潘瑞 杜業(yè)亮 牟偉男

[摘要] 目的 探討蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）并發(fā)腦心綜合征（CCS）大鼠腎素-血管緊張素的變化。 方法 枕大池注入自體動脈血法復制SAH模型，健康雄性Wistar大鼠75只，6周齡，體重150～200 g，所有大鼠均與動力實驗室系統(tǒng)連接（Power Lab系統(tǒng)）檢測心電圖，排除異常心電圖者。將動物隨機分為手術組（50只）、假手術組（25只）。手術組根據(jù)術后心電圖不同分為SAH組、CCS組，每組各25只（不足者同條件新鼠補入），各組大鼠按取材時段不同隨機分為1、3、5、7、14 d等5個亞組，每組5只。造模后用Power Lab系統(tǒng)檢測心電圖，分別于1、3、5、7、14 d再次檢測心電圖，用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測血漿中腎素活性（PRA）及血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）的含量。 結果 造模成功后，假手術組心電圖未見明顯變化，手術組術后2 h CCS病發(fā)率最高。1 d時SAH組、CCS組PRA、AngⅡ含量均高于假手術組（P < 0.05），且CCS組高于SAH組（P < 0.05）；SAH組和CCS組PRA、AngⅡ在3 d時達到高峰，顯著高于假手術組（P < 0.05），而CCS組高于SAH組（P < 0.05）；5、7 d時SAH組、CCS組PRA、AngⅡ含量逐漸下降，仍高于假手術組（P < 0.05）。假手術組PRA、AngⅡ含量隨時間延長逐漸下降至7 d后趨于穩(wěn)定；SAH組及CCS組PRA、AngⅡ含量3 d達高峰，后逐漸下降至14 d基本趨于假手術組水平（P > 0.05）。 結論 SAH并發(fā)CCS的PRA、AngⅡ呈逐漸上升達高峰后逐漸下降趨于穩(wěn)定的變化，提示PRA、AngⅡ在SAH并發(fā)CCS的發(fā)生與發(fā)展中起到了一定的作用。

[關鍵詞] 腦心綜合征；蛛網(wǎng)膜下腔出血；腎素活性；血管緊張素Ⅱ

[中圖分類號] R743.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）08（c）-0018-04

[Abstract] Objective To investigate the changes of renin-angiotensin in rats with subarachnoid hemorrhage （SAH） complicated by cerebral-cardiac syndrome （CCS）. Methods The occipital large pool was injected with autologous arterial blood to replicate the SAH model. Seventy-five healthy male Wistar rats were 6 weeks old and weighed 150-200 g. All rats were connected to a dynamic laboratory system （Power Lab system） to detect ECG， excluding abnormal ECG. The rats were randomly divided into surgery group （50 rats） and sham group （25 rats）. The surgical group was divided into SAH group and CCS group according to different electrocardiograms after surgery. Each group had 25 animals （insufficient ones were recruited in the same condition as new rat）. Different time periods were randomly divided into five subgroups： 1， 3， 5， 7， 14 d group， with 5 rats in each group. Electrocardiograms were measured with the Power Lab system after modeling， and electrocardiograms were again detected on day 1， 3， 5， 7 and 14. The levels of plasma renin activity （PRA） and angiotensin Ⅱ （AngⅡ） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Results After successful modeling， there was no significant change in electrocardiogram in the sham-operated group. The incidence of cerebral-cardiac syndrome was highest in the surgical group at 2 hours after surgery. The levels of PRA and AngⅡ in SAH group and CCS group were higher than those in sham-operated group at day 1 （P < 0.05）， and the CCS group was higher than the SAH group （P < 0.05）； PRA and AngⅡ peaked at 3 days in SAH group and CCS group were significantly higher than that in sham operation group （P < 0.05）， and CCS group was higher than the SAH group （P < 0.05）. The contents of PRA and AngⅡ in SAH group and CCS group decreased gradually after 5 and 7 days， which was still higher than that in sham operation group （P < 0.05）. The contents of PRA and AngⅡ gradually decreased to 7 days and then stabilized in the sham operation group. The levels of PRA and AngⅡ in the SAH group and the CCS group reached the peak at 3 days， and then gradually decreased to 14 days afterwards， and the levels of PRA and AngⅡ basically reached the level of the sham operation group （P > 0.05）. Conclusion PRA and AngⅡ in SAH complicated with CCS gradually increase and reach a peak， then gradually decrease and tend to be stable. This suggests that PRA and AngⅡ play a certain role in the occurrence and development of SAH concurrent with CCS.

