.05，P<0.01）.The expression of caspase-3 and Bax protein decreased obviously（P<0.05，P<0.01）.The effect of Bcl-2 protein expression and decrease of caspase-3 and Bax protein in high and low dose group was better than that in control group。Conclusion The Jinzhi fang through regulation of ischemic stroke rat Expression of casase-3， Bax， Bcl-2 proteins and release in order to achieve the antagonistic effect of ischemic apoplexy.

Keywords：Jinzhifang； Ischemic Stroke； Caspase-3、Bax、Bcl-2

缺血性中風所致腦損傷的病理機制尚不完全清楚，目前有多種研究，其中細胞調(diào)亡在缺血半暗帶損傷級聯(lián)反應(yīng)過程中起著十分重要的作用[1]，因此關(guān)于神經(jīng)細胞調(diào)亡機制的探索及基于抗調(diào)亡為靶點的治療藥物探究是缺血性中風的研究熱點。金蛭方系課題組經(jīng)過多年篩選出的治療缺血性中風的效方，臨床應(yīng)用10余年，療效明顯，但其作用機制不十分明確，本研究以期從細胞凋亡角度探討金蛭方對缺血性中風的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性SD大鼠60只，清潔級，體重250～300 g，由河北省實驗動物中心提供，合格證號：1119069。

1.2 藥物與試劑 金蛭方組成：水蛭、郁金、川芎、冰片（由遷安市中醫(yī)醫(yī)院制劑室制備），上4味除冰片外水提濃縮成高、低劑量后加入相應(yīng)研磨冰片，所含生藥分別為：0.30 g/mL（高劑量）、0.15 g/mL（低劑量）。尼莫地平片（鄭州瑞康制藥有限公司提供，國藥準字：H41022175，規(guī)格：20 mg/片）。按體重0.00 1g/mL配制成水溶液。

Caspase-3（ab13585），Bcl-2抗體（ab692），Bax抗體（ab77566），Actin 抗體（ab5694），bolt 封閉液（ab184868）均由艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司提供。

1.3 主要儀器 DYCZ-24DN型雙垂直電泳槽（濟南德高實驗室設(shè)備有限公司），DYCZ-40D型轉(zhuǎn)移槽（濟南德高實驗室設(shè)備有限公司），LT-X型實驗室溫控搖床（Adolf Kuhner公司），WH-300-LCD型電泳儀（上海雙琪生物科技有限公司），AR0136-04型PVDF膜（博士德生物工程公司）。

1.4 造模方法 參考改良的Longa法[2]：頸部正中切口，用3-0手術(shù)絲線結(jié)扎頸外動脈（ECA）遠端及枕動脈，在結(jié)扎線距分叉部2 mm處剪斷ECA，將一端已加工成光滑球形的尼龍線從ECA殘端插入進行結(jié)扎，將尼龍線經(jīng)頸總動脈（CCA）分叉部插入頸內(nèi)動脈（ICA），此時松開CCA，ICA套線恢復(fù)血流，線栓推送順滑，無出血。將線栓向上深入至分叉以上18～19 mm達到大腦中動脈開口處，將頸總動脈連同尼龍線一起結(jié)扎，縫合切口后外留尼龍線0.5 cm，放到單籠中，2 h后外拉尼龍線使其球端回至ECA進行缺血后再灌注。參照Longa評定法，進行神經(jīng)功能缺損程度的評價，分為5個等級4分：0分，無明顯可見的缺損改變；1分，對側(cè)前肢可見屈曲、內(nèi)收；2分，向偏擁側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向偏雜側(cè)傾倒；4分，不能自主行走，意識不清；1～3分造模成功，0分與4分均為不合格模型，需要剔除。造模成功率100%。

1.5 實驗分組與給藥[3] 60只大鼠自由進食飲水，飼養(yǎng)于18～22 ℃明暗各12 h的清潔級動物實驗室內(nèi)，喂養(yǎng)1周后，隨機分為5組。①假手術(shù)組：手術(shù)時僅作頸部手術(shù)切口，鈍性分離頸前肌，游離暴露頸總、頸外、頸內(nèi)動脈，術(shù)后當日灌服蒸餾水；②模型對照組（簡稱模型組）：造模當日灌服蒸餾水；③金蛭方低劑量組（簡稱低劑量組）：造模當日灌服金蛭方，每日用藥劑量為1.5 g/kg（相當于成人劑量的10倍）；④金蛭方高劑量組（簡稱高劑量組）：術(shù)后當日灌服金蛭方，每日用藥劑量為3.0 g/kg （相當于成人劑量的20倍）；⑤陽性藥尼莫地平片對照組（簡稱對照組）：術(shù)后當日灌服尼莫地平片，每日用藥劑量為0.01g/kg （相當于成人劑量的20倍）。各組1次/d灌胃，每次用藥體積均按1 mL/100g計算，連續(xù)給藥2周。因給藥操作不當，模型組低劑量組各死亡1只大鼠，高劑量組死亡2只大鼠。

