王明

[摘要] 目的 探討DNA甲基化檢測及其在急性髓系白血?。ˋML）和骨髓增生異常綜合征（MDS）中的臨床應用。方法 選取2016年5月～2017年5月我院收治的急性髓系白血病和骨髓增生異常綜合征患者40例為研究組，選取同期健康體檢人員40例為對照組，比較兩組研究對象DNA甲基化檢測結果。 結果 研究組患者PAX6甲基化表達明顯高于對照組健康人群（P<0.05），同時高?；颊呒谆矫黠@高于低危患者（P<0.05）；研究組患者GNDF甲基化表達明顯高于對照組健康人群（P<0.05），同時高危患者甲基化水平明顯高于低?；颊撸≒<0.05）；研究組患者TJP1甲基化表達明顯高于對照組健康人群（P<0.05），同時高危患者甲基化水平明顯高于低?；颊撸≒<0.05）。結論 急性髓系白血病和骨髓增生異常綜合征患者的PAX6、GNDF、TJP1表達均呈現出高甲基化狀態(tài)，且表達水平與患者病情存在正相關，可以作為臨床診斷及判斷患者預后的依據。

[關鍵詞] DNA甲基化；急性髓系白血?。还撬柙錾惓＞C合征；表達； 血液系統(tǒng)疾病

[中圖分類號] R733.71 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）12-0001-04

Analysis on DNA methylation detection and its clinical application in acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome

WANG Ming

Department of Hematology， Yuyao People's Hospital in Zhejiang Province， Yuyao 315400， China

[Abstract] Objective To investigate DNA methylation detection and its clinical application in acute myeloid leukemia （AML） and myelodysplastic syndrome （MDS）. Methods 40 cases of patients with acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome who were admitted to our hospital from May 2016 to May 2017 were selected. 40 subjects receiving health examination during the same period of time were selected as the control group. The DNA methylation test results were compared between the two groups. Results The methylation expression of PAX6 in the study group was significantly higher than that in control group （P<0.05）. At the same time， the methylation level in high risk patients was significantly higher than that in low risk patients（P<0.05）； the methylation expression of GNDF in the study group was significantly higher than that in control group（P<0.05）. At the same time， the methylation level in high risk patients was significantly higher than that in low risk patients（P<0.05）； the methylation expression of TJP1 in the study group was significantly higher than that in control group（P<0.05）. At the same time， the methylation level in high risk patients was significantly higher than that in low risk patients（P<0.05）. Conclusion The expressions of PAX6， GNDF and TJP1 in patients with acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndromes are hypermethylated， and the expression level is positively correlated with the patient's condition， which can serve as a basis for clinical diagnosis and determination of prognosis.

[Key words] DNA methylation； Acute myeloid leukemia； Myelodysplastic syndrome； Expression； Hematological diseases

急性髓系白血病和骨髓增生異常綜合征屬于惡性的血液克隆疾病，其病因為造血干細胞失去正常分化能力及增殖調節(jié)。若治療不及時，患者常出現致命感染或器官浸潤。AML以及MDS的具體作用機制仍不夠明確，不同毒素代謝以及DNA修復是研究的重點。同時體外研究結果表明，基因突變在疾病發(fā)生發(fā)展過程中有重要的影響[1]。通常情況下，惡性腫瘤患者基因DNA的甲基化表達呈現出下降趨勢，不過特定區(qū)域的基因則呈現出高甲基化特點。本研究旨在分析AML以及MDS患者的DNA甲基化表達情況，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2016年5月～2017年5月我院收治的急性髓系白血病和骨髓增生異常綜合征患者40例為研究組，男22例，女18例，年齡23～59歲，平均（36.2±1.3）歲，病程2～9年，平均（5.4±0.6）年，其中高?；颊?8例，低?；颊?2例。納入標準：患者確診符合急性髓系白血病、骨髓增生異常綜合征；未合并其他血液系統(tǒng)疾病；知情同意本研究。排除標準：合并惡性腫瘤患者；合并嚴重肝腎功能障礙患者；妊娠哺乳期女性。選取同期健康體檢人員40例為對照組，男25例，女15例，年齡24～58歲，平均（35.4±1.2）歲。兩組研究對象的一般資料比較，無明顯差異（P>0.05）。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及處理方法 采集研究對象骨髓標本3 mL，采集得到的標本首先使用肝素處理從而發(fā)揮抗凝效果，標本經過抗凝處理后進行核細胞的提取操作。若未能收集到患者或健康研究獨享的新鮮骨髓標本，則需要選用凍存細胞或者染色體懸液[2]。

