李洪波,李 金,張?zhí)扃?李紅娟,于景華

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(Transglutaminase,TGase,EC 2.3.2.13)是一種催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的酶,它能通過谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基(氨基受體)和賴氨酸殘基的ε-氨基或其它伯胺基(氨基供體)之間的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)形成ε-(γ-谷氨基)賴氨酸異肽鍵,從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子內(nèi)、分子間的交聯(lián)[1]。TGase的交聯(lián)作用可以改善蛋白質(zhì)的理化性質(zhì),進(jìn)而影響其功能特性。TGase在食品、生物醫(yī)學(xué)、紡織等方面有著廣闊的應(yīng)用前景,其中食品行業(yè)的應(yīng)用最受關(guān)注,這也進(jìn)一步增加了對(duì)廉價(jià)、有效和安全TGase的需求[2-3]。根據(jù)其來源不同,谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶大致分為以下三類:動(dòng)物來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶、植物來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶和微生物來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(MTG)。動(dòng)物來源TGase的研究最早、最為深入,從動(dòng)物組織(如豚鼠)肝臟中提取出來的TGase熱穩(wěn)定性差,不適宜較高溫度的生產(chǎn);同時(shí)具有Ca2+依賴性,容易產(chǎn)生色素堆積,影響外觀,從而限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。MTG屬于胞外酶,可直接分泌到培養(yǎng)基中,分離純化較動(dòng)植物來源的TGase容易,并且微生物發(fā)酵原料廉價(jià)、產(chǎn)酶周期短[4],MTG的催化活性不依賴Ca2+,底物特異性低,受到研究者的青睞。目前,MTG是商業(yè)酶的主要來源。植物來源TGase的研究較少,目前主要集中在不同植物來源TGase的理化特性及其在植物中的分布和功能。該酶的分離純化困難,產(chǎn)量較低,所以對(duì)其進(jìn)行微生物異源表達(dá)以提高產(chǎn)量,從而進(jìn)行催化性質(zhì)及應(yīng)用性質(zhì)的研究。

1 植物來源TGase的研究歷程

1987年,Iceckson和Apelbaum[5]通過對(duì)轉(zhuǎn)氨酶活性分析發(fā)現(xiàn)豌豆頂芽分生組織中的轉(zhuǎn)氨酶活性,并利用動(dòng)物來源TGase作為抗體首次證實(shí)了該酶為TGase。隨后研究者陸續(xù)對(duì)擬南芥、紫苜蓿、甜菜、向日葵、大豆和玉米等低等或高等植物組織中的TGase進(jìn)行了研究。1991年Kuehn等[6]在苜蓿的花芽細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了TGase活性。同年Signorini等[7]在甜菜葉子中檢測(cè)到TGase的存在。1994年,Del等[8]在向日葵的葉綠體中發(fā)現(xiàn)不同分子量的TGase。1996年,Kang等[9]在大豆的葉和幼苗中檢測(cè)到分子量為80 kDa的TGase。1999年,Bernet等[10]在玉米愈傷組織和葉綠體中檢測(cè)到黏玉米來源TGase(TGZ)的存在。隨后,利用純化的葉綠體TGZ制備了多克隆抗體,檢測(cè)了TGZ在不同玉米細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。研究表明,在成熟的葉子中,該酶主要分布在接受光照的葉肉組織細(xì)胞的葉綠體類囊體中,并分散到葉綠體的維管束鞘細(xì)胞,并且該酶的活性受光照影響[11]。隨后在多種低等和高等植物的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞壁、葉綠體和線粒體中發(fā)現(xiàn)了TGase的存在,并發(fā)現(xiàn)其參與植物組織中的能量轉(zhuǎn)移及細(xì)胞骨架的形成等多種生理活動(dòng)。對(duì)其性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn),植物來源TGase與動(dòng)物來源TGase有相同的免疫原性和相似的反應(yīng)最適pH,但是對(duì)Ca2+依賴性因物種而異[12]。目前,對(duì)植物來源TGase的功能性質(zhì)、催化機(jī)制及在乳制品和其它食品蛋白改性等方面的研究未見報(bào)道。