1.6 檢測方法 實驗2周末，于最后1次給藥禁食12 h后，戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉，迅速斷頭冰浴中取右腦皮質(zhì)與白質(zhì)部分，濾紙吸干血跡，將大鼠皮質(zhì)部分放入凍存管，存入液氮中備用。

1.7 western-blot檢測蛋白含量

1.7.1 溶液配制 ①1.5M Tris-HC1（PH8.8）：準確稱量Tris堿18.15g，去離子水80 mL，用濃鹽酸調(diào)PH值至8.8，定容至，100 mL。②1.0M Tris-HC1（PH6.8）；準確稱量12.1g，去離子水80 mL，用濃鹽酸調(diào)PH值至6.8，定容至，100 mL。③10%過硫酸胺：準確稱量過硫酸胺0.1g溶于1 mL去離子水中，現(xiàn)用現(xiàn)配。④10%SDS：180 mL水中溶解20g電泳級SDS，加熱至68 ℃水浴助溶，用濃鹽酸調(diào)至PH值至7.2，加水定容至200 mL。⑤Tris甘氨酸電泳緩沖液（5×）：準確稱量堿15.1 g，甘氨酸94 g，SDS5 g，適量去離子水溶解，定容至1000 mL。⑥電轉(zhuǎn)移緩沖液：準確稱量甘氨酸2.9g， Tris堿5.8 g，SDS0.37 g，甲醇200 mL，加去離子水定容至1000 mL。⑦TBS-T（0.05%）：準確稱量Tris堿2.42 g，NaCl8 g，適量去離子水溶解，鹽酸調(diào)PH值至7.6，Tween-20 0.5 mL，加水定容至1000 mL。

1.7.2 祥本蛋白提取 依照電泳上樣量需要，用水及5×loading buffer調(diào)整蛋白濃度，100 ℃煮沸變性5 min。

1.7.3 丙烯酰胺凝膠電泳 ①根據(jù)目的蛋白的分子量，配制15%的分離膠，5%濃縮膠。②待檢測蛋白樣品上樣量：上樣50 μg。③電泳條件；濃縮膠恒壓80 v，約20 min；分離膠恒壓120 v，電泳至溴酚藍到凝膠底部。

1.7.4 濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜 ①轉(zhuǎn)膜方法；準備一張大小合適的PVDF膜，浸泡于甲酵中30sec，再轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)液中，備兩張與膜大小一樣的厚濾紙浸泡于電轉(zhuǎn)液中備用；切除多余凝膠部分，按照濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙的順序放入海綿墊夾層中，起盡氣泡。②轉(zhuǎn)膜條件：按照電流300 mA恒流轉(zhuǎn)膜；0.22 um孔徑PVDF膜，轉(zhuǎn)膜時間40 min

1.7.5 WB檢測目的蛋白 ①封閉；轉(zhuǎn)移結(jié)束后將PVDF膜浸泡于Western blot封閉液中，搖床中輕搖1 h。②一抗稀釋：用1%BSA/5%milk化稀釋一抗。③一抗孵育：封閉結(jié)束后，將PVDF膜置于雜交袋中，加入2中配制好的一抗，用封膜機封口，4 ℃解育過夜。④洗膜；TBST洗膜3次，每次6 min。⑤二抗孵育：用Western blot封閉液稀釋二抗，羊抗兔-HRP、羊抗小鼠-HRP1：5000稀釋，室溫輕搖50 min。⑥洗膜：TBST洗膜3次，每次5 min。⑦ECL反應(yīng)、膠片曝光：將PVDF膜浸泡于ECL顯色液中1 min，暗室中曝光、顯影并定影。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 全部數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料用均數(shù)加減標準差（x[TX-*3]±s）表示，多組間比較用方差齊性檢驗，單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

模型組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Bcl-2蛋白表達較假手術(shù)組明顯降低（P<0.01）；caspase-3、Bax蛋白表達較假手術(shù)組明顯升高（P<0.01）。用藥后各治療組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Bcl-2蛋白表達明顯升高（P<0.05，P<0.01）；caspase-3、Bax蛋白表達明顯降低（P<0.05，P<0.01）。高、低劑量組在增強Bcl-2蛋白表達和降低caspase-3、Bax蛋白表達方面的作用優(yōu)于對照組（P<0.05）。詳見圖1，表1。