1.2.2 分離白細胞 將標本轉移到離心管中，1000 g條件下持續(xù)離心10 min。去除上清血漿之后添加紅細胞裂解液之后持續(xù)裂解3 min。1000 g條件下再次離心10 min后去除上清液，如果仍然存在紅細胞需要再次進行裂解。添加10 mL的PBS磷酸緩沖液之后均勻進行吹打，離心10 min后去除上清液。添加PBS 2 mL之后轉移到離心管中。10000轉高速條件下持續(xù)離心30 s之后去除上清，-60℃條件下儲存。

1.2.3 DNA提取 應用DNA試劑盒進行白細胞DNA的提取，從冰箱中取出研究對象骨髓標本，添加500 μL的裂解液，45℃條件下持續(xù)孵育15 min。取出完全裂解之后的骨髓標本，添加120 μL的蛋白沉淀劑，充分震蕩之后10000 r/min持續(xù)離心10 min。將得到的上清液轉移到EP管，使用異丙醇并且進行充分的震蕩，后以 10000 r/min的速度持續(xù)進行離心處理3 min。

1.2.4 亞硫酸氫鹽DNA修飾 應用EpiTect進行DNA標本的修飾。操作步驟方面，將Bisulfite分裝管中添加1000 μL的去Rnase并混勻，之后添加DNA溶解，將Bisulfite所需成分添加到PCR管中。PCR管合上并且充分混勻，常溫條件下放置。添加Protect Buffer時，若顏色從綠變藍，即可停止添加，pH已經滿足反應所需條件。之后行DNA的修飾反應，將PCR管放置到Thermal中，完成修飾反應后持續(xù)離心PCR管1 min。完成離心之后轉移反應液到離心管中。將含有10 ng/mL的RNA BufferBL添加到離心管中，混勻后持續(xù)離心1 min。轉移離心管中的溶液到Epitectspincolumns，10000 r/min持續(xù)離心30 s 后去除上清。添加Buffer BW 300 μL到各個spincolumn中，10000 r/min持續(xù)離心30 s 后去除上清。添加Buffer BD 300 μL到spincolumn中，合上蓋子后常溫條件下持續(xù)孵育30 min。10000 r/min持續(xù)離心30 s之后去除上清。若BufferBD中存在沉淀物，則不能直接添加到spincolumns中，每次使用BufferBD后需蓋上瓶蓋，避免同空氣中的二氧化碳接觸而發(fā)生酸化問題。添加BufferBW 300 μL到spincolumn中，最大轉速離心1 min，10000 r/min持續(xù)離心30 s之后去除上清，將其放置到collectiontubes中，重復操作之后將spincolumns放置到新的collectiontubes中，10000 r/min持續(xù)離心2 min去除液體。打開spincolumns蓋子并轉移到離心管中，45℃條件下持續(xù)孵育10 min，每個spincolumns薄膜添加BufferEB 20 μL，10000 r/min持續(xù)離心2 min，洗脫純化之后的DNA，為提高洗脫的效果從而加大DNA的產量，應當額外添加BufferEB 20 μL，將純化之后的DNA-30℃條件下儲存。

