（山西大同大學醫(yī)學院 外科教研室，山西 大同 037009）

甘氨酸是中樞神經系統(tǒng)主要的抑制性神經遞質。脊髓背角中甘氨酸傳遞在各種疼痛進程中起著關鍵的作用；而鞘內注射甘氨酸在動物疼痛模型中具有鎮(zhèn)痛作用[1-2]。以往研究表明[3]，側腦室注射甘氨酸可通過甘氨酸受體對急性熱痛和化學傷害性刺激大鼠產生鎮(zhèn)痛作用。細胞外液甘氨酸濃度受到甘氨酸轉運體（Glycine transporters,GlyT）調控，GlyT有2個亞型，GlyT1和GlyT2[4]。其中GlyT2位于脊髓甘氨酸能神經元突觸前膜，可轉運突觸間隙中的甘氨酸，抑制甘氨酸傳遞。最近研究表明[5]，鞘內注射GlyT2抑制劑ALX1393對神經病理性疼痛動物模型具有鎮(zhèn)痛作用。但是GlyT2抑制劑在脊髓以上區(qū)域傷害性傳遞中的作用仍不明確。近年有研究報道[6]，GT-0198是一種結構新穎的GlyT2抑制劑，具有很強的抑制GlyT2作用。因此，本研究主要觀察側腦室注射選擇性GlyT2抑制劑GT-0198對大鼠慢性壓迫損傷（chronic constriction injury,CCI）神經病理性疼痛模型的鎮(zhèn)痛作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組 35只雄性SD大鼠，體重200～250 g，購于山西醫(yī)科大學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（晉）2009-0001。室內溫度保持在25℃左右，濕度在50%左右。明暗周期12 h，自由飲水和進食。將SD大鼠隨機分成正常對照組和CCI組。CCI組大鼠進一步分為Sham組、Vehicle+CCI組、GT-0198（10 μg）+CCI組、GT-0198（50 μg）+CCI組、GT-0198（100 μg）+CCI組和 GT-0198（100μg）+士的寧（Strychnine,STR）（10 μg）+CCI組，每組5只大鼠。

1.1.2 實驗儀器和試劑 GT-0198和STR（美國Sigma公司），腦立體定位儀（北京智鼠多寶生物科技有限責任公司），ZH-RXZ型柔性顱骨鉆（安徽正華生物儀器有限公司），冷熱板測痛儀（北京米蘭科技有限公司），Von Frey針刺觸覺測量套件（深圳沃德生命科技有限公司），熱痛刺激儀（上海玉研科學儀器有限公司），大鼠旋轉活動輪監(jiān)測系統(tǒng)（北京拜安吉科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠CCI模型復制 10%水合氯醛麻醉（150～200 mg/kg）大鼠，從大鼠左后肢大腿中后部切開皮膚，然后鈍性分離肌肉，暴露大鼠坐骨神經，在坐骨神經三根分叉上游主干部位游離神經7 mm左右，在距神經起始處上方2 mm，用線結扎坐骨神經4道，每道間隔約1 mm[7]。Sham組除不結扎坐骨神經，其余程序同CCI。

1.2.2 側腦室插管 在CCI模型復制同一天，把麻醉大鼠固定于立體定位儀上。剪去大鼠頭部毛發(fā)，碘伏消毒。導管安裝位置為：前骨縫的交點處即前囟沿著中骨縫向前約1.5 mm，水平離中骨縫向右約1.5 mm的位置。使立體定位儀上方鋼針的針頭對準導管安裝位置打孔。將導管慢慢插入側腦室。專用膠水將導管固定于顱骨上，然后縫合顱骨皮膚。腹腔注射適量青霉素鈉以防止感染。在CCI手術后7 d側腦室注射各種試劑，注射量均為5 μl，且在1 min內完成。

1.2.3 電子Von Frey檢測 主要是對大鼠縮足閾值（paw withdrawal threshold,PWT）進行測定。Von Frey細絲（1.0～15 g）垂直刺激CCI大鼠后足中央處，持續(xù)5～10 s，出現明顯縮足、舔足及抬足行為為陽性反應，重復3次，間隔5 min。

1.2.4 冷板實驗 將CCI大鼠放置在冷板測試儀器上，冷板溫度為4℃。觀察并記錄大鼠縮足反應潛伏期（paw withdrawal latency,PWL）。重復3次，間隔5 min，取平均值。

1.2.5 熱刺激儀檢測 采用熱痛刺激儀記錄CCI大鼠對熱刺激的PWL。為避免損傷，30 s為上限。重復3次，間隔5 min，取平均值。

1.2.6 旋轉實驗 正常大鼠置于旋轉滾筒上，其速度為在5 min內從4增加到40 r/min，迫使其向前走，避免跌下。記錄大鼠跌下的時間。

1.3 統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用Kolmogorov-Smirnov檢驗對數據進行正態(tài)性分析，進一步兩兩比較采用Bonferroni法，多組間比較采用方差分析和重復測量設計的方差分析，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 GT-0198在CCI大鼠機械性痛覺過敏中的作用

