（深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院，消化內(nèi)科，廣東 深圳 518101）

胃癌是一種常見的惡性腫瘤且發(fā)病率非常高。近些年，我國(guó)每年新發(fā)胃癌人數(shù)達(dá)40萬左右，發(fā)病率占全世界41%左右[1]，同時(shí)具有年輕化的趨勢(shì)。胃癌細(xì)胞的侵襲過程中有多種信號(hào)通路參與，如NF-κB、Wnt和Hippo信號(hào)通路[2-3]。隨著Hippo-YAP信號(hào)通路與胃癌發(fā)生發(fā)展之間研究增加，發(fā)現(xiàn)Hippo-YAP通路能夠調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡，在腫瘤細(xì)胞侵襲進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用[4-6]，可能成為靶向治療的新靶點(diǎn)[7]。研究發(fā)現(xiàn)[8-10]，YAP蛋白在胃癌、大腸癌和肺癌等腫瘤中高表達(dá)，YAP蛋白是Hippo通路主要下游效應(yīng)蛋白。CUL4是一類泛素連接酶，屬于Cullin基因家族[11]，在食管癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤中表達(dá)升高，在腫瘤細(xì)胞形成過程中通過不同的分子調(diào)控機(jī)制發(fā)揮著重要作用[12]。但對(duì)于CUL4在調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的侵襲過程中的作用報(bào)道較少。FAT4被稱為Fat-J，在2004年被首次報(bào)道[13]。吳建林等[14]研究發(fā)現(xiàn)FAT4可能是胃癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的抑癌基因，但FAT4胃癌細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展中的具體機(jī)制研究較少。本研究針對(duì)性地研究FAT4及CUL4在調(diào)控Hippo通路對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲過程中的作用和機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并經(jīng)過患者的知情同意之后選取就診于本院并住院行胃癌切除術(shù)的160例胃癌患者標(biāo)本。其中，男性84例，女性76例；年齡（58±3）歲。所有入組患者臨床病理資料完整，同時(shí)收集50例經(jīng)2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師確定的正常胃黏膜組織標(biāo)本作為對(duì)照。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 在本院行胃癌手術(shù)的患者；術(shù)后病理診斷明確為胃腺癌。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 術(shù)后病理學(xué)診斷含有鱗癌、間質(zhì)瘤等成分；術(shù)前接受過新輔助治療；標(biāo)本留取不符合標(biāo)準(zhǔn)；標(biāo)本儲(chǔ)存過程中有過凍融。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

包埋機(jī)（美國(guó)Thermo公司），自動(dòng)切片機(jī)（LEICA，型號(hào)RM2135），顯微鏡（日本Olympus CX21），載玻片（江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司），恒溫水浴箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），全自動(dòng)顯微照相系統(tǒng)（日本Olympus公司），電泳裝置（美國(guó)Bio-RAD公司），ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)Santa Cruz公司）。

