劉秋鳴,李 笑,肖俊江,孫麗平

(昆明理工大學(xué)云南省食品安全研究院,云南昆明 650500)

黃皮疣柄牛肝菌(Leccinellumcrocipodium),又稱黃癩頭,屬真菌界(Fungi),擔(dān)子菌門(Basidiomycota),傘菌綱(Agaricomycetes),牛肝菌目(Boletales),牛肝菌科(Boletaceae),疣柄牛肝菌屬(Leccinellum),在松、落葉櫟類林地上群生或單生,屬于外生菌根菌[1]。在我國江蘇、安徽、福建、貴州、臺灣等地均有分布,在云南省,常見于除西雙版納等熱帶地區(qū)之外的市場[2]。

黃皮疣柄牛肝菌味道鮮美、營養(yǎng)豐富,含蛋白質(zhì)、總糖、脂肪、氨基酸等營養(yǎng)成分及多種礦質(zhì)元素[3-4]。食用菌多酚被發(fā)現(xiàn)具有一定抗氧化活性[5]。王婷婷等[6]研究了黃皮疣柄牛肝菌、馬勃菌、黑牛肝菌、雞樅4種野生菌的多酚含量及活性,發(fā)現(xiàn)黃皮疣柄牛肝菌中多酚含量最高,抗氧化活性最好。劉雨陽等[7]研究發(fā)現(xiàn)黃皮疣柄牛肝菌多酚提取物對Caco-2結(jié)腸癌細(xì)胞具有一定程度的抑制作用。

本研究采集了云南省主要產(chǎn)區(qū)25個位點(diǎn)的黃皮疣柄牛肝菌樣本,測定了子實(shí)體的基本營養(yǎng)成分,分析了子實(shí)體多酚粗提物中多酚含量與其DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力、鐵離子還原能力和金屬螯合能力的相關(guān)性,探討了云南各產(chǎn)地的黃皮疣柄牛肝菌子實(shí)體的營養(yǎng)性與功能性。本研究采樣范圍廣,研究結(jié)果具有一定代表性,能為消費(fèi)者、食品制造商以及食品研究人員提供科學(xué)信息,為黃皮疣柄牛肝菌的綜合利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃皮疣柄牛肝菌 采集時間和地點(diǎn)如表1所示,樣品采集當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室,削除表面不可食部分,先后用流動水和超純水清洗,冷凍干燥,研磨粉碎,過40目絹篩,于棕色抽真空的干燥器中儲存,待測;1,1-二苯-1-苦基苯肼自由基(DPPH·)、2,2-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、Fe3+-三吡啶三吖嗪(TPTZ)、6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸(Trolox)、EDTA、Ferrozine(菲洛嗪) 美國Sigma公司;其它試劑 均為分析純。

表1 樣品采集地點(diǎn)和時間Table 1 Collecting location and time of sample

Alpha 1-2/LD型冷凍干燥機(jī) 德國CHRIST;DL-5-B型低速大容量多管離心機(jī)、TGL-20B型高速臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;UV-6100型紫外可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司;SB5200D型超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;HH-2型恒溫水浴鍋 金壇市瑞爾電器有限公司;SX-4-10型馬弗爐 長沙市華光電爐廠;SZF-06A型脂肪測定儀 上海新嘉電子有限公司;DHG9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基本營養(yǎng)成分測定 粗蛋白含量測定依據(jù)GB 5009.5-2010,采用凱氏定氮法。粗脂肪含量測定依據(jù)GB/T 5009.6-2003,采用索氏抽提法。粗灰分含量測定依據(jù)GB 5009.4-2010,采用灼燒法?？扇苄钥偺呛繙y定采用苯酚硫酸法。以上結(jié)果均表達(dá)為%干重(DW)。

1.2.2 多酚提取 準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品于50 mL離心管中,加入15 mL 70%甲醇,連續(xù)超聲輔助提取1 h,輸出功率200 W。5000 r/min離心10 min,收集上清液。向沉淀中加入10 mL 70%甲醇重復(fù)提取步驟,合并上清液,并用70%甲醇定容至25 mL,得樣品多酚粗提液,儲存于4 ℃待測。