Vehicle+CCI組大鼠左后肢 PWT 為（15.2±3.8）g，而Sham組大鼠為（36.8±4.4）g，差異有統(tǒng)計學意義（t=10.823，P=0.000），Vehicle+CCI組PWT降低。不同劑量GT-0198均可提高CCI大鼠PWT，經方差分析差異有統(tǒng)計學意義（F=21.865，P=0.002），且呈劑量依賴性。大鼠PWT Vehicle+CCI組與不同劑量GT-0198+CCI組比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間的PWT有差異（F=16.754，P=0.003）；②多組間PWT有差異（F=21.305，P=0.000），Vehicle+CCI組PWT低于不同劑量GT-0198+CCI組；③多組PWT變化趨勢有差異（F=13.964，P=0.006）。此外，GT-0198（100 μg）的效應可被 STR（10 μg）完全逆轉。見表1和圖1。

表1 各組不同時間的PWT比較 （n=5，g，±s）

表1 各組不同時間的PWT比較 （n=5，g，±s）

0 min 30 min 60 min 120 min 180 min Sham 組 39.0±6.7 39.0±6.7 39.0±6.7 39.0±6.7 39.0±6.7 Vehicle+CCI組 14.3±4.5 13.6±4.0 15.7±5.1 16.3±5.6 15.4±5.0 GT-0198（10 μg）+CCI組 14.5±4.0 29.6±10.4 19.7±4.8 16.4±5.0 15.5±4.7 GT-0198（50 μg）+CCI組 14.4±4.1 39.5±14.8 36.3±13.6 33.8±12.4 27.3±11.8 GT-0198（100 μg）+CCI組 14.3±4.3 39.4±15.0 32.5±12.7 15.7±6.2 15.2±6.6 GT-0198（100 μg）+STR（10 μg）+CCI組 14.6±4.2 19.7±5.4 19.4±5.1 18.6±4.7 16.9±4.3組別

圖1 側腦室注射GT-0198對CCI大鼠機械性痛覺過敏的影響

2.2 GT-0198在CCI大鼠冷痛覺過敏中的作用

Sham組大鼠在觀察期內未出現肢體移動和晃動，而Vehicle+CCI組大鼠基線后肢PWL為（30.3±8.8）s，差異有統(tǒng)計學意義（t=11.247，P=0.000），Vehicle+CCI組大鼠PWL降低。不同劑量GT-0198均可延長CCI大鼠PWL，經方差分析差異有統(tǒng)計學意義（F=16.632，P=0.004），且呈劑量依賴性。大鼠PWL Vehicle+CCI組與不同劑量GT-0198+CCI組比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間的PWL有差異（F=19.073，P=0.001）；②多組PWL有差異（F=25.624，P=0.000），Vehicle+CCI組PWL短于不同劑量GT-0198+CCI組；③多組PWL變化趨勢有差異（F=12.861，P=0.007）。此外，GT-0198（100μg）的效應可被STR（10 μg）完全逆轉。見表2和圖2。

2.3 GT-0198在CCI大鼠熱痛覺過敏中的作用

Vehicle+CCI組大鼠基線后肢 PWL 為（6.0±0.8）s，而Sham組大鼠PWL是（9.8±1.1）s，差異有統(tǒng)計學意義（t=9.729，P=0.000），Vehicle+CCI組大鼠PWL縮短。不同劑量GT-0198對CCI大鼠PWL均無顯著影響（F=6.042，P=0.067）。大鼠 PWL Vehicle+CCI組與不同劑量GT-0198+CCI組比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的PWL無差異（F=5.847，P=0.074）；②多組 PWL無差異（F=3.305，P=0.153）；③多組PWL變化趨勢無差異（F=4.971，P=0.087）。見表3和圖3。

表2 各組不同時間的PWL比較 （n=5，s，±s）

表2 各組不同時間的PWL比較 （n=5，s，±s）

0 min 30 min 60 min 120 min 180 min Sham 組 180.0±0.0 180.0±0.0 180.0±0.0 180.0±0.0 180.0±0.0 Vehicle+CCI組 30.6±14.4 29.3±15.0 28.7±15.3 30.3±15.6 29.4±15.2 GT-0198（10 μg）+CCI組 30.5±15.0 102.6±19.4 56.7±16.8 40.4±17.3 39.5±17.5 GT-0198（50 μg）+CCI組 30.4±14.2 165.6±21.8 176.3±20.7 118.8±18.6 59.5±17.0 GT-0198（100 μg）+CCI組 30.7±14.3 178.4±22.3 179.5±22.0 136.7±19.7 90.6±18.4 GT-0198（100 μg）+STR（10 μg）+CCI組 30.0±13.9 40.7±15.2 39.1±14.1 38.6±14.5 37.9±14.3組別