甘氨酸、礬酸鈉、Tris堿、十二烷基磺酸鈉、Tris-C1、疊氮鈉（美國(guó)Sigma公司），蛋白定量試劑盒（Pierce公司），硝酸纖維素膜（S&S公司），抗鼠及抗兔二抗（上海華舜公司），F(xiàn)AT 4、β-actin、YAP、CUL4（美國(guó) Santa Cruz公司），F(xiàn)AT4抗體（美國(guó)Novus Biologicals公司），DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），YAP抗體（美國(guó)Cell Signaling公司），CUL4抗體（美國(guó)Abcam公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)法 ①切片：將石蠟包埋組織作4μm厚連續(xù)切片；②烤片：切片置于60℃溫箱內(nèi)過夜；③脫蠟：常規(guī)3級(jí)二甲苯脫蠟5 min，5級(jí)梯度酒精脫水1 min，蒸餾水沖洗3 min，沖洗3次；④阻斷：3%過氧化氫H2O2甲醇溶液，室溫孵育15 min，PBS沖洗3 min/次，沖洗3次；⑤抗原修復(fù)（高溫高壓加熱法）：將修復(fù)液置于不銹鋼高壓鍋中煮開，將水化好的組織片浸沒在修復(fù)液中，煮沸1～2 min后，冷卻；⑥封閉：切片加1滴正常非免疫動(dòng)物血清，室溫下孵育10 min；⑦加一抗和二抗：切片加1滴一抗置于濕盒中4℃電冰箱中過夜，PBS沖洗3 min，沖洗3次；加1滴生物素標(biāo)記的二抗體，置于濕盒中4℃孵育30 min，PBS沖洗3 min，沖洗3次；加一滴鏈霉素抗生物素一過氧化物酶溶液，置于濕盒中4℃孵育30 min，PBS沖洗3 min，沖洗3次；⑧顯色：切片1滴加新鮮配置的DAB溶液，顯微鏡下觀察顯色情況，適時(shí)終止反應(yīng)；⑨復(fù)染、封片：切片蘇木素復(fù)染4 min，清水沖洗，酒精脫水，二甲苯透明，干燥，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察并進(jìn)行判定。判定標(biāo)準(zhǔn)：按照染色強(qiáng)度，不著色為1分，淺黃色為2分，棕黃色為3分，棕褐色為4分；著色腫瘤細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分比例計(jì)分，無腫瘤細(xì)胞染色為0分，＞10%為1分，10%～35%為2分，35%～75%為3分，＞75%為4分；染色細(xì)胞百分比得分乘以著色程度得分為免疫組織化學(xué)最后評(píng)分，0到6分為陰性，8到16分為陽性。

1.3.2 Western blot ①上樣和電泳：每組加相同量的蛋白，40 V恒流電泳，當(dāng)嗅酚藍(lán)帶將要移出至膠底時(shí)終止電泳。②轉(zhuǎn)膜：將電轉(zhuǎn)移墊、濾紙、目的凝膠、PVDF膜、濾紙、電轉(zhuǎn)移墊，放入轉(zhuǎn)膜電泳槽中，加滿新鮮的轉(zhuǎn)膜緩沖液，低溫條件轉(zhuǎn)膜90 min左右（電流為200 mA）。③封閉：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜浸于脫脂奶粉封閉液中封閉1 h。④抗體孵育：PVDF膜用封閉后，加入1∶1 000一抗4℃孵育過夜，用PBS洗膜（10 min/次，3次），加入二抗，室溫孵育1 h，再用PBS洗膜（10 min/次，5次）。⑤化學(xué)發(fā)光：按1∶1加入AB顯影液（與二抗HRP結(jié)合），在ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)上顯影。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用例表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，指標(biāo)相關(guān)性比較采用線性相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織中FAT4、CUL4和YAP的表達(dá)與性別、分化程度、病理類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

胃癌細(xì)胞中FAT4、CUL4和YAP在性別、病理類型陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在胃癌的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移、分化程度較高的FAT4、CUL4和YAP陽性表達(dá)率高。見表1。

表1 胃癌組織中FAT4、CUL4和YAP的表達(dá)與性別、分化程度、病理類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

2.2 正常胃組織及胃癌組織中FAT4、CUL4和YAP的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中CUL4和YAP表達(dá)量較正常胃組織增多，胃癌組織中FAT4表達(dá)量較正常胃組織減少，且FAT4、CUL4和YAP主要在細(xì)胞核、胞漿中表達(dá)，見圖1。

2.3 胃癌組織及正常胃組織中FAT4、CUL4及YAP蛋白表達(dá)比較

Western blot檢測(cè)，胃癌組織中CUL4及YAP蛋白表達(dá)量（1.18±0.19）和（0.89±0.21）高于正常胃組織（0.58±0.15）、（0.37±0.12），且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.563和17.549，均P=0.001）；胃癌組織中FAT4蛋白表達(dá)量（0.42±0.11）低于正常胃組織（0.94±0.12），且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.561，P=0.001）。見圖2、3。