1.2.3 多酚含量測定 采用Folin-Ciocalteu比色法[8]測定多酚含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:準(zhǔn)確吸取0.5 mL 0、20、40、60、80、100 μg/mL沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)工作液于10 mL連蓋離心管中,加2.5 mL 10%福林酚試劑,搖勻,靜置5 min,加2.0 mL 7.5%碳酸鈉溶液,搖勻,室溫下避光反應(yīng)60 min,于765 nm下測定吸光值,以吸光值和標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為坐標(biāo)建立曲線。以0.5 mL多酚粗提液代替沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)工作液,按照上述方法測定吸光值,計算黃皮疣柄牛肝菌多酚含量,結(jié)果表達(dá)為mg沒食子酸當(dāng)量/g干樣(mg GAE/g DW)。

1.2.4 DPPH·清除能力測定 0.1 mmol/L DPPH·甲醇溶液配制:精確稱取DPPH 0.1972 g,溶于甲醇,定容至500 mL,配制成1 mmol/L DPPH甲醇母液,取DPPH甲醇母液用甲醇稀釋10倍即得0.1 mmol/L DPPH·甲醇溶液。

DPPH·清除能力測定采用文獻(xiàn)[9]的方法。取0.4 mL粗多酚提取液,加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH·甲醇溶液,混勻,室溫避光反應(yīng)30 min,于517 nm下測定吸光值。Trolox作陽性對照,以20～100 μmol/L濃度的Trolox DPPH·清除能力做標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品DPPH·清除能力結(jié)果表示為Trolox當(dāng)量(μmole TE/g DW)。

1.2.5 ABTS+·清除能力測定 ABTS+·清除能力參考文獻(xiàn)[10]方法測定,稍作修改。取5 mL 7 mmol/L的ABTS溶液與88 μL過硫酸鉀(40 mmol/L)的混合,于室溫黑暗中放置12 h,制備ABTS+·儲備液。該儲備液用70%乙醇稀釋至734 nm下吸光值為0.70±0.02,得ABTS+·工作液。取4 mL ABTS+·工作液與0.5 mL多酚粗提液混合,于30 ℃水浴條件下反應(yīng)6 min,于734 nm下測定吸光值。70%甲醇代替樣品做空白對照。Trolox作陽性對照,以20～100 μmol/L濃度的Trolox ABTS+·清除能力做標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品ABTS+·清除能力測定結(jié)果表示為Trolox當(dāng)量(μmole TE/g DW)。

1.2.6 鐵離子還原能力(FRAP)測定 采用文獻(xiàn)[11]的方法,稍作修改。標(biāo)準(zhǔn)曲線:將0.3 mol/L的醋酸緩沖液(pH3.6)、10 mmol/L TPTZ和20 mmol/L FeCl3溶液按10∶1∶1的比例配制成FRAP工作液。取濃度0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L FeSO4·7H2O溶液各150 μL,分別加入4.5 mL FRAP試劑,混勻后37 ℃水浴條件下反應(yīng)10 min,測定593 nm處吸光值,以FeSO4·7H2O濃度和吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定:4.5 mL FRAP工作液與150 μL多酚粗提液混合,混勻后37 ℃水浴條件下反應(yīng)10 min,于593 nm處測定吸光值。70%甲醇代替樣品做空白對照。樣品鐵離子還原能力(FRAP值)以每100克干質(zhì)量樣品達(dá)到同樣吸光度所需FeSO4毫摩爾數(shù)表示(mmole Fe2+E/100 g)。