1.2.5 甲基化PCR 應用甲基化引物（M）以及非甲基化引物（U）PCR擴增硫化之后的DNA，反應條件方面，在80℃條件下進行預變性，持續(xù)時間為20 min，之后80℃條件下持續(xù)變性1 min，45℃條件下退火1 min，69℃條件下延伸30 s，反復進行30個循環(huán)后，69℃條件下延伸5 min，常溫條件下保存PCR得到產物。

1.2.6 PCR產物電泳檢測 取5 μL的PCR擴增產物，使用2.0%的瓊脂糖膠，在110 V條件下持續(xù)電泳1 h，使用100bpMarker標記DNA的分子量，從而檢測擴增片段。后對電泳得到的凝膠進行系統(tǒng)照像，分析電泳條帶的灰度值（Int值），從而判斷DNA的甲基化水平。

1.3觀察指標

對兩組研究對象的骨髓標本進行甲基化PCR，分別檢測其PAX6基因、GDNF基因及TJP1基因的條帶。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢檢，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1兩組PAX6甲基化水平比較

研究組患者PAX6甲基化表達明顯高于對照組健康人群（P<0.05），同時高?；颊呒谆矫黠@高于低?；颊撸≒<0.05），見表1。

表1 兩組PAX6甲基化水平比較（x±s，copies/10000abl copies）

2.2 兩組研究對象GNDF甲基化水平比較

研究組患者GNDF甲基化表達明顯高于對照組健康人群（P<0.05），同時高?；颊呒谆矫黠@高于低?；颊撸≒<0.05），見表2。

2.3兩組研究對象TJP1甲基化水平比較

研究組患者TJP1甲基化表達明顯高于對照組健康人群（P<0.05），同時高?；颊呒谆矫黠@高于低?；颊撸≒<0.05），見表3。

表3 兩組研究對象TJP1甲基化水平比較

（x±s，copies/10000abl copies）

3討論

急性髓系白血病和骨髓增生異常綜合征是一種常見的血液系統(tǒng)疾病，支持治療、傳統(tǒng)化療及干細胞移植治療為常用的治療方法，但化療易導致出現耐藥及復發(fā)問題，而移植造血干細胞的失敗幾率較高，患者的死亡風險同樣較高，治療效果均不夠理想[3-4]。隨著臨床上DNA甲基化相關研究的日益深入，各種去甲基化治療的藥物種類越來越多，同時逐漸應用于白血病患者的治療過程中。DNA甲基化指的是DNA在轉移酶（DNMT）的影響作用下，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）能夠源源不斷地提供甲基從而轉化成為5-甲基胞嘧啶，不斷合成甲基化DNA[5-6]。甲基化產物能夠形成CpG位點，而相關研究的結果提示，人類的基因組中包含2000萬以上的CpG位點，有60%左右的CpG苷酸屬于甲基化狀態(tài)，少數非甲基化的CpG雙核苷酸呈現出集聚的傾向，從而形成GC水平較高同時CpG苷酸比較密集的位置，研究人員稱之為CpG島[7]。CpG島通常存在于基因啟動子以及外顯子的位置。

近年來隨著對腫瘤發(fā)生發(fā)展具體機制的深入探討，腫瘤基因啟動子位置的甲基化對血液系統(tǒng)疾病的影響日益受到人們的重視[8-9]?；騿幼拥母呒谆癄顟B(tài)是影響急性髓系白血病患者的預后質量的重要風險因素。遺傳學研究的結果表明，甲基化異常是部分白血病的典型特點，通常與已知染色體異位及基因突變存在聯系[10-11]。研究人員發(fā)現白血病相關IDH基因突變會導致PAX6基因出現甲基化異常，且影響到造血干細胞的正常分化[12]。本研究結果顯示，研究組患者PAX6甲基化表達明顯高于對照組健康人群（P<0.05），同時高?；颊呒谆矫黠@高于低?；颊撸≒<0.05），與相關研究結果相符。最新研究結果顯示，髓系血液腫瘤患者的細胞株及白血病患者中，PAX6基因高甲基化同基因沉默存在不容忽視的聯系。PAX6高表達在急性髓系白血病患者中出現的幾率較高，正常突變通常情況下并不會設計甲基化[13]。本研究應用亞硫酸氫鹽測序白血病患者的骨髓標本甲基化。這一技術與其他的DNA甲基化檢測技術比較而言有著更高的靈敏度，借助于對基因組的DNA完成測序能夠得到精確度比較高的甲基化圖譜，同時也能夠發(fā)現同基因激活或基因沉默存在聯系的CpG位點具體位置，且分析甲基化情況，即能可靠直接地體現DNA的甲基化程度[14]。

