趙華龍,毛 涵,2,劉 佳,薛 菲,湯新慧,*

(1.鹽城師范學(xué)院,江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室,江蘇鹽城 224051; 2.南京工業(yè)大學(xué),生物與制藥工程學(xué)院,江蘇南京 210009; 3.江蘇大學(xué)藥學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

積雪草(Centellaasiatica(L.)Urban)為傘形科積雪草屬草本植物,在我國主要分布于華東、華南、中南及西南等地。積雪草除作為傳統(tǒng)中藥,用于外科疾病的治療和美容保健領(lǐng)域外,也可以食用,在我國主要以干燥葉片入茶,在東南亞一些國家新鮮葉可作蔬菜或果汁[1-2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),積雪草除能抗菌消炎、抑制瘢痕增生及修復(fù)皮膚損傷外,還具有免疫調(diào)節(jié)與神經(jīng)保護(hù)、抗?jié)儭㈡?zhèn)痛、抗抑郁、抗腫瘤等多種藥理活性[2-3],而五環(huán)三萜類化合物積雪草酸(Asiatic acid,AA)為其最重要的有效成分,具有抗炎護(hù)膚、保肝護(hù)肺、抗抑郁、降血糖、抗腫瘤等多種生物活性[4-5]。

鎘(cadmium,Cd)是一種重要的工業(yè)和環(huán)境污染物,極易在體內(nèi)蓄積,對肝、腎、肺、睪丸、骨骼等多種器官均可造成損傷,其中,肝臟是鎘最初積累和產(chǎn)生毒性的主要靶器官[6]。最新研究發(fā)現(xiàn),鎘的肝毒性機(jī)制主要與線粒體結(jié)構(gòu)和功能的破壞有關(guān)[7-8]。

本研究在課題組前期初步發(fā)現(xiàn)積雪草酸能顯著對抗肝細(xì)胞損傷、保護(hù)肝臟[9-10]的基礎(chǔ)上,運(yùn)用Cd2+誘發(fā)的大鼠肝細(xì)胞離體線粒體高通透性轉(zhuǎn)運(yùn)(MPT)模型,以線粒體腫脹度、膜電位耗散、線粒體內(nèi)游離鈣釋放以及細(xì)胞色素c(Cyt c)和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)釋放水平等為指標(biāo),探討AA對鎘誘發(fā)的肝細(xì)胞線粒體損傷的防護(hù)作用及其機(jī)制,旨在為AA的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Wistar大鼠 48只,雄性,體重180～220 g,南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,許可證號:SCXK(蘇)2013-0005;積雪草酸、釕紅(RR)、甘露醇、蔗糖、EDTA、琥珀酸、魚藤酮、羅丹明(Rh123)、Fura-2/AM Sigma-Aldrich公司;Tris-HCl、Hepes Promega公司;兔抗人/大鼠/小鼠凋亡誘導(dǎo)因子抗體 R&D公司;鼠抗人/大鼠/小鼠細(xì)胞色素c抗體 Trevigen公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠及羊抗兔二抗 武漢博士德生物工程有限公司;DAB(either 3,3-diaminobenzidine)試劑盒 福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司;考馬斯亮藍(lán)試劑盒 南京建成生物工程研究所;氯化鎘(CdCl2(2.5H2O) 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV-2600型紫外可見光分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;Spectra Max M5型酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司;EL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Biofuge Primo R型冷凍離心機(jī) Kendro 公司;Hitachi 850型熒光分光光度計 日立公司;Mini-Protein Tetra Cell型電泳儀、Gel DocTM XR+凝膠成像系統(tǒng) Bio Rad公司;Scientz-10N型冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肝細(xì)胞線粒體的制備 實(shí)驗(yàn)用大鼠在濕度(60%±5%)、溫度(20±2) ℃和12 h光照/12 h黑暗周期的標(biāo)準(zhǔn)條件下自由攝食和飲水,喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12 h,禁水4 h,腹主動脈放血處死,取肝臟,在預(yù)冷的分離液(包括225 mmol/L甘露醇,75 mmol/L蔗糖,0.05 mmol/L EDTA,10 mmol/L Tris-HCl,pH7.4)中剪碎,洗凈,冰浴勻漿,600×g離心5 min,取上清液,8800×g,4 ℃離心10 min,棄上清液,沉淀用4 ℃分離液洗3次,所得沉淀即為純化的線粒體[10]。