1.2.7 金屬螯合能力測定 Fe2+螯合能力測定參考文獻(xiàn)[9]方法測定。1 mL多酚粗提液與3.7 mL超純水混合,加入100 μL 2 mmol/L FeCl2,混合30 s,再加入200 μL 5 mmol/L菲洛嗪,混勻,室溫靜置10 min,于562 nm處測定吸光值。70%甲醇代替樣品做空白對照。EDTA做陽性對照,以0.034～0.171 mmol/L的EDTA Fe2+螯合能力做標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品Fe2+螯合能力測定結(jié)果表示為EDTA當(dāng)量(μmole EDTA E/g)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體基本成分和總酚含量

黃皮疣柄牛肝菌子實(shí)體的基本成分測定結(jié)果如表2所示。不同產(chǎn)地黃皮疣柄牛肝菌粗蛋白含量為24.54% DW±0.33% DW～37.25% DW±0.71% DW,29號樣品陸良的粗蛋白含量最高,為37.25% DW±0.71% DW,29個樣本粗蛋白含量均值為29.55%,高于野生菌中美味牛肝菌、銅色牛肝菌和網(wǎng)柄牛肝菌以及常見栽培食用菌中的平菇、金針菇等[12]食用菌子實(shí)體的粗蛋白含量。食用菌的總糖含量是其營養(yǎng)和質(zhì)量評價的重要指標(biāo)之一,包括水溶性多糖、寡糖和單糖。食用菌中的多糖具有比較復(fù)雜而全面的生理活性和功能[13-14]。本研究中不同產(chǎn)地黃皮疣柄牛肝菌子實(shí)體的可溶性總糖含量為7.03% DW±0.30% DW～19.03% DW±0.03% DW,低于一些常見食用菌[15]香菇(32.4%)、平菇(22.25%)、金針菇(47.89%)等。粗脂肪含量相對較低的5個樣本為寧洱(0.88% DW±0.37% DW)、花山3(1.30% DW±0.16% DW)、江川(1.51% DW±0.04% DW)、墨江(1.59% DW±0.06% DW)和峨山(1.67% DW±0.27% DW),其它24個樣本中脂肪含量為1.85% DW±0.12% DW～3.78%±0.03% DW,均值為2.83%,與梅文泉等[3]測定黃皮疣柄牛肝菌營養(yǎng)成分分析比較,脂肪含量略高。不同產(chǎn)地黃皮疣柄牛肝菌粗灰分含量4.31% DW±0.02% DW～7.07% DW±0.04% DW,低于Barros等[16]測定的幾種食用菌(7.07%～16.48%)。從表2可以看出,不同產(chǎn)地和采集時間的黃皮疣柄牛肝菌子實(shí)體的基本營養(yǎng)成分含量存在顯著性差異(p<0.05),這可能是因?yàn)樯L環(huán)境的不同,采集時間的差異,但總體上有高蛋白低脂肪、含有一定量可溶性總糖的特點(diǎn)。

表2 黃皮疣柄牛肝菌基本營養(yǎng)成分和總酚含量Table 2 Proximate composition and polyphenols contents of Leccinum crocipodium

真菌類食物可提供給人體具有多重生物活性的多酚類物質(zhì),多酚類物質(zhì)具有活潑的多羥基結(jié)構(gòu),從而具有較強(qiáng)的供電子能力,使其成為有效的抗氧化活性成分[17]。本研究提取黃皮疣柄牛肝菌總酚并測定其含量,結(jié)果如表2所示,不同產(chǎn)地黃皮疣柄牛肝菌總酚含量為(12.25±0.67)～(24.44±0.72) mg GAE/g DW,相對較高的6個樣本為宜良(24.44±0.72) mg GAE/g DW、陸良(23.83±0.06) mg GAE/g DW、峨山(23.61±0.69) mg GAE/g DW、硯山(20.27±0.14) mg GAE/g DW、建水(20.11±0.03) mg GAE/g DW和通海(20.08±0.42) mg GAE/g DW,最低為祿豐(12.25±0.67) mg GAE/g DW。本研究黃皮疣柄牛肝菌總酚含量略高于侯文井等[18]報道的美味牛肝菌、元蘑、榛蘑和黑木耳中總酚含量,說明黃皮疣柄牛肝菌是一種多酚含量豐富的野生食用菌。