研究發(fā)現，乳腺瘤患者及膠質瘤患者中的GNDF基因高表達且伴隨著驅動子的高甲基化，并非高表達合并甲基化[15]。5-氮雜脫氧胞嘧啶核苷可以降低GNDF基因的甲基化水平，但在此過程中不會影響到GNDF的表達量。本研究結果發(fā)現，研究組患者GNDF甲基化表達明顯高于對照組健康人群（P<0.05），同時高危患者甲基化水平明顯高于低?；颊撸≒<0.05），提示急性髓系白血病患者的骨髓GNDF基因甲基化水平要顯著高于健康人群，而健康人群的GNDF基因甲基化水平比較低。研究發(fā)現，抑癌基因高甲基化是血液惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要影響因素，DNA甲基化能夠改變DNA結構，不過并不會對DNA序列帶來影響[16]。近年來臨床上去甲基化藥物如地西他濱及阿扎胞苷在白血病等血液系統(tǒng)疾病治療中的應用日益廣泛，主要借助于逆轉甲基化的過程，從而重新激活抑癌基因，發(fā)揮白血病治療效果[17]。

本研究結果提示，研究組患者TJP1甲基化表達明顯高于對照組健康人群（P<0.05），同時高?；颊呒谆矫黠@高于低?；颊撸≒<0.05），提示TJP1甲基化異常在AML/MDS發(fā)生發(fā)展的過程中有不容忽視的重要影響。同腫瘤遺傳學不同的是，人體表觀遺傳學層面出現的改變，可以借助藥物來改變其表達水平[18-19]。PAX6（pairedbox6）基因全稱為配對核因子6基因，屬于PAX轉錄因子家族的重要組成部分。GDNF屬于TGF-β家族，相關研究結果表明PAX6及GDNF基因在MDS患者的身體內部存在著高甲基化的傾向。TJP1屬于ZO-1基因，隨著患者腫瘤惡性程度的上升而呈現出表達水平降低的趨勢，表明該基因與腫瘤演進存在密切聯系。總之，DNA甲基化異常在血液系統(tǒng)疾病發(fā)生過程中有重要作用，主要體現在抑癌基因甲基化水平的上升[20]。DNA啟動子位置甲基化異常能作為患者病情診斷的生物學標志物，因此，對DNA甲基化的研究對診斷及治療惡性血液疾病有重要的臨床價值。地西他濱是臨床上常用的去甲基化藥物之一，在惡性血液病治療領域取得理想應用效果，高劑量用藥與化療藥物的細胞毒性類似，同時骨髓抑制作用也較明顯，低劑量用藥則主要實現去甲基化的影響，從而控制腫瘤細胞增殖。不過當前情況下AML/MDS去甲基化的致病作用機制還需要后續(xù)研究，去甲基化治療也需要進一步的研究加以證實。

綜上所述，急性髓系白血病和骨髓增生異常綜合征患者的PAX6、GNDF、TJP1表達均呈現出高甲基化狀態(tài)，且表達水平與患者病情存在正相關，可以作為臨床診斷以及判斷患者預后的依據。

[參考文獻]

[1] 金鳳羽.GnRH-a輔助治療子宮內膜異位癥療效及對患者組蛋白H3K4甲基化水平的影響[J].河北醫(yī)學，2017， 23（6）：918-923.