2 TGase在各植物中的分布及功能特性

2.1 植物TGase的生化特性

植物來源TGase在理化性質(zhì)、分子量大小及交聯(lián)活性等方面與其它來源TGase有很大不同,表1[6-9,13-22]總結(jié)了高等植物和藻類中TGase的分布及其生化特性。

表1 高等植物和藻類中谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的分布及其生化特征Table 1 Distribution and biochemical characteristics of TGase in higher plants and algae

對(duì)植物來源TGase粗提物的研究表明,TGase的活性不需要Ca2+的激活[7,20]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)植物來源TGase對(duì)Ca2+的依賴性因物種而異,低濃度Ca2+對(duì)其有促進(jìn)作用,而高濃度Ca2+對(duì)其有抑制作用。對(duì)豌豆根部和葉子中TGase的研究表明,Ca2+濃度影響TGase的交聯(lián),同時(shí)其活性受到乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)的抑制,表明其有Ca2+依賴性[12]。Ca2+的添加有助于玉米TGase的折疊,從而恢復(fù)其功能結(jié)構(gòu);當(dāng)Ca2+的濃度達(dá)到0.6 mmol/L,玉米TGase的活性最高[13-14,23]。在梨花粉管細(xì)胞溶質(zhì)中,TGase在與肌動(dòng)蛋白結(jié)合時(shí)顯示出Ca2+依賴性[24]。γ-谷氨酰衍生物的生物化學(xué)分析顯示AtPng1p基因通過牛血清白蛋白的聚合檢測(cè),產(chǎn)物具有Ca2+和鳥苷三磷酸(GTP)依賴性的轉(zhuǎn)酰胺酶活性[13]。

植物源TGase的分子量大小不一,同一種植物不同組織中TGase的分子量也不盡相同。目前報(bào)道分子量最小的為煙草花冠中的TGase,大小為38 kDa[18-19];在擬南芥中,已經(jīng)在膜片段中檢測(cè)到86 kDa的蛋白質(zhì),而在可溶性樣品中檢測(cè)到48至73 kDa的數(shù)個(gè)條帶[13-14];在苜蓿的花芽中發(fā)現(xiàn)了39 kDa的TGase[6];萊茵衣藻則分泌細(xì)胞外72 kDa的TGase[20];在光照條件下體外培養(yǎng)的向日葵枝條組織中[8]觀察到58 kDa的蛋白質(zhì)條帶,而向日葵葉綠體中TGase的分子量則高達(dá)150 kDa[12]。

高等植物細(xì)胞內(nèi)TGase的最適反應(yīng)pH與動(dòng)物來源TGase相似,在7.5～8.5,這可能與植物光合作用引起的pH變化和氧化還原反應(yīng)有關(guān)。但是細(xì)胞壁中TGase的最適反應(yīng)pH呈中性或偏酸性,這可能與其分布和功能相關(guān)。巰基改性試劑的抑制作用表明植物來源TGase含有巰基基團(tuán)。還原劑二硫蘇糖醇可以增加大豆葉子、擬南芥中TGase的活性,但對(duì)其它植物提取物中的TGase有抑制作用[12]。

2.2 植物TGase的分布及功能特性

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶是所有植物器官和細(xì)胞室中普遍存在的酶。它們催化多胺與不同蛋白質(zhì)靶標(biāo)(如細(xì)胞骨架)的翻譯后綴合。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),TGase廣泛分布于植物葉子、塊莖、花蕾、根部等組織和器官中,在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著重要作用[25]。