3 討論

課題組通過對中風病臨床癥候?qū)W研究認為缺血性中風患者多是在氣血內(nèi)虛的基礎(chǔ)上，加之勞倦內(nèi)傷、憂思惱怒、嗜食厚味、煙酒等誘因，導(dǎo)致氣血逆亂，直沖犯腦，致氣血瘀滯，腦脈痹阻。氣滯、血瘀、絡(luò)阻為本病的主要病機，“氣行則血行”，行氣、活血、通絡(luò)為其有效治則，筆者根據(jù)金蛭方，研制院內(nèi)制劑“金蛭膠囊”（制劑號：冀藥制字Z20051013）治療缺血性中風10余年，療效滿意。方中水蛭破血逐瘀、通經(jīng)活絡(luò)，《本草匯言》曰：“水蛭逐惡血、散瘀血之要藥也”；郁金行氣活血，化痰降火，《本草匯言》曰：郁金其性清揚，能散郁滯，順逆氣，上達高巔，善行下焦；川芎行氣活血，歷代醫(yī)家認為其：“善治中風，治風圣藥”[4]；冰片醒神通竅，《本草衍義》曰：“芳香走竄，引藥上行，獨行則勢弱，佐使則有功”，四藥合用，共奏活血、化瘀、通絡(luò)之功。

程序性死亡是保持細胞生存和死亡間平衡的關(guān)鍵因素。而凋亡作為程序性死亡的最主要類型，一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點[5]。在缺血性腦損傷中，與壞死的細胞相比，凋亡細胞僅占死亡細胞總數(shù)的小部分[6]，而就缺血半暗帶而言，凋亡細胞死亡卻是最主要的死亡方式[7]。Caspase-3是Caspase家族成員之一，它在細胞調(diào)亡執(zhí)行階段中起著核心作用，活化的Caspase-3導(dǎo)致神經(jīng)元細胞DNA斷裂，抑制細胞増殖，并且破壞細胞之間的平衡狀態(tài)[8]。Caspase-3表達上調(diào)的細胞調(diào)亡是缺血性和出血性腦損傷的重要標志[9]。Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡過程中的調(diào)控基因，Bcl-2蛋白具有抑制細胞調(diào)亡的功能，Bax蛋白則具有促進細胞調(diào)亡的功能[10]。Bcl-2通過介導(dǎo)線粒體外膜通透轉(zhuǎn)運孔道復(fù)合體的開放，抑制和調(diào)亡誘導(dǎo)因子AIF等促調(diào)亡蛋白的釋放阻止調(diào)亡的進程。Bax只有收到調(diào)亡信號刺激被激活后，發(fā)生分子構(gòu)造改變，移位并插入線粒體外膜后形成Bax大孔道，破壞線粒體膜的完整性，并與Bcl-2等抑制調(diào)亡的蛋白對抗，阻止其抗調(diào)亡作用的發(fā)揮。因此，檢測caspase-3和Bcl-2、Bax缺血性卒中后的表達情況，即可說明細胞調(diào)亡的狀況。

本研究表明，缺血性中風大鼠模型缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)caspase-3、Bax蛋白表達明顯升高，Bcl-2蛋白表達明顯降低。經(jīng)藥物干預(yù)后，各治療組可降低大鼠模型缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)caspase-3、Bax蛋白表達，升高Bcl-2蛋白表達表達，表明金蛭方通過調(diào)節(jié)caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達，以達到減輕腦缺血細胞凋亡、改善神經(jīng)功能、預(yù)防和治療缺血性中風的作用，但其深入的作用機制有待進一步的探討。

參考文獻

[1]張明慧.地黃飲子加減方對腦缺血再灌注模型大鼠細胞稠亡機制的影響[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2017，20.

[2]Zea- Longa EL，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible Middle Cerebral Artery Occlusion without Craniectomy in Rats[J].Stroke，1989，20（l）：84-91.

[3]AsmarR，MakonnaO，BrisacAM，et al. Comparison between the effects of angiotensin-converting-enzyme inhibitors and angiotens inⅡantagonists [J].Therapie，1998，53（3）：253-270.

[4]陳可冀.瘀血證與活血化瘀源流概述[J].中醫(yī)雜志，1979（9）：51-57.

[5]Suzanne M，Steller H.Shaping organisms with apoptosis[J]. Cell Death Differ， 2013（20）： 669-675.

[6]Love S，Barber R，and Wilcock GK.Neuronal death in brain infarcts in man[J].Neuropathol Appl Neurobiol，2000（26）：55-66.

[7]Sairanen T， Karjalainen-Lindsberg ML， Paetau A， et al. Apoptosis dominant in the periinfarct area of human ischaemic stroke--a possible target of antiapoptotic treatments[J].Brain，2006，129：189-199.

[8]Baek SS，Jun TW，Kim KJ，et al.Effects of postnatal treadmill esercise on apoptotic neuronal cell death and cell proliferation of matemal-sparatedratpups[J].Brain Dev，2012，34（1）：45-56.

[9]Simard JM，Geng Z，Woo SK lvanova S，et al.Glibenclamide reduces inflammation，vasogenic edema，and caspase-3 actination after subarachnoid hemorrhage[J]Cereb Blood Flow Metab，2009，29（2）：317-330.

[10]Bosoi CR，Yang X，Huynh J，et al.Systemic oxidative Stress is implicated in the pathogenesis of brain edema in rats with chronic liver failure[J].Free Radic Biol Med，2012，52（7）：1228-1235.