1.2.2 線粒體蛋白濃度測定 用考馬氏亮藍(lán)法[10]測定線粒體蛋白濃度。取100 mg考馬氏亮藍(lán)G-250溶于50 mL 95%乙醇中,加入100 mL 85%磷酸并加水至1000 mL配成染色液。配制10～100 mg/L牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液,取0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)液或待測蛋白濃度的樣品溶液,加5 mL染色液,均勻混合,在595 nm處測定吸光值,制作蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.0236+0.0077x,R2=0.992),計算樣品溶液的蛋白濃度(g/L)。

1.2.3 線粒體腫脹試驗(yàn) 線粒體腫脹程度根據(jù)線粒體懸液在波長為540 nm處的吸光值測定[10]。制備的肝細(xì)胞線粒體按1.0 g/L重懸于線粒體懸液(125 mmol/L蔗糖,50 mmol/L KCl,2 mmol/L KH2PO4,5 mmol/L琥珀酸,5 μmol/L魚藤酮,10 mmol/L Hepes,pH7.4),線粒體懸液分為5組:對照組、25、50、100 μmol/L AA組、RR組(陽性對照,終濃度為5 μmol/L)。對照組加入相同體積的線粒體緩沖液。30 ℃條件下孵育30 min后,各組均加入CdCl2,終濃度為10 μmol/L,加CdCl2后0～6 min記錄各樣品在波長為540 nm處吸光值的改變ΔA,ΔA值越大,表明線粒體腫脹度越高。以藥物對線粒體腫脹的抑制率作為評判藥物抗腫脹能力的指標(biāo),抑制率計算公式為:抑制率(%)=(ΔAControl-ΔADrug)/ΔAControl×100,ΔA=A0 min-A。

1.2.4 線粒體膜電位耗散的測定 按照Emaus法,使用熒光染料Rh123測定線粒體的膜電位[10]。測定時線粒體按0.5 g/L重懸于測定緩沖液(含225 mmol/L甘露醇,70 mmol/L蔗糖,5 mmol/L Hepes,pH7.2)中,按照1.2.3方法進(jìn)行線粒體分組和處理后,在25 ℃條件下分別與0.3 μmol/L Rh123共孵3 min后,加10 μmol/L CdCl2損傷后,記錄各組線粒體0～3 min熒光強(qiáng)度,測定時選用激發(fā)波長為505 nm,發(fā)射波長為534 nm。線粒體樣的熒光強(qiáng)度增加ΔF越多,表明線粒體膜電位耗散程度越高。以藥物對膜電位耗散的抑制率作為評判藥物抗膜電位耗散的指標(biāo),抑制率計算公式為:抑制率(%)=(ΔFControl-ΔFDrug)/ΔFControl×100,ΔF=F-F0 min。

1.2.5 線粒體內(nèi)游離鈣釋放的測定 用鈣離子熒光指示劑Fura-2/AM測定線粒體內(nèi)游離鈣的濃度[10]。測定時線粒體按0.5 g/L懸浮在測定緩沖液(包括125 mmol/L蔗糖,65 mmol/L KCl,5 mmol/L Hepes,1 μmol/L Fura-2/AM,pH7.4)中,在30 ℃恒溫下孵育30 min,負(fù)載Fura-2/AM的各組線粒體懸液,作相應(yīng)的藥物處理(同1.2.3)。在激發(fā)波長為340 nm,發(fā)射波長為510 nm條件下,記錄各組線粒體加CdC12后0～3 min的熒光強(qiáng)度值。以線粒體懸液熒光強(qiáng)度的改變ΔF作為線粒體游離鈣釋放的指標(biāo),藥物對線粒體游離鈣釋放的抑制率計算公式為:抑制率(%)=(ΔFControl-ΔFDrug)/ΔFControl×100,ΔF=F-F0 min。

1.2.6 Western blot方法檢測線粒體Cyt c和AIF釋放水平 參考1.2.3方法進(jìn)行線粒體分組和處理,此5組線粒體加CdC12損傷6 min,另以對照組不作損傷處理為空白對照,收集6組線粒體上清液(凍干濃縮5倍),SDS瓊脂糖凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,振蕩封閉3 h。用兔抗大鼠Cyt c抗體(1∶100稀釋)和小鼠抗大鼠AIF抗體(1∶200稀釋)孵育過夜。次日洗膜后,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(1∶200稀釋)和羊抗小鼠AIF抗體(1∶500稀釋)振蕩孵育2 h。洗膜,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)方法顯色,凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行定量分析,以灰度值反映Cyt c和AIF的釋放水平[11]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)(n=3),使用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),p<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 對Cd2+誘發(fā)的線粒體腫脹的影響