細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞壁中的TGase在細(xì)胞骨架重排、維持細(xì)胞壁肽聚糖的完整性、細(xì)胞間的粘附和細(xì)胞遷移過程中起著主要作用。它能通過細(xì)胞骨架的重排、細(xì)胞壁的擴(kuò)張及改變種子中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來促進(jìn)花粉管和幼苗的快速生長(zhǎng)[26]。如在梨花粉管中,細(xì)胞質(zhì)TGase可能參與到伯胺與谷氨酰胺殘基的結(jié)合,而細(xì)胞壁相關(guān)的TGase酶被認(rèn)為調(diào)節(jié)花粉管生長(zhǎng)[25]。TGase也分泌在細(xì)胞外基質(zhì)中,參與花粉管細(xì)胞壁的組裝和加固。在花粉受精期間,花粉管與細(xì)胞外基質(zhì)之間相互作用時(shí)TGase活性不明顯,但是在自交不親和反應(yīng)期間,該酶的活性增強(qiáng),進(jìn)而導(dǎo)致形成交聯(lián)產(chǎn)物(包括微管蛋白和肌動(dòng)蛋白的聚集體)[26]。因此,TGase被認(rèn)為是細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)的調(diào)節(jié)劑。TGase也存在于植物的葉綠體和線粒體等亞細(xì)胞室中,保護(hù)和穩(wěn)定二磷酸核酮糖羧化酶和光合體系中天線復(fù)合體的脫輔基蛋白,從而影響二磷酸核酮糖羧化酶的催化活性和能量轉(zhuǎn)移效率[27]。在細(xì)胞溶質(zhì)中,TGase修飾細(xì)胞骨架蛋白,初步研究表明參與細(xì)胞壁的構(gòu)建,而且似乎還與受精,非生物和生物脅迫,衰老和程序性細(xì)胞死亡以及過敏反應(yīng)有關(guān)[28]。

3 植物源TGase的分離純化及異源表達(dá)

植物來源TGase的分離純化工藝復(fù)雜,同時(shí)數(shù)據(jù)庫中缺少相應(yīng)的氨基酸和基因序列信息,這些共同阻礙了植物來源TGase的研究。目前已獲得擬南芥、黏玉米、菊芋、稻子、梨及蘋果TGase的基因序列,研究發(fā)現(xiàn)菊芋TGase序列與稻子和擬南芥有較高的同源性,而梨TGase序列與擬南芥僅有76%的同源性,與蘋果的同源性確高達(dá)99%[12]。

研究者已陸續(xù)將擬南芥和黏玉米TGase進(jìn)行異源表達(dá)。大腸桿菌E.coli表達(dá)系統(tǒng)是細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)的代表,自上世紀(jì)70年代以來,E.coli一直是基因工程中應(yīng)用最為廣泛的表達(dá)系統(tǒng)。與其它系統(tǒng)相比,E.coli表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚,操作簡(jiǎn)便,可以大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)[29]。Della等[13]首次將擬南芥中編碼TGase的基因AtPng1p在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),并通過動(dòng)物TGase抗體對(duì)重組蛋白進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)到86 kDa大小的TGase。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),該酶含有一個(gè)催化三聯(lián)體Cys-His-Asp,其中半胱氨酸殘基是活性中心的主要親核體。對(duì)其性質(zhì)研究表明,該重組酶具有Ca2+依賴性和GTP依賴性,可以催化腐胺、精胺、尸胺等底物。Villalobos等[24]在黏玉米愈傷組織和葉綠體中檢測(cè)到TGase的活性,并通過多克隆抗體的制備對(duì)其進(jìn)行定位,發(fā)現(xiàn)其主要存在于葉綠體類囊體中,并分散到葉綠體的維管束鞘細(xì)胞。2004年Villalobos等[30]通過分子克隆從黏玉米葉綠體中分離出兩個(gè)TGase基因,TGZ15和TGZ21,Northern印跡分析顯示,TGase的表達(dá)主要發(fā)生在幼葉和分化的玉米愈傷組織中,且表達(dá)量受光照時(shí)間的影響。同時(shí),使用兩種酶活測(cè)定法在過表達(dá)的細(xì)菌提取物中檢測(cè)到這兩種TGase的活性;2007年通過免疫定位TGZ和酶底物捕光復(fù)合物L(fēng)HCII確定植物TGZ存在的位置,并進(jìn)一步證明該酶是光依賴型。兩個(gè)編碼TGZ的cDNA,TGZ15和TGZ21克隆至pET28載體,并在大腸桿菌中表達(dá),免疫分析表明,該酶以包涵體形式存在[31]。2010年Carvajal等[23]使用TritonX-100作為非變性洗滌劑將TGZ包涵復(fù)性,該過程不需要重折疊,同時(shí)復(fù)性后TGZ的活性與重折疊TGZ的活性相似,表明這是一種更有價(jià)值的快速獲得活性TGZ的方法。2014年,本課題組將含有TGZ基因的重組ArcticExpressE.coli菌株,于37 ℃在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600約為0.4時(shí),加入0.2 mmol/L的IPTG,于16 ℃低溫誘導(dǎo)16 h后獲得TGZ的最大表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)后,用8 mol/L尿素溶解包涵體,復(fù)性后用親和層析法進(jìn)行分離純化,純化后TGZ活性為0.34 U/mg,產(chǎn)量達(dá)到1.41 mg/L[32]。由于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)真核蛋白時(shí)翻譯后修飾不足,可能導(dǎo)致包涵體的形成、蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊和非功能性蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。作為真核表達(dá)系統(tǒng),巴斯德畢赤酵母具有許多優(yōu)點(diǎn),如簡(jiǎn)單的遺傳操作,翻譯后修飾和容易放大的發(fā)酵,使得人們將目光轉(zhuǎn)向了特性優(yōu)良的巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)。目前,已有多種蛋白質(zhì)在巴斯德畢赤酵母中成功表達(dá)。