[Key words] Cerebral-cardiac syndrome； Subarachnoid hemorrhage； Plasma renin activity； Angiotensin Ⅱ

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是一種發(fā)病率高的致死性疾病[1]，是一種較為常見和嚴重的腦出血性疾病，人群每年的發(fā)病率為6/10萬～10/10萬，占腦卒中的3%～5%[2]，主要指由多種因素所致腦表面或底部血管破裂，血液進入蛛網(wǎng)膜下腔，從而并發(fā)的以劇烈頭痛、肢體癱瘓、甚至昏迷為主要臨床表現(xiàn)的一種綜合征[3]。腦心綜合征（cerebral-cardiac syndrome，CCS）又稱為腦源性心臟損害，指各種腦部病變所致的繼發(fā)性心臟損害，主要表現(xiàn)為心電圖復極改變、心律失常、血漿心肌酶活性升高、心力衰竭等，嚴重者可發(fā)生猝死[4]。目前，CCS的發(fā)病機制尚不明確，本研究通過大鼠枕大池注入自體動脈血法建立SAH致CCS模型，檢測大鼠血漿中腎素活性（PRA）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）的動態(tài)變化，為進一步探討SAH并發(fā)CCS的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠75只，6周齡，體重150～200 g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司供應（許可證號：SCXK[魯]20140007）。

1.1.2 實驗儀器 大鼠腦立體定位儀（上海醫(yī)療儀器廠），1 mL注射器。

1.1.3 實驗試劑 大鼠PRA酶聯(lián)免疫分析試劑盒（96T，批號E-30960）、大鼠AngⅡ酶聯(lián)免疫分析試劑盒（96T，批號E-31022）（上海一研生物科技有限公司）。

1.2 實驗分組

所有大鼠均與動力實驗室系統(tǒng)連接（Power Lab系統(tǒng)）檢測心電圖，排除異常心電圖者，將其隨機分為手術組（50只）、假手術組（25只）。手術組根據(jù)術后心電圖不同分為SAH組、CCS組，每組各25只（不足者同條件新鼠補入），各組大鼠按取材時段不同隨機分為1、3、5、7、14 d等5個亞組，每組5只。

1.3 模型制備

采用自體股動脈血枕大池單次注血法復制SAH模型。手術組大鼠：常規(guī)消毒手術器械；按體重0.35 mL/100 g用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉；連接Power Lab系統(tǒng)測心電圖正常后，備皮、固定、消毒，切開皮膚，分離出股動脈供放血用。后俯臥于立體定向儀上，備皮、消毒，以寰枕交界部為中心，縱向切開暴露枕骨下緣、寰椎和寰枕膜。1 mL注射器針頭刺破寰枕膜中點，連接注射器，進入小腦延髓池，回抽見有腦脊液后固定針頭，20 s內注入0.2 mL自體股動脈血，膠海綿修補，大鼠急性顱內壓維持，切口縫合，頭部維持30 min。術后動態(tài)檢測Ⅱ導聯(lián)心電圖6 h，選擇心電圖異常（ST段壓低、T波改變、出現(xiàn)U波、心律失常等）大鼠入CCS組，正常心電圖者入SAH組，假手術組未分離股動脈，注入等量生理鹽水，給予各組大鼠充足食物及水喂養(yǎng)，于48 h后再次重復注血。于造模結束后各組取1只大鼠麻醉后灌注處死，獲取腦部標本，其中造模成功的標準為見到枕骨大池、基底池、小腦、大腦、腦干以及大腦表面有血塊存在。每組造模后，1、3、5、7、14 d組檢測Ⅱ導聯(lián)心電圖2 h，取每組血漿待測。

1.4 樣品采集及處理

將大鼠麻醉固定后，穿刺抽取大鼠右心室血2 mL，于低溫離心機4℃、3000 r/min、半徑10 cm條件下離心20 min，如出現(xiàn)沉淀再次離心，后放置于-80℃冰箱保存待測。準備試劑，加入準備好的樣品和標準品，37℃反應30 min，洗板5次，加入酶標試劑，37℃反應30 min，洗板5次，加入顯色液A、B，37℃顯色10 min，加入終止液，15 min之內讀OD值，計算出樣品濃度。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)均選用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計分析，所有計量資料均采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗；相關性采用Pearson直線相關分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠心電圖比較

造模成功后持續(xù)檢測心電圖6 h，1、3、5、7、14 d假手術組心電圖未見明顯變化；手術組術后已建立的SAH模型中2 h出現(xiàn)心電圖異常發(fā)病率最高，CCS組25只心電圖異常大鼠（其中心律失常12只、ST-T段壓低7只、T波改變4只、出現(xiàn)U波2只）。

2.2 三組大鼠血漿腎素活性含量比較

造模成功后，用LSD-t檢驗對1、3、5、7 d時刻血漿中的PRA情況進行后續(xù)的多重比較，結果如下：1 d時SAH組、CCS組PRA含量均高于假手術組（P < 0.05），且CCS組高于SAH組（P < 0.05）；3 d時SAH組、CCS組PRA含量達高峰，均顯著高于假手術組（P < 0.05），且CCS組高于SAH組（P < 0.05）；5、7 d時SAH組、CCS組PRA含量逐漸下降，仍高于假手術組（P < 0.05）。隨時間延長假手術組PRA含量逐漸下降，7 d后趨于穩(wěn)定，SAH組及CCS組PRA含量3 d達高峰，然后逐漸下降，14 d后基本趨于假手術組水平（P > 0.05）。見表1。