由圖1看出,對照組肝臟線粒體中加入10 μmol/L CdCl20～6 min,線粒體懸液540 nm處吸光值不斷下降表明引起了肝細(xì)胞線粒體明顯的腫脹,而不同濃度AA均可以不同程度地對抗Cd2+引起的吸光值顯著下降(p<0.05),表明AA能有效抑制線粒體腫脹,50、100 μmol/L AA對加Cd2+6 min誘發(fā)的線粒體腫脹的抑制率分別為42.1%和49.5%,高于25 μmol/L AA的抑制率(18.4%)(p<0.01)。

圖1 AA對Cd2+誘發(fā)線粒體腫脹的影響Fig.1 Effects of AA on Cd2+-induced mitochondrail swelling

2.2 對Cd2+誘發(fā)的線粒體膜電位耗散的影響

AA對鈣誘導(dǎo)的線粒體膜電位耗散的影響見圖2。在正常肝細(xì)胞線粒體中加入10 μmol/L CdC123 min后,發(fā)現(xiàn)線粒體懸液中熒光強(qiáng)度升高了45.9%,表明Cd2+的加入引起儲存在線粒體內(nèi)的膜電位特異性熒光探針Rh123的釋放,即誘發(fā)了線粒體膜電位的耗散。若在加Cd2+誘發(fā)膜電位下降之前將線粒體預(yù)先與一定濃度AA共孵一段時間,則可檢測到,與未經(jīng)AA處理的線粒體相比,其熒光強(qiáng)度的升高受到不同程度抑制,即膜電位耗散受到抑制。25、50和100 μmol/L AA對CdC12作用3 min引起的線粒體膜電位耗散的抑制率分別為21.7%、26.1%及41.9%(圖2),其中,100 μmol/L AA的抑制率高于25和50 μmol/L AA(p<0.01)。

圖2 AA對Cd2+誘發(fā)線粒體膜電位耗散的影響Fig.2 Effects of AA on Cd2+-induced dissipation of mitochondrial membrane potential

2.3 對Cd2+誘導(dǎo)的線粒體游離鈣釋放的影響

運(yùn)用熒光染料Fura-2/AM檢測線粒體內(nèi)游離鈣的釋放,結(jié)果見圖3。由圖3可見,10 μmol/L Cd2+能引起線粒體懸液的熒光強(qiáng)度的明顯降低(37.0%),表明Cd2+造成了線粒體內(nèi)游離鈣的釋放。而AA預(yù)處理可以一定程度上阻斷上述過程。25、50和100 μmol/L AA對Cd2+作用3 min誘發(fā)的肝臟線粒體游離鈣釋放的抑制率分別為27.8%、43.3%及47.9%。

圖3 AA對Cd2+誘發(fā)線粒體Ca2+釋放的影響Fig.3 Effect of AA on intra-mitochondrial free Ca2+ release induced by Cd2+

2.4 對Cd2+誘導(dǎo)的線粒體Cyt c和AIF釋放的影響

由圖4可見,空白對照組上清液未檢測到AIF和Cyt c。由表1可知,與空白對照組相比,CdC12損傷組、各劑量AA及陽性對照RR組均出現(xiàn)AIF和Cyt c的釋放;與CdC12組相比,各劑量AA組AIF和Cyt c釋放均極顯著減少(p<0.01)。表明各劑量AA處理能極顯著對抗Cd2+誘導(dǎo)的線粒體Cyt c和AIF釋放(p<0.01)。進(jìn)一步比較可知,50和100 μmol/L AA組Cyt c釋放水平極顯著低于25 μmol/L AA組(p<0.01);50 μmol/L AA組與100 μmol/L AA組相比無顯著性差異;而25、50和100 μmol/L AA 3組的AIF釋放水平無顯著性差異。

圖4 AA對Cd2+誘發(fā)的線粒體Cyt c(A) 和AIF(B)釋放的影響Fig.4 Effects of AA on mitochondrial Cyt c and AIF releases induced by Cd2+注:S代表線粒體上清液;P代表線粒體沉淀; N代表線粒體空白對照;AAL、AAM、AAH 分別代表25、50、100 μmol/L AA。