2.2 粗多酚提取物的抗氧化性分析

DPPH·清除能力被廣泛用于評價多酚的抗氧化能力以及天然抗氧化劑的篩選。如表3所示,不同產(chǎn)地黃皮疣柄牛肝菌多酚粗提物都具有一定DPPH·清除能力。普洱(2.38±0.03) μmole TE/g、宜良(2.56±0.02) μmole TE/g、寧洱(2.58±0.01) μmole TE/g 3個樣本的DPPH·清除能力相對較低,其均值為2.51 μmole TE/g。其它26個樣本的DPPH·清除能力為(2.77±0.07)～(3.39±0.01) μmole TE/g,均值為3.20 μmole TE/g,高出相對較低的3個樣本均值(2.51 μmole TE/g)的127%?？寡趸瘎PPH自由基的清除作用是由于其供氫能力,蘑菇提取物的抗氧化活性可能是多酚類物質(zhì)中的羥基作用,蘑菇粗多酚可能是天然抗氧化劑的潛在來源。

表3 黃皮疣柄牛肝菌粗多酚提取物的抗氧化能力和金屬螯合能力Table 3 Antioxidant activities and metal chelating ability of Leccinum crocipodium

ABTS不僅是親水型化合物還是親脂型化合物,比較容易反應(yīng)。ABTS+·的清除是電子轉(zhuǎn)移過程,體系中的抗氧化劑與其反應(yīng)將會使溶液褪色,表現(xiàn)為吸光值的降低[19],從而反映出試樣抗氧化能力的大小。不同產(chǎn)地黃皮疣柄牛肝菌多酚粗提物都具有很好的ABTS+·清除能力,且存在顯著性差異(p<0.05)。ABTS+·清除能力范圍為(1.85±0.01)～(3.00±0.05) μmole TE/g,相對較高的5個樣本為花山4(3.00±0.05) μmole TE/g、東川(2.97±0.01) μmole TE/g、花山2(2.83±0.02) μmole TE/g、開遠(yuǎn)(2.77±0.01) μmole TE/g和丘北(2.76±0.01) μmole TE/g,均值為2.87 μmole TE/g,高出其它剩余24個地區(qū)均值(2.31 μmole TE/g)的124%。

FRAP還原能力為抗氧化劑將Fe3+還原為Fe2+,Fe2+與TPTZ結(jié)合生成藍(lán)色絡(luò)合物,該絡(luò)合物在波長593 nm處有最大吸收。吸光度越大,表明抗氧化劑的還原能力越強(qiáng),也就是有更高的抗氧化活性[20]。不同樣本黃皮疣柄牛肝菌多酚粗提物均表現(xiàn)較高的FRAP還原能力,相對較高的3個樣本為峨山、尋甸、花山4,其FRAP值分別(1.74±0.03)、(1.60±0.02)、(1.46±0.02) mmole Fe2+E/100 g,均值為1.6 mmole Fe2+E/100 g,相對較低的4個地區(qū)為寧洱(0.74±0.01 mmole Fe2+E/100 g)、石林(0.85±0.02 mmole Fe2+E/100 g)、沾益(0.90±0.00 mmole Fe2+E/100 g)和嵩明(0.95±0.03 mmole Fe2+E/100 g)。其它22個地區(qū)的FRAP還原能力為0.97～1.36 mmole Fe2+E/100 g,均值為1.06 mmole Fe2+E/100 g。FRAP還原能力相對較高的前3個地區(qū)的均值高出其它剩余22個地區(qū)均值的151%。

Ozgen等[21]研究認(rèn)為DPPH、ABTS和FRAP抗氧化評價模型簡單、穩(wěn)定、極易操作,反應(yīng)機(jī)制上,DPPH、ABTS和FRAP均評價了抗氧化物質(zhì)的單電子轉(zhuǎn)移能力,但是其反應(yīng)體系極性不同,為了綜合評價天然抗氧化物的抗氧化活性,需要多模型的抗氧化評價體系,DPPH、ABTS和FRAP三個體系的聯(lián)合應(yīng)用是合適的。