2.4 胃癌組織中FAT4、CUL4及YAP蛋白表達(dá)相關(guān)性研究

胃癌組織中FAT4與YAP的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.931，P=0.012）；胃癌組織中CUL4與YAP的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.897，P=0.008）。見表2。

圖1 胃癌組織及正常胃組織中FAT4、CUL4及YAP的表達(dá) （×200）

圖2 胃癌組織及正常胃組織中FAT4、CUL4及YAP蛋白表達(dá)

表2 胃癌組織中FAT4、CUL4及YAP蛋白表達(dá)相關(guān)性研究

圖3 胃癌組織及正常胃組織中FAT4、CUL4及YAP蛋白表達(dá)比較

3 討論

Hippo-YAP信號(hào)通路可通過一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及磷酸化激酶調(diào)節(jié)YAP的活性，從而影響腫瘤的發(fā)生及發(fā)展情況[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲與許多信號(hào)通路具有密切的關(guān)系，如Wnt/β-catenin、Hippo-YAP及AKT/mTOR等[17-20]。研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞中Hippo信號(hào)通路的效應(yīng)分子YAP可以作為治療靶點(diǎn)被VGLL4競(jìng)爭(zhēng)性抑制[18]，同時(shí)造成胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯。因此，Hippo-YAP信號(hào)通路與胃癌的發(fā)生、發(fā)展具有密切的關(guān)系。

研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT4蛋白在食管癌[21-22]、肝癌[23]中表達(dá)量降低。在胃癌組織中，F(xiàn)AT4低表達(dá)能夠?qū)е挛赴┘?xì)胞增殖能力增強(qiáng)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞中FAT4、CUL4和YAP在性別、病理類型陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在胃癌的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移、分化程度較高的FAT4、CUL4和YAP陽性表達(dá)率高。研究發(fā)現(xiàn)[25]，YAP是Hippo信號(hào)通路的主要轉(zhuǎn)錄因子，且能夠在胞漿與胞核之間穿梭。YAP的表達(dá)量在胃癌組織胃高于正常胃組織[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中YAP蛋白的表達(dá)量高于正常胃組織，且胃癌組織中FAT4與YAP的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。同時(shí)MURPHY等[28]發(fā)現(xiàn)FAT4的缺失會(huì)造成YAP的核轉(zhuǎn)位增加并導(dǎo)致胚胎惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤的發(fā)生。AZZOLIN等[29]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT4低表達(dá)能夠增加細(xì)胞內(nèi)的非磷酸化的YAP的表達(dá)量。研究表明[30]，F(xiàn)AT4低表達(dá)能夠通過Hippo通路增加胞漿中YAP蛋白表達(dá)水平。因此，在胃癌中FAT4的低表達(dá)導(dǎo)致YAP蛋白表達(dá)量增加，這可能與Hippo信號(hào)通路的調(diào)節(jié)有關(guān)，說明FAT4可能通過調(diào)控Hippo-YAP信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞侵襲過程。

胃癌組織中CUL4表達(dá)量高于正常胃組織[31]。QIAO等[32]研究發(fā)現(xiàn)CUL4能促進(jìn)胃癌細(xì)胞惡性增殖和轉(zhuǎn)移，本研究發(fā)現(xiàn)CUL4表達(dá)量在胃癌組織中高于正常胃組織，與以往研究結(jié)果相符[31]。CUL4高表達(dá)可以促進(jìn)YAP進(jìn)入細(xì)胞核，同時(shí)胃癌組織中CUL4與YAP表達(dá)呈正相關(guān)[33]。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中YAP與CUL4表達(dá)呈正相關(guān)，與以往研究結(jié)果一致。說明CUL4可能通過調(diào)控Hippo-YAP信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲過程。

綜上所述，F(xiàn)AT4通過調(diào)控Hippo-YAP信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞侵襲過程，CUL4通過調(diào)控Hippo-YAP信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲過程。