為了獲得可溶性的活性TGZ,本課題組根據(jù)巴斯德畢赤酵母密碼子的偏好性優(yōu)化黏玉米TGase基因序列,并用重疊區(qū)擴(kuò)增基因拼接法(SOEing-PCR)合成該基因。隨后,比較了TGZ和優(yōu)化后TGZ(TGZo)在畢赤酵母中的表達(dá)情況:將兩種重組載體單酶切后通過電擊轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)表型、G418 抗性及菌落PCR法篩選出His+Mut+表型的高拷貝重組菌株G-tgz和G-tgzo。將兩種重組菌株分別進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá),其中G-tgz通過凝膠過濾層析和離子交換樹脂進(jìn)行分離純化,純化后TGZ的比活達(dá)到0.32 U/mg,產(chǎn)量達(dá)到 1.44 mg/L。G-tgzo則通過親和層析法進(jìn)行分離純化,純化后TGZo的比活達(dá)到 0.89 U/mg,產(chǎn)量達(dá)到4.4 mg/L[33-34]。結(jié)果表明,優(yōu)化后的基因通過電擊轉(zhuǎn)化，成功的整合到畢赤酵母GS115的基因組中。通過對(duì)重組菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化,最終優(yōu)化后TGase(TGZo)產(chǎn)量為4.4 mg/L,活性為0.889 U/mg[35]。但是重組TGZ的產(chǎn)量和活性均低于MTG,因此尋找更加有效的表達(dá)方法和增強(qiáng)重組TGase活性都有待進(jìn)一步研究。

4 展望

目前,TGase在世界范圍內(nèi)的食品加工中作為食品加工基料的需求與日俱增,TGase的應(yīng)用范圍也將持續(xù)增加。但是對(duì)植物來源TGase的功能性質(zhì)、催化機(jī)制及在食品蛋白改性等方面的研究未見報(bào)道。鑒于植物TGase分離純化困難、產(chǎn)率低的缺點(diǎn),將其進(jìn)行異源表達(dá)是解決這一問題的有效途徑。獲得高產(chǎn)的工業(yè)化應(yīng)用菌株成為植物來源TGase能夠大規(guī)模生產(chǎn)的關(guān)鍵性前提。綜觀TGZ的發(fā)展史,應(yīng)在加大對(duì)植物來源TGase以應(yīng)用為研究目標(biāo)的同時(shí),把獲得高產(chǎn)菌株作為主要出發(fā)點(diǎn),積極探索以食品級(jí)微生物作為表達(dá)系統(tǒng),表達(dá)異源蛋白;同時(shí)利用定點(diǎn)突變等基因工程或其他新興技術(shù)改造植物源TGase,提高酶催化性質(zhì),延長(zhǎng)酶的穩(wěn)定性是今后研究的重點(diǎn)和方向。