[2] Lwenberg B，Morgan G，Ossenkoppele GJ，et al. Phase I/II clinical study of Tosedostat，an inhibitor of aminopeptidases，in patients with acute myeloid leukemia and myelodysplasia[J].Journal of Clinical Oncology，2015，28（28）：4333-4338.

[3] 樊婷.維生素D對急性白血病多重耐藥細胞的逆轉耐藥機制探討[J].河北醫(yī)學，2016，22（12）：2050-2052.

[4] 王曉果，廖君，孔佩艷，等.THBS1基因甲基化與急性髓系白血病發(fā)病關系的研究[J].中國輸血雜志，2015，28（11）：1308-1311.

[5] Ciurea SO，Zhang MJ，Bacigalupo AA，et al. Haploidentical transplant with posttransplant cyclophosphamide vs matched unrelated donor transplant for acute myeloid leukemia[J]. Blood，2015，126（8）：1033-1040.

[6] 萬婷，龐星辰，韓曉楓，等.骨髓增生異常綜合征DNA甲基化及去甲基化藥物研究進展[J].中國實用內科雜志，2016，1（2）：159-161.

[7] 康慧媛，王新榮，高麗，等.ZO-1基因甲基化在MDS進展中的意義[J].中國實驗血液學雜志，2015，23（3）：746-749.

[8] Chan S M，Thomas D，Corceszimmerman MR，et al. Isocitrate dehydrogenase 1 and 2 mutations induce BCL-2 dependence in acute myeloid leukemia[J].Nature Medicine，2015，21（2）：178-184.

[9] 肖志堅.骨髓增生異常綜合征——已開啟個體化治療新時代？[J].中國醫(yī)藥生物技術，2016，11（2）：114-115.

[10] Roe JS，Mercan F，Rivera K，et al. BET Bromodomain Inhibition Suppresses the Function of Hematopoietic Transcription Factors in Acute Myeloid Leukemia[J]. Mole-cular Cell，2015，58（6）：1028-1039.

[11] 謝忻琰，邵宗鴻，付蓉，等.HOXA9在骨髓增生異常綜合征中的表達及意義[J].中國實驗血液學雜志，2016， 24（4）：1100-1103.

[12] 許紅月，謝彥暉.骨髓增生異常綜合征相關基因研究進展[J].臨床血液學雜志，2017，（3）：407-412.

[13] Appelbaum FR，Kopecky KJ. Long-term survival after chemotherapy for acute myeloid leukemia：the experience of the Southwest Oncology Group[J]. Cancer，2015，80（S11）：2199-2204.

[14] 婁典.DNA甲基轉移酶3A基因突變在惡性血液病中的作用[J].國際輸血及血液學雜志，2015，38（2）：145-148.

[15] 胡學瓊，張學軍，寶國秀.地西他濱每日兩次給藥四天方案治療骨髓增生異常綜合征臨床觀察[J].中國藥物與臨床，2016，16（2）：263-265.

[16] 常乃柏.DNA甲基化靶向藥物在急性髓系白血病中的應用[J].中國腫瘤臨床，2017，44（2）：64-67.

[17] 唐善浩，裴仁治，李空飛，等.DNA甲基化介導的miR-720沉默與急性髓系白血病生物學特征的關系[J].中華血液學雜志，2014，35（11）：1009-1012.

[18] 張雋瑜，李琳潔.骨髓增生異常綜合征DNA甲基化及其治療機制的進展[J].中國腫瘤，2014，23（6）：497-500.

[19] 朱晨，馬燕，許小平，等.骨髓增生異常綜合征向急性髓系白血病轉化相關基因的研究進展[J].中國實驗血液學雜志，2014，22（3）：873-878.

[20] 鄧春陽，陳雙，江明，等.多基因甲基化在骨髓增生異常綜合征患者中的預后價值[J].中國實驗血液學雜志，2017， 25（4）：1118-1122.

（收稿日期：2017-12-08）