2.3 三組大鼠血漿血管緊張素Ⅱ含量比較

造模成功后，用LSD-t檢驗對1、3、5、7 d時刻血漿中的AngⅡ情況進行后續(xù)的多重比較，結果如下：1 d時SAH組、CCS組AngⅡ含量均高于假手術組（P < 0.05），且CCS組高于SAH組（P < 0.05）；3 d時SAH組、CCS組AngⅡ含量達高峰，均顯著高于假手術組（P < 0.05），且CCS組高于SAH組（P < 0.05）；5、7 d時SAH組、CCS組AngⅡ含量逐漸下降，仍高于假手術組（P < 0.05）；假手術組AngⅡ含量隨時間延長逐漸下降，至7 d后趨于穩(wěn)定；SAH組及CCS組AngⅡ含量3 d達高峰，后逐漸下降至14 d基本趨于假手術組水平（P > 0.05）。見表2。

2.4 三組大鼠血漿PRA與AngⅡ含量的相關分析

Pearson線性相關分析結果顯示，血漿PRA含量與AngⅡ含量呈正相關（r = 0.854，P < 0.01）。

3 討論

急性腦血管病引起CCS的發(fā)病率為62%～90%[5]，其核心特點是心臟運動異常的區(qū)域與冠狀動脈供血區(qū)域不一致[6-10]，其病理生理及分子機制尚未闡明。目前，大多數(shù)研究表明，CCS與植物神經功能的異常改變和腦部病變引起的體液改變相關。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）或腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）在維持機體內水、電解質及血壓平衡過程中具有重要作用，并具有調節(jié)大腦生理和病理性的作用[11]，其中血管緊張素轉化酶可促進腎素轉化為AngⅡ后進一步與其受體結合[12]，有研究指出，其與腦血管事件發(fā)生、發(fā)展關系密切[13]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)腦內存在單獨的RAS，與循環(huán)系統(tǒng)的RAS協(xié)同參與腦組織結構與功能的調節(jié)[14]。AngⅡ是RAS系統(tǒng)的主要效應物質，它也被稱為最強的內源性縮血管因子，能直接促進醛固酮的分泌，進一步促進腎小管上皮細胞對水的通透性，增加水的重吸收，加重腦水腫。已有研究表明[15]，在大鼠顱腦損傷模型中AngⅡ水平顯著升高。

SAH至顱內壓升高，機體產生應激反應[16]，血漿中AngⅡ含量升高，引起冠狀動脈收縮，增加心肌灌注阻力，減少心肌血液供應，誘發(fā)急性心肌缺血性損傷[17-19]，經磷酸肌醇激酶和AngⅡ受體調節(jié)細胞內鈣濃度和交感神經相互作用，導致心肌過度收縮，引起心肌缺血和缺氧，高濃度的AngⅡ可提升醛固酮、精氨酸加壓素等，增加心臟前負荷，而心律失常為最常見的癥狀，不同類型心律失常發(fā)生率不同，最常見的是QT間期延長[20-22]，這可能與CCS的發(fā)生及發(fā)展有一定的關聯(lián)。

本研究觀察了SAH后持續(xù)6 h心律失常的發(fā)生情況，以及14 d中血漿PRA、AngⅡ含量的變化。結果顯示，PRA、AngⅡ含量在SAH及SAH并發(fā)CCS組中均明顯升高，且3 d達最高，后含量逐漸下降并趨于穩(wěn)定。相比單純SAH組，SAH并發(fā)CCS組血漿及心肌局部組織中PRA、AngⅡ含量升高幅度更加明顯，隨著CCS組出現(xiàn)心律失常及其逐漸恢復，血漿中的PRA、AngⅡ含量亦達高峰后迅速下降，說明RAS系統(tǒng)在CCS的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。實驗中發(fā)現(xiàn)CCS在SAH 2 h發(fā)生率最高，這與文獻中AngⅡ增高直接或間接刺激交感神經而增強對冠脈和心肌的收縮作用，使心臟做功加強但心肌供血卻相對不足，心肌氧耗量增加而氧供減少，以致能量耗竭，呼吸鏈功能紊亂[23]，從而加重心肌損傷一致。另有報道稱AngⅡ還通過激活交感神經系統(tǒng)使去甲腎上腺素釋放增多，進一步加重心臟的負荷；收縮冠脈使冠脈循環(huán)障礙，內皮細胞收損，內皮依賴性舒張減弱，促使自由基產生。

綜上所述，SAH早期RAS系統(tǒng)被激活，血漿中PRA、AngⅡ含量迅速上升，經過急性期后，心律失常逐漸恢復，血漿中PRA、AngⅡ含量亦逐漸下降趨于正常，提示PRA、AngⅡ在SAH并發(fā)CCS的發(fā)生與發(fā)展中起到了一定的作用。由于實驗組試驗次數(shù)較少，所有CCS病例均無心肌梗死及其他嚴重心肌組織損傷，在未來的實驗中需要進一步擴大樣本量深入研究。

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（收稿日期：2018-03-27 本文編輯：張瑜杰）