適量的鐵對于細(xì)胞功能有重要作用,例如氧運(yùn)輸、細(xì)胞呼吸和許多鐵金屬酶的輔因子,而過量的游離鐵會導(dǎo)致Fenton反應(yīng)產(chǎn)生活性氧物質(zhì)[22],因此金屬離子螯合可以一定程度上降低金屬離子的催化作用,避免自由基的生成,這也是一種評價試樣抗氧化性能常用的方法。不同樣本黃皮疣柄牛肝菌多酚粗提物具有很好的Fe2+螯合能力,且存在一定的顯著性差異(p<0.05),相對較高的為祿豐(3.29±0.03) μmole EDTA E/g、花山3(3.27±0.03) μmole EDTA E/g、江川(3.06±0.01) μmole EDTA E/g、峨山(3.04±0.00) μmole EDTA E/g、丘北(3.03±0.03) μmole EDTA E/g,這5個地區(qū)Fe2+螯合能力均值為3.14 μmole EDTA E/g,高出其它剩余22個地區(qū)均值(2.25 μmole EDTA E/g)的140%。

2.3 抗氧化活性與總酚含量相關(guān)性分析

DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力是基于分光光度法,通過測定樣品清除自由基的能力來表征其抗氧化能力。FRAP法反映的是樣品還原Fe3+的能力,MCA法則測定樣品螯合Fe2+的能力。植物抗氧化能力與其多酚、黃酮類、VC、VE和類胡蘿卜素等物質(zhì)含量有一定的相關(guān)性[23]。不同評價體系下黃皮疣柄牛肝菌抗氧化活性與總酚含量相關(guān)性分析如表4所示。總酚含量(TPC)與ABTS+·清除活性和FRAP還原能力在0.01水平下顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.275和0.287。表明,在ABTS+·清除活性和FRAP還原能力兩種抗氧化評價體系下,酚類化合物可能是黃皮疣柄牛肝菌表現(xiàn)抗氧化能力的重要因素之一。酚類化合物,如類黃酮、酚酸和縮合單寧通常被認(rèn)為是植物抗氧化能力的主要貢獻(xiàn)者[22]。同時,不同評價體系之間的相關(guān)性分析表明,DPPH·清除能力與FRAP還原能力和ABTS+·清除能力在0.01水平下顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.372和0.370。在0.05水平下,FRAP還原能力和ABTS+·清除能力成正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.263。不同評價體系之間的顯著相關(guān)性表明,抗氧化測定方法是可靠的。不同的抗氧化反應(yīng)體系適用于不同的氧化應(yīng)激反應(yīng)。因此,在測定物質(zhì)抗氧化能力時,可以根據(jù)需要采用多種方法來綜合評價其抗氧化活性。

表4 抗氧化活性與總酚含量相關(guān)性Table 4 Correlation between antioxidant activity and total phenol content

3 結(jié)論

本文初步探討了云南主要產(chǎn)區(qū)25個位點(diǎn)黃皮疣柄牛肝菌的基本營養(yǎng)成分和抗氧化活性。研究發(fā)現(xiàn)黃皮疣柄牛肝菌具有高蛋白低脂肪、富含多酚的特點(diǎn)。菌體多酚粗提物對DPPH·、ABTS+·具有很好的清除能力,對Fe3+具有良好的還原能力,且具有很好的Fe2+螯合能力。酚類化合物與抗氧化活性相關(guān)性分析表明其可能是黃皮疣柄牛肝菌抗氧化活性的重要因素之一。云南產(chǎn)黃皮疣柄牛肝菌不僅基本營養(yǎng)成分豐富,是良好的膳食來源,而且抗氧化活性較好。本研究向消費(fèi)者、營養(yǎng)學(xué)家和食品研究人員提供了關(guān)于黃皮疣柄牛肝菌體外抗氧化活性的新信息,為野生食用牛肝菌的資源利用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。