圖2 側腦室注射GT-0198對CCI大鼠冷痛覺過敏的影響 （n=5）

圖3 側腦室注射GT-0198對CCI大鼠熱痛覺過敏的影響

表3 各組不同時間的PWL比較 （n=5，s，±s）

表3 各組不同時間的PWL比較 （n=5，s，±s）

0 min 30 min 60 min 120 min 180 min Sham 組 9.4±1.3 9.4±1.3 9.4±1.3 9.4±1.3 9.4±1.3 Vehicle+CCI組 5.9±0.5 5.6±0.4 6.0±0.5 6.1±0.6 6.2±0.6 GT-0198（10 μg）+CCI組 5.9±0.4 5.7±0.5 6.1±0.4 6.4±0.6 6.5±0.7 GT-0198（50 μg）+CCI組 5.9±0.4 6.3±0.8 6.2±0.6 6.6±0.5 6.6±0.6 GT-0198（100 μg）+CCI組 5.9±0.5 6.4±0.6 6.5±0.7 7.1±0.6 6.8±0.6 GT-0198（100 μg）+STR 組（10 μg）+CCI組 5.8±0.5 5.7±0.4 6.0±0.5 6.2±0.7 6.1±0.5組別

圖4 側腦室注射GT-0198對正常大鼠旋轉功能的影響

2.4 GT-0198對正常大鼠運動功能的影響

Vehicle+CCI組大鼠基線旋轉潛伏期是（108±12）s。不同劑量GT-0198對正常大鼠旋轉潛伏期均無顯著影響（F=7.184，P=0.059）。大鼠旋轉潛伏期Vehicle+CCI組與不同劑量GT-0198+CCI組比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的旋轉潛伏期無差異（F=3.769，P=0.145）；②多組旋轉潛伏期無差異（F=4.735，P=0.097）；③多組旋轉潛伏期變化趨勢無差異（F=2.086，P=0.262）。見表4和圖4。

表4 各組不同時間的大鼠旋轉功能比較 （n=5，±s）

表4 各組不同時間的大鼠旋轉功能比較 （n=5，±s）

組別 0 min 30 min 60 min 120 min Vehicle+CCI組 110.3±14.6 108.5±15.7 109.1±15.3 110.8±15.6 GT-0198（10 μg）+CCI組 109.5±15.1 107.6±14.6 108.7±16.4 109.4±15.3 GT-0198（50 μg）+CCI組 109.4±14.8 106.5±14.7 108.5±13.9 108.9±14.7 GT-0198（100 μg）+CCI組 103.3±14.5 90.4±13.1 92.5±12.8 98.7±13.2

3 討論

GlyT2在脊髓及脊髓上的甘氨酸能在神經元中表達，在抑制甘氨酸傳遞調節(jié)中發(fā)揮重要作用[8]。選擇性GlyT2抑制劑可能是一種新型的鎮(zhèn)痛藥物，可緩解不同類型的疼痛。全身或鞘內注射GlyT2抑制劑對急性、持續(xù)性和慢性疼痛具有鎮(zhèn)痛作用[9]。但是GlyT2抑制劑在脊髓以上中樞區(qū)域傷害性傳遞中的作用仍不明確。

GT-0198劑量依賴性抑制CCI大鼠機械和冷痛覺過敏，但對熱痛覺過敏無影響。盡管甘氨酸在不同疼痛模型中傳遞方式不一樣，但不同疼痛模型中的鎮(zhèn)痛效應仍不能完全解釋。為了確認GT-0198介導的抗痛覺過敏是通過抑制脊髓上GlyT2及活化的甘氨酸受體，因而側腦室預先注射甘氨酸受體拮抗劑STR。結果顯示，STR可完全逆轉GT-0198對CCI大鼠機械和冷痛覺過敏的影響。GT-0198是通過增強甘氨酸能傳遞而發(fā)揮作用的。脊髓上GT-0198的作用機制可能是激活疼痛抑制系統(tǒng)。延髓頭端腹內側髓質的甘氨酸神經元直接投射到脊髓，有助于脊髓傷害性刺激的抑制[10]。外源甘氨酸注入丘腦腹側基底可減少軀體感覺神經元放電，而聯合應用STR可拮抗該作用[11]。上述結果表明，通過GT-0198增加丘腦甘氨酸水平可抑制傷害性傳遞。但是目前仍不明確中樞神經系統(tǒng)其他區(qū)域GlyT2表達是否與GT-0198鎮(zhèn)痛作用相關。同時在大腦特定區(qū)域GlyT1抑制劑也可產生鎮(zhèn)痛作用。GlyT1抑制劑（肌氨酸），注入到前額葉皮層可減少神經病理性疼痛大鼠模型損傷足的機械敏感性[12]。本研究發(fā)現，雖然甘氨酸神經元在控制脊髓運動功能方面發(fā)揮重要的作用，但它們在大腦中的作用仍不明確。側腦室注射甘氨酸不影響動物的運動功能[13]。GlyT2在脊髓中樞的生理作用仍不清楚。下丘腦室旁核微量注射甘氨酸可引起心率減慢，尿量增加等，而STR可抑制上述反應[14]。下丘腦中GlyT2抑制劑可能對心血管和腎臟有影響。要明確GlyT2生理作用以及GlyT2抑制劑的藥理作用，需要GT-0198注射到中樞神經系統(tǒng)中特定區(qū)域。

綜上所述，腦室注射選擇性GlyT2抑制劑GT-0198可減輕CCI大鼠模型機械和冷痛覺過敏，而且對正常大鼠運動功能無影響。