表1 各組線粒體Cyt c和AIF釋放水平Table 1 Release levels of mitochondrial Cyt c and AIF

3 討論與結(jié)論

大量證據(jù)表明,線粒體在調(diào)控細(xì)胞生存和死亡中起著決定性作用,在細(xì)胞凋亡或壞死時，線粒體發(fā)生的一系列形態(tài)和功能改變中,尤以線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(PTP)的高通透性開放最為關(guān)鍵[13-14]。PTP為位于線粒體內(nèi)外膜之間的孔道蛋白復(fù)合體,主要由外膜電壓依賴性陰離子通道蛋白(VDAC)、內(nèi)膜腺苷酸轉(zhuǎn)位酶(ANT)和基質(zhì)的親環(huán)蛋白D組成。在病理?xiàng)l件下,自由基、高Ca2+等作用于線粒體PTP,PTP呈高通透性開放狀態(tài),引發(fā)線粒體高通透性轉(zhuǎn)運(yùn)過程(MPT)。此時,線粒體允許分子量大于1.5 kDa的物質(zhì)自由進(jìn)出,引起線粒體基質(zhì)滲透不平衡,引發(fā)線粒體膜電位下降、線粒體腫脹,同時還伴隨著線粒體內(nèi)的游離鈣釋放,細(xì)胞色素c、凋亡誘導(dǎo)因子等流入胞漿,進(jìn)一步誘發(fā)細(xì)胞凋亡或壞死[10,17]。而Cd2+可與線粒體內(nèi)膜ANT的巰基結(jié)合,使得鄰近的2個還原性的-SH 形成共價二硫鍵,線粒體內(nèi)膜通透性顯著增加,引起PTP開放,引發(fā)上述線粒體MPT過程,導(dǎo)致細(xì)胞死亡[8,15-16]。

潘小海[12]比較Cd2+和Ca2+誘導(dǎo)的肝臟線粒體MPT效應(yīng),發(fā)現(xiàn)肝臟線粒體對鎘損傷更為敏感,Cd2+造成的線粒體腫脹效應(yīng)大于Ca2+造成的腫脹效應(yīng),分析其原因可能是Cd2+不但包括Ca2+引起線粒體PTP開放途徑,還有其他離子通道以及線粒體膜的結(jié)構(gòu)破壞等因素參與引起線粒體腫脹效應(yīng)。課題組前期研究表明,積雪草酸具有顯著對抗肝損傷作用[18-19],其護(hù)肝作用可能與其線粒體活性調(diào)節(jié)有關(guān)[9-10]。本研究建立鎘誘發(fā)的肝細(xì)胞線粒體MPT模型,探討AA對鎘誘發(fā)的肝細(xì)胞線粒體損傷的防護(hù)作用及其機(jī)制。結(jié)果表明,10 μmol/L Cd2+即可引起正常大鼠肝細(xì)胞線粒體產(chǎn)生明顯腫脹、誘發(fā)線粒體膜電位耗散以及游離鈣的釋放,提示肝臟線粒體對鎘損傷比對鈣損傷更為敏感,這與前人相關(guān)研究結(jié)果相一致[12],同時,線粒體上清液出現(xiàn)Cyt c和AIF的釋放,而25、50和100 μmol/L AA均能顯著抑制Cyt c的釋放水平(p<0.01),但對AIF釋放水平的抑制作用不明顯(p>0.05),并且隨著劑量增大,抑制作用呈增強(qiáng)的趨勢,100 μmol/L AA對Cd2+誘導(dǎo)的線粒體腫脹、膜電位耗散、游離鈣的釋放、線粒體Cyt c和AIF的釋放的抑制率分別為:49.5%、41.9%、47.9%、62.2%和66.3%,表明AA能通過抑制肝細(xì)胞線粒體MPT過程,有效對抗Cd2+引起的線粒體損傷。

綜上所述,AA可有效對抗Cd2+誘發(fā)的肝細(xì)胞線粒體損傷,其對肝細(xì)胞的保護(hù)作用與其抑制線粒體MPT過程、調(diào)節(jié)線粒體活性有關(guān)。該研究結(jié)果為揭示鎘誘發(fā)的肝毒性機(jī)制